姚 凡,王喜剛,郭成瑾,張麗榮,沈瑞清

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,銀川 750021;2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所,銀川 750002)

馬鈴薯是僅次于小麥、水稻、玉米的第四大糧食作物,具有耐寒、耐旱、耐瘠薄的特性,適應(yīng)性廣泛,可糧、菜、飼兼用,廣泛種植于世界各地[1]。由于長(zhǎng)期連作,使得由鐮刀菌引起的馬鈴薯根腐病、干腐病、枯萎病等土傳病害越來(lái)越嚴(yán)重,造成馬鈴薯生長(zhǎng)發(fā)育不良,抗病能力降低[2]。這些病原菌侵染后使得馬鈴薯植株萎蔫,莖內(nèi)維管束變褐,后期在病部表面產(chǎn)生白色菌絲,最終根部腐爛,大面積植株死亡,極難防治[3]。

目前對(duì)由鐮刀菌引起的馬鈴薯土傳病害尚未有很好的防治措施,國(guó)內(nèi)外防治土傳病害還是以化學(xué)防治為主[4],施用大量的農(nóng)藥不但對(duì)馬鈴薯土傳病害防治效果不理想,而且會(huì)使病原菌產(chǎn)生抗藥性,增加了防治難度,更重要的是造成環(huán)境污染和土壤結(jié)構(gòu)改變。經(jīng)大量學(xué)者研究,利用拮抗微生物控制作物根區(qū)土壤中病原菌的生長(zhǎng)、繁殖,可以從源頭上預(yù)防土傳病害的發(fā)生,是一種符合微生態(tài)原理的有效辦法。這種方法具有抗病促生的雙重效果,不污染環(huán)境,對(duì)人體無(wú)害無(wú)毒,可以達(dá)到防治土傳病害的目的[5-6]。

青霉Penicilliumspp.因生存能力強(qiáng)、抗菌譜廣,對(duì)惡劣環(huán)境耐受性強(qiáng),防病機(jī)制多,低毒無(wú)害,而被用于許多農(nóng)作物和園林植物土傳病害的預(yù)防和治療[7]。自從弗萊明發(fā)現(xiàn)特異青霉P.notatum可產(chǎn)生抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的青霉素以來(lái),已對(duì)該屬的多種真菌進(jìn)行了研究[8]。迄今為止,全球已有幾十種青霉制劑在市場(chǎng)上出售。青霉是目前使用較多的生防菌,可以防治多種植物病原菌引起的病害,瓦克青霉P.waksmanii可以有效防治芒果炭疽病,實(shí)驗(yàn)室防效試驗(yàn)結(jié)果表明,瓦克青霉T-141可以將芒果炭疽病降低40%、病情指數(shù)減輕到10%[9]。Sindhu等[10]利用疣孢青霉P.verruculosum對(duì)甜瓜蔓枯病進(jìn)行防治試驗(yàn),研究表明,經(jīng)過(guò)疣孢青霉處理過(guò)的甜瓜幼苗的株高、葉數(shù)、萌發(fā)率、根莖重、葉綠素含量等明顯增高，可以有效防治甜瓜蔓枯病。楊利珍等[11-12]研究證明疣孢青霉具有抑菌廣譜性,其對(duì)馬鈴薯干腐病菌Fusariumoxysporum的抑菌率達(dá)56.76%,對(duì)番茄灰霉病菌Botrytiscinerea的抑菌率達(dá)57.64%等。王德浩等[13]利用產(chǎn)紫青霉P.purpurogenum防治馬鈴薯黑痣病,產(chǎn)紫青霉菌Q2菌株可產(chǎn)生纖維素酶、蛋白酶、葡聚糖酶和生長(zhǎng)素,具有解磷能力。研究表明,這類青霉菌不僅可以在大多數(shù)植物根系中定殖和生長(zhǎng),還可以促進(jìn)根的生長(zhǎng),增加作物產(chǎn)量[14-16]。

中藥渣含有大量微生物生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[17]本研究選取繩狀青霉P-19作為供試菌株,以不同種類及配比的中藥材邊角料作為培養(yǎng)基主要成分進(jìn)行固體發(fā)酵,并對(duì)浸提液抑菌效果進(jìn)行評(píng)價(jià),以期為青霉菌的開發(fā)和利用提供有益數(shù)據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

繩狀青霉PenicilliumfuniculosumP-19、木賊鐮刀菌Fusariumequiseti、尖孢鐮刀菌F.oxysporum、接骨木鐮刀菌F.sambucinum、銳頂鐮刀菌F.acuminatum和茄病鐮刀菌F.solani均由寧夏農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

甘草、板藍(lán)根藥渣和葡萄皮渣，均購(gòu)于張掖市宏利中藥材綜合經(jīng)營(yíng)部。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1菌株P(guān)-19對(duì)5種鐮刀菌的拮抗活性

將P-19與鐮刀菌分別接種于PDA平板,于25℃黑暗條件下培養(yǎng)5 d,用打孔器沿菌落邊緣打取直徑10 mm的菌餅,分別放在PDA平板中線上,兩菌餅之間的距離大于20 mm,25℃黑暗條件下培養(yǎng)10 d左右,測(cè)定P-19對(duì)病原菌的拮抗能力。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.2碳、氮源的篩選及生物量的計(jì)算

以PDA培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行碳氮源單因素試驗(yàn),用等質(zhì)量(2%)的小麥粉、玉米粉、馬鈴薯全粉、馬鈴薯淀粉、可溶性淀粉和麩皮粉為碳源,等質(zhì)量(2%)的大豆粉、葡萄皮渣、硝酸銨、尿素、硫酸銨和硝酸鈉為氮源。將各碳氮源分別添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,配制成不同的碳源和氮源培養(yǎng)基,取經(jīng)過(guò)活化直徑為8 mm的菌餅作為接種體接入皿內(nèi),并且以不添加碳源和氮源基質(zhì)作為對(duì)照,每個(gè)處理重復(fù)3次,用血球板計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)產(chǎn)孢量,同時(shí)用分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)孢子懸浮液吸光值(OD),確定篩選效果。將培養(yǎng)好的菌絲體過(guò)濾,65℃烘干,稱取生物量。

1.2.3菌株P(guān)-19的固體發(fā)酵

將煮后粉碎的甘草、板藍(lán)根藥渣及甘草+板藍(lán)根+葡萄皮渣分別與粉碎的玉米、木屑以總質(zhì)量40 g為標(biāo)準(zhǔn)按比例制成固體培養(yǎng)基,甘草藥渣+玉米粉+木屑、板藍(lán)根+玉米粉+木屑和甘草藥渣、板藍(lán)根藥渣+玉米粉+木屑均按比例5∶4∶1、7∶2∶1、3∶5∶2配制;甘草+板藍(lán)根+葡萄皮渣+玉米粉按比例2∶2∶10∶5、0∶2∶6∶4和2∶0∶6∶4分別加入250 mL三角瓶中,130℃高壓滅菌60 min,分別接入P-19的種子液,于25℃下靜置培養(yǎng)3 d,手工搖瓶后繼續(xù)培養(yǎng)9～12 d,待菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基后取出,備用。

1.2.4菌株P(guān)-19的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)病原菌的抑制效果

取1 g發(fā)酵物烘干粉碎,加入2 mL無(wú)菌水充分搖勻,12 000 r/min離心10 min,將上清液過(guò)濾,取500 μL濾液滴于PDA培養(yǎng)基上,用無(wú)菌涂布棒涂布均勻,備用。用上述1.2.1的方法取病原菌菌餅,放入已涂布發(fā)酵產(chǎn)物的PDA平板中,25℃黑暗條件下培養(yǎng)5 d,不涂抹發(fā)酵產(chǎn)物設(shè)置為空白對(duì)照,9 d后測(cè)量菌落直徑?？疾彀l(fā)酵產(chǎn)物對(duì)5種鐮刀菌的抑制效果。

菌落抑制率計(jì)算:取菌落互相垂直的兩個(gè)直徑分別讀數(shù),按照以下公式計(jì)算抑制率:抑制率=(S-S1)/S × 100%。其中:S表示PDA平板上病原菌菌落直徑,S1表示在PDA培養(yǎng)基上涂布生防菌發(fā)酵產(chǎn)物后病原菌菌落直徑。

1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2007對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,DPS 17.10進(jìn)行方差分析,用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株P(guān)-19與病原菌的對(duì)峙試驗(yàn)

表1結(jié)果表明,P-19對(duì)銳頂鐮刀菌的抑制率最高,為64.32%,其次為接骨木鐮刀菌和茄病鐮刀菌,抑制率分別為45.07%和38.92%,對(duì)木賊鐮刀菌的抑制率較低,為28.13%。

表1 繩狀青霉P-19對(duì)5種馬鈴薯土傳病害病原真菌的抑菌作用1)Table 1 Bacteriostatic effect of Penicillium funiculosum P-19 on five pathogenic fungi causing potato soil-borne diseases

2.2 菌株P(guān)-19培養(yǎng)基碳氮源篩選

2.2.1碳源對(duì)P-19生物量的影響

由表2可以看出,不同碳源條件下生防菌P-19生物量不同,其中當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基PDA中碳源為麩皮時(shí)P-19生物量積累最高,為29.34 g/L,其次為玉米粉,生物量積累為23.58 g/L,相比之下,碳源為馬鈴薯淀粉和可溶性淀粉時(shí),生物量很低。

2.2.2氮源對(duì)P-19生物量和發(fā)酵液pH的影響

分別選擇P-19生物量高的麩皮和玉米粉作為碳源,與不同氮源組合對(duì)P-19進(jìn)行培養(yǎng),結(jié)果表明(表3),P-19液體發(fā)酵以玉米粉為碳源時(shí),大豆粉為氮源的生物量的積累最大,為25.45 g/L,pH為5.88;當(dāng)碳源為麩皮時(shí),氮源為葡萄皮渣的發(fā)酵液中P-19的生物量最大,為23.97 g/L,pH為5.75;而以尿素為氮源時(shí),在2種碳源條件下P-19的生物量均較小,為7.09～9.03 g/L,pH最大,在9.4以上。

表2 碳源對(duì)繩狀青霉P-19生物量的影響Table 2 Effects of carbon sources on the biomass of Penicillium funiculosum P-19

2.3 不同中藥水浸提物對(duì)P-19生物量的影響

由表4可見,在P-19最佳碳源和氮源的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入35%甘草+35%板藍(lán)根水提液可使菌體的最大生物量達(dá)到30.50 g/L,比對(duì)照增加19.84%。

表3 氮源對(duì)繩狀青霉P-19生物量和其發(fā)酵液pH的影響Table 3 Effects of nitrogen sources on the biomass of Penicillium funiculosum P-19 and pH of its fermentation broth

表4 不同中藥水提物對(duì)繩狀青霉P-19發(fā)酵生物量的影響Table 4 Effects of different aqueous extracts of Chinese herbs on Penicillium funiculosum P-19 fermentation biomass

2.4 菌株P(guān)-19中藥渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

表5綜合考慮了P-19在含有甘草或板藍(lán)根或葡萄皮渣的固體培養(yǎng)基的生長(zhǎng)情況,篩選出甘草∶玉米粉∶木屑分別為5∶4∶1、7∶2∶1、3∶5∶2,板藍(lán)根∶玉米粉∶木屑為3∶5∶2,甘草∶板藍(lán)根∶葡萄皮渣∶玉米粉為2∶2∶10∶5 五種含有藥用植物的固態(tài)培養(yǎng)基。

2.5 菌株P(guān)-19中藥固態(tài)發(fā)酵浸提液對(duì)不同鐮刀菌的抑制效果

表6結(jié)果表明,不同配方接種P-19發(fā)酵后,對(duì)尖孢鐮刀菌抑制率不同,其中培養(yǎng)基中甘草∶玉米粉∶木屑=5∶4∶1時(shí)發(fā)酵7 d后對(duì)尖孢鐮刀菌抑制率達(dá)到67.89%,之后依次為配方甘草∶玉米粉∶木屑=7∶2∶1、甘草∶玉米粉∶木屑=3∶5∶2、甘草∶板藍(lán)根∶葡萄皮渣∶玉米粉=2∶2∶10∶5、板藍(lán)根∶玉米粉∶木屑=3∶5∶2,抑制率分別為63.71%、63.66%、63.50%、60.00%;不同配方接種P-19發(fā)酵后,部分處理對(duì)接骨木鐮刀菌抑制率較尖孢鐮刀菌有所提高,板藍(lán)根∶玉米粉∶木屑=3∶5∶2處理發(fā)酵7 d后對(duì)接骨木鐮刀菌抑制率達(dá)到67.00%,其次為配方甘草∶玉米粉∶木屑=3∶5∶2、甘草∶板藍(lán)根∶葡萄皮渣∶玉米粉=2∶2∶10∶5,抑制率分別為65.25%、60.85%;不同配方接種P-19發(fā)酵后,板藍(lán)根∶玉米粉∶木屑=3∶5∶2處理發(fā)酵7 d后對(duì)茄病鐮刀菌抑制率達(dá)到64.48%,其他配方處理抑制率均在60%以下;不同配方接種P-19發(fā)酵后,對(duì)木賊鐮刀菌抑制效果不明顯,各處理抑制率均在51.00%以下,其中配方甘草∶板藍(lán)根∶葡萄皮渣∶玉米粉=2∶2∶10∶5發(fā)酵7 d后抑制率最高，也僅達(dá)到50.20%;不同配方接種P-19發(fā)酵后,對(duì)銳頂鐮刀菌抑制率均較高,其中甘草∶玉米粉∶木屑=3∶5∶2處理發(fā)酵7 d后對(duì)其抑制率達(dá)到78.25%,之后依次為配方板藍(lán)根∶玉米粉∶木屑=3∶5∶2、甘草∶板藍(lán)根∶葡萄皮渣∶玉米粉=2∶2∶10∶5、甘草∶玉米粉∶木屑=7∶2∶1、甘草∶玉米粉∶木屑=5∶4∶1,抑制率分別為77.61%、75.61%、74.46%、74.37%。

表5 繩狀青霉P-19的固態(tài)發(fā)酵效果Table 5 Effect of solid fermentation of Penicillium funiculosum P-19 strain

表6 繩狀青霉P-19菌株中藥固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)不同鐮刀菌的抑制效果Table 6 Inhibitory effects of the Chinese medicinal solid fermentation products of Penicillium funiculosum P-19 on Fusarium spp.

3 結(jié)論與討論

青霉是重要的土壤腐生真菌,在不同地區(qū)和不同土壤類型都有廣泛分布[18],青霉對(duì)不同病原菌的作用機(jī)制也存在差別,故對(duì)不同病原菌的抑制效果不同。本研究結(jié)果表明,繩狀青霉P-19菌株對(duì)尖孢鐮刀菌、接骨木鐮刀菌、茄病鐮刀菌、木賊鐮刀菌和銳頂鐮刀菌抑制率不同,其中對(duì)銳頂鐮刀菌的抑制率最高,為64.32%,其次為接骨木鐮刀菌和茄病鐮刀菌,抑制率分別為45.07%和38.92%,對(duì)木賊鐮刀菌的抑制率較低,為28.13%。

青霉菌的固體發(fā)酵大多使用工業(yè)或農(nóng)業(yè)廢棄物作為發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)。常用的固體發(fā)酵原料有麥麩、米糠、甘蔗渣、麥粒、花生粉餅、秸稈等。近年來(lái)中藥渣也漸漸應(yīng)用到微生物的發(fā)酵中。陳燕萍等[19]以微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料發(fā)酵地衣芽胞桿菌Bacilluslicheniformis,結(jié)果表明，在最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件下,菌株 FJAT-4 固態(tài)發(fā)酵物干重活菌體數(shù)可達(dá)2.63×109cfu/g。楊麗紅等[20]進(jìn)行利用中藥渣發(fā)酵亮菌Armillariellatabescens研究,結(jié)果表明，供試6種中藥渣固體發(fā)酵亮菌均可產(chǎn)漆酶,培養(yǎng)條件優(yōu)化后,亮菌漆酶酶活力較使用初始培養(yǎng)基時(shí)提高了19倍。本試驗(yàn)利用甘草、板藍(lán)根、藥渣、葡萄皮渣等分別與玉米粉、木屑制成固體培養(yǎng)基用于繩狀青霉P-19 菌株的發(fā)酵,結(jié)果表明，不同成分配比下發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)5種鐮刀菌抑制效果存在差異,其中配方為甘草∶玉米粉∶木屑配比為5∶4∶1時(shí)發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制率最高,為67.89%;板藍(lán)根∶玉米粉∶木屑為3∶5∶2時(shí)對(duì)接骨木鐮刀菌的抑制率最高,為67.00%;板藍(lán)根∶玉米粉∶木屑為3∶5∶2時(shí)對(duì)茄病鐮刀菌的抑制率最高,為64.48%。甘草∶板藍(lán)根∶葡萄皮渣∶玉米粉為2∶2∶10∶5時(shí)對(duì)木賊鐮刀菌的抑制率最高,為50.20%;甘草∶玉米粉∶木屑為3∶5∶2時(shí)對(duì)銳頂鐮刀菌的抑制率最高,為78.25%。

通過(guò)試驗(yàn)研究,繩狀青霉P-19在對(duì)峙培養(yǎng)和發(fā)酵后對(duì)5種鐮刀菌都有抑制作用,但是發(fā)酵后的繩狀青霉P-19在不同培養(yǎng)基種類和配比下對(duì)5種鐮刀菌的抑制率更高,本試驗(yàn)只對(duì)發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行了初步探索,并且發(fā)現(xiàn)不同發(fā)酵時(shí)間存在明顯差異,對(duì)其他發(fā)酵條件沒有做深入的探索,后期將從發(fā)酵的pH值、溫度、水分等條件進(jìn)一步優(yōu)化[21],以期進(jìn)一步提高對(duì)5種鐮刀菌的抑制率,為馬鈴薯土傳病害的田間防治提供理論依據(jù)。