袁曉偉,史慧嫻,郭仰東,李興盛,孫西蘋

(1.華盛農(nóng)業(yè)集團(tuán)股份有限公司,青州 262500;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,北京 100193)

中國(guó)南瓜曲葉病毒(squash leaf curl China virus,SLCCNV)是世界范圍內(nèi)危害葫蘆科作物的一種重要病毒,屬于雙生病毒科Geminiviridae菜豆金黃花葉病毒屬Begomovirus,其基因組為雙組分,包含DNA-A和DNA-B基因組[1]。該病毒由煙粉虱Bemisiatabaci以持久、循回的方式傳播,不能經(jīng)機(jī)械摩擦或種子傳播[2]。受侵染的葫蘆科作物表現(xiàn)為植株矮小,葉片皺縮,葉邊緣向下卷曲,造成葫蘆科作物嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于SLCCNV的研究主要集中在基因組序列、編碼的蛋白組成及新寄主的發(fā)現(xiàn)等方面,2003年在印度首次發(fā)現(xiàn)SLCCNV-[Pumpkin:Coim]分離物引起南瓜葉片黃化、皺縮[4];同年在越南通過全基因組分析首次證實(shí)SLCCNV引起南瓜葉片黃化、植株矮小[5];2011年在印度瓦蠟納西地區(qū)首次證實(shí)SLCCNV引起西葫蘆花葉、葉片皺縮[6]。

在中國(guó)菜豆金黃花葉病毒屬病毒可以侵染南瓜、煙草及番茄等[7-9]。1994年我國(guó)首次報(bào)道了雙生病毒侵染南瓜,根據(jù)其外殼蛋白cp基因序列分析該病毒可能是SLCCNV[10],但SLCCNV侵染西葫蘆在國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道。2019年秋在山東省青州市設(shè)施栽培的西葫蘆大面積暴發(fā)病毒病,田間癥狀表現(xiàn)為植株矮化,葉片卷曲,損失慘重,發(fā)病西葫蘆種植大棚損失嚴(yán)重甚至造成絕產(chǎn)。經(jīng)過PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)并非西葫蘆常發(fā)的黃瓜花葉病毒(cucumber mosaic virus,CMV)、西瓜花葉病毒(watermelon mosaic virus,WMV)、小西葫蘆黃化花葉病毒(zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)所致。2020年春季,山東省青州市設(shè)施西葫蘆也同樣出現(xiàn)類似病毒病癥狀,病害的連年發(fā)生引起了我們的注意,我們懷疑是一種新的病毒侵染所致。因?yàn)橛^察田間癥狀與SLCCNV侵染南瓜的癥狀相似,因此我們對(duì)10份病樣進(jìn)行病葉采集和特異性引物的PCR擴(kuò)增,并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列分析比對(duì),以明確引起此次西葫蘆病毒病的病原。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料:在山東省青州市試驗(yàn)大棚內(nèi)從表現(xiàn)葉片皺縮、葉邊緣向下卷曲、矮化癥狀的西葫蘆植株上隨機(jī)采集10份新葉材料,以健康的西葫蘆新葉作陰性對(duì)照。

試劑:提取DNA的試劑購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

引物合成和基因測(cè)序均在生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1田間西葫蘆樣品的病毒檢測(cè)

采用CTAB方法提取葉片總DNA,具體步驟按照天根試劑盒說明書進(jìn)行(TIANGEN DP350-02)。

從GenBank中查找SLCCNV基因序列,設(shè)計(jì)引物SLCCNV-729AF/SLCCNV-729AR和SLCCNV-808BF/SLCCNV-808BR(表1),進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為20 μL:10×EasyTaqBuffer(Mg2+):2 μL,High Pure dNTPs:1.6 μL,EasyTaqDNA Polymerase(5 U/μL):0.2 μL,DNA:1 μL,10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL,補(bǔ)雙蒸水至20 μL。PCR擴(kuò)增條件:95℃ 3 min;95℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min,34個(gè)循環(huán);72℃ 5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后切膠回收送生工生物工程(上海)股份有限公司完成測(cè)序。為了進(jìn)一步證實(shí)該病毒,根據(jù)獲得的基因序列,依據(jù)SLCCNV基因組特征設(shè)計(jì)了引物SLCCNV-AF/SLCCNV-AR和SLCCNV-BF/SLCCNV-BR(表1),分別擴(kuò)增DNA-A和DNA-B全長(zhǎng)基因。

表1 擴(kuò)增中國(guó)南瓜曲葉病毒基因所用引物Table 1 Primers for amplifying squash leaf curl China virus gene

1.2.2系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

根據(jù)測(cè)序獲得的SLCCNV全長(zhǎng)基因序列,在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中利用BLAST進(jìn)行相似性搜索,進(jìn)一步用ClustalX進(jìn)行多重序列比對(duì),系統(tǒng)進(jìn)化樹分析采用MEGA 6.0的鄰接法(neighbor-joining,NJ),bootstrap為1 000[11]。

1.2.3致病性測(cè)定

從發(fā)生病毒病的西葫蘆葉片上取煙粉虱放入800目網(wǎng)兜,將裝有煙粉虱的網(wǎng)兜套在健康的西葫蘆幼苗上進(jìn)行病毒接種。每株健康的西葫蘆幼苗上放20頭可能攜帶病毒的煙粉虱,3 d后,使用殺蟲劑噻蟲嗪對(duì)煙粉虱進(jìn)行噴殺并取下網(wǎng)兜,西葫蘆幼苗正常管理2周后統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況,并用PCR檢測(cè)多頭混合的煙粉虱及接種后的西葫蘆植株。本試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù),共接種30株西葫蘆幼苗。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間癥狀觀察

田間西葫蘆不同生長(zhǎng)時(shí)期,感病的西葫蘆幼苗和成株均表現(xiàn)為幼嫩葉片黃化、葉邊緣向下嚴(yán)重卷曲現(xiàn)象,同時(shí)出現(xiàn)植株矮小(圖1)。

圖1 疑似感染中國(guó)南瓜曲葉病毒的西葫蘆在幼苗期(a)和初花期(b)的田間癥狀Fig.1 Field symptoms of zucchini plants suspected of being infected with squash leaf curl China virus at seeding stage (a) and early flowering stage (b)

2.2 疑似感染中國(guó)南瓜曲葉病毒西葫蘆的PCR檢測(cè)結(jié)果

利用引物SLCCNV-729AF/SLCCNV-729AR和SLCCNV-808BF/SLCCNV-808BR分別對(duì)田間采集的10份表現(xiàn)癥狀的西葫蘆葉片進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果均擴(kuò)增到了目的條帶,分別為729 bp和808 bp,而健康樣品未擴(kuò)增到目的條帶(圖2),經(jīng)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序發(fā)現(xiàn)DNA-A片段序列與已登錄的SLCCNV一致性范圍為90.27%～99.56%,其中與我國(guó)廣東的SLLCCNV-GDHY南瓜分離物(MW389917.1)一致性最高,為99.56%,DNA-B片段序列與已登錄的SLCCNV一致性范圍為81.04%～97.28%,其中與我國(guó)廣東的SLCCNV-GDHY南瓜分離物(MW389918.1)一致性最高,為97.28%。

圖2 西葫蘆樣品PCR檢測(cè)SLCCNV電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR detection of SLCCNV from zucchini samples

為了進(jìn)一步獲得SLCCNV(西葫蘆分離物)的全長(zhǎng)序列,我們?cè)O(shè)計(jì)了引物SLCCNV-AF/SLCCNV-AR和SLCCNV-BF/SLCCNV-BR分別擴(kuò)增DNA-A和DNA-B全長(zhǎng)序列,經(jīng)過PCR擴(kuò)增及測(cè)序后,分別獲得全長(zhǎng)基因序列DNA-A 2 730 bp和DNA-B 2 711 bp,并上傳GenBank注冊(cè)號(hào)分別為OM692270.1和OM692269.1,由于該病毒是在山東西葫蘆上首次發(fā)現(xiàn),將其命名為SLCCNV-SD。為明確SLCCNV-SD基因組序列與其他分離物核苷酸差異,本研究選取了NCBI部分SLCCNV分離物的核苷酸序列進(jìn)行了比較分析,結(jié)果表明SLCCNV-SD DNA-A和DNA-B與其他分離物的核苷酸一致性分別為89.65%～99.42%和81.82%～97.29%,并且SLCCNV-SD DNA-A 和DNA-B核苷酸序列均與SLCCNV GDHY南瓜分離物(MW389917.1和MW389918.1)的一致性最高,分別為99.42%和97.29%。

2.3 進(jìn)化樹分析

在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中,分析獲得的DNA-A和DNA-B序列與已報(bào)道的其他分離物之間的親緣關(guān)系。分別將SLCCNV-SD DNA-A和DNA-B序列與親緣關(guān)系最近的20個(gè)SLCCNV分離物的DNA-A和DNA-B序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果顯示,SLCCNV-SD與我國(guó)廣東的SLCCNV-GDHY南瓜分離物聚為一類(圖3)。

圖3 SLCCNV-SD DNA-A(a)和DNA-B(b)與其他分離物的進(jìn)化樹構(gòu)建Fig.3 Phylogenetic tree of SLCCNV-SD and other isolates based on DNA-A (a),DNA-B (b)

2.4 SLCCNV致病性驗(yàn)證

為了驗(yàn)證SLCCNV對(duì)西葫蘆的致病性,從田間發(fā)病的西葫蘆植株上收集可能攜帶病毒的煙粉虱,接種到30株健康西葫蘆幼苗上,2周后有29株觀察到明顯病癥(圖4)。為了進(jìn)一步確認(rèn)發(fā)病植株是受SLCCNV侵染所致,收集了田間自然發(fā)病西葫蘆葉片、人工接種發(fā)病西葫蘆葉片及傳播病毒的煙粉虱進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示田間自然發(fā)病西葫蘆葉片、人工接種發(fā)病西葫蘆葉片及煙粉虱內(nèi)均能檢測(cè)到該病毒(圖5)。因此,我們推測(cè)煙粉虱可攜帶SLCCNV傳染西葫蘆幼苗引發(fā)病毒病。

圖4 人工接種后發(fā)病的西葫蘆植株表現(xiàn)癥狀Fig.4 Symptoms of zucchini plants after artificial inoculation with SLCCNV

圖5 SLCCNV的PCR檢測(cè)電泳圖Fig.5 Electrophoresis of PCR detection of SLCCNV

3 結(jié)論與討論

本研究首次報(bào)道了山東省的西葫蘆病樣中檢測(cè)到SLCCNV,SLCCNV-SD DNA-A序列與印度、孟加拉國(guó)、越南、澳大利亞、泰國(guó)、菲律賓6國(guó)以及我國(guó)7個(gè)不同省(市)的59個(gè)SLCCNV分離物相似性均在90% 以上,其中與我國(guó)廣東的SLCCNV-GDHY南瓜分離物相似性最高,為99.42%,SLCCNV DNA-B序列與越南、泰國(guó)、印度、菲律賓、印度尼西亞、孟加拉國(guó)、巴基斯坦7國(guó)以及我國(guó)5個(gè)不同省(市)的35個(gè)SLCCNV分離物相似性在81%以上,其中與我國(guó)廣東的SLCCNV-GDHY南瓜分離物相似性最高,為97.29%。

進(jìn)化樹分析結(jié)果表明SLCCNV-SD西葫蘆分離物有可能來自其他葫蘆科作物,進(jìn)一步推測(cè)出侵染山東西葫蘆的病毒可能是植物材料的流通以及煙粉虱的活動(dòng)所導(dǎo)致。SLCCNV寄主范圍的增加以及其適應(yīng)性的增強(qiáng),暗示SLCCNV有可能更大規(guī)模發(fā)生,危及葫蘆科作物的健康生產(chǎn)。除此之外,煙粉虱已經(jīng)成為蔬菜類作物中傳播病毒的災(zāi)害性介體之一,再加上設(shè)施大棚的大量使用,給煙粉虱提供了周年生長(zhǎng)的適宜環(huán)境,隨著煙粉虱的遷飛和活動(dòng),SLCCNV的侵染范圍會(huì)逐漸增加。本研究在山東西葫蘆上檢測(cè)到了SLCCNV,為開展SLCCNV在我國(guó)的擴(kuò)散、種群遺傳特征分析、病毒變異與進(jìn)化等研究提供了素材,并為西葫蘆的病毒防控提供了參考依據(jù)。接下來可以繼續(xù)深入研究該病毒的分子特征及致病機(jī)制,分析病害的發(fā)病規(guī)律為防治該病害的大規(guī)模發(fā)生提供理論支撐。