劉建生，侯陽，鄭德宇

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)解剖學(xué)教研室實(shí)驗(yàn)教學(xué)平臺(tái)；2.錦州醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院；3.錦州醫(yī)科大學(xué)解剖學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000)

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是一種世界范圍內(nèi)常見的癌癥[1]，約占成人所有惡性腫瘤的2%～3%。在中國，RCC的發(fā)病率呈上升趨勢，2014年新發(fā)RCC約68 300例，腎癌相關(guān)死亡約25 600例[2]。RCC有多種病理分型，其中，透明細(xì)胞RCC(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)是RCC最常見的亞型，占RCC的70%～75%。其主要死亡原因是轉(zhuǎn)移性疾病。原發(fā)性ccRCC腫瘤和轉(zhuǎn)移性腫瘤之間的基因表達(dá)差異尚未確定。轉(zhuǎn)移性傳播最重要的預(yù)后因素是ccRCC[3]。雖然手術(shù)治療ccRCC非常有效，但對(duì)轉(zhuǎn)移性疾病患者的治療選擇非常有限(5年生存率約10%)[4]。早期診斷時(shí)，近60%的患者有一個(gè)局部的癌癥和20%有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[5]。由于約30%的ccRCC患者在手術(shù)后發(fā)展為轉(zhuǎn)移性疾病，因此，非常需要更好地了解轉(zhuǎn)移性ccRCC。ccRCC的轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散主要發(fā)生在骨、肺、肝或腦。轉(zhuǎn)移是ccRCC發(fā)病率高、預(yù)后差的原因。超過80%的患者在診斷為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移后存活少于5年[6]。ccRCC的增殖、復(fù)發(fā)和癌變過程中的機(jī)制至關(guān)重要，微陣列基因表達(dá)分析的方法以及生物信息學(xué)方法已被應(yīng)用于獲得基因表達(dá)數(shù)據(jù)，并可在gene數(shù)據(jù)庫中下載。因此，有必要闡明轉(zhuǎn)移性ccRCC發(fā)生和進(jìn)展的確切分子機(jī)制，并建立新的分子基礎(chǔ)策略，更好地防治侵襲性轉(zhuǎn)移性ccRCC。

1 材料與方法

1.1 資料

基因表達(dá)數(shù)據(jù)在GEODataSets獲得，選取GSE105288基因芯片數(shù)據(jù)。該芯片來自GPL10558平臺(tái)，包括26例ccRCC轉(zhuǎn)移患者腫瘤組織及9例原發(fā)ccRCC組織。

1.2 差異表達(dá)基因分析

GEO2R(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)是一個(gè)基于R語言的web數(shù)據(jù)分析工具，可用于GEO數(shù)據(jù)集的復(fù)雜分析。本研究通過在線GEO2R工具篩選，采用Benjamini和Hochberg 檢驗(yàn)調(diào)整P值，以P<0.05和|logFC|≥0.7為切分標(biāo)準(zhǔn)，其中，logFC≥0.7為上調(diào)基因，logFC≤-0.7為下調(diào)基因。得到1個(gè)差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)集(differentially expressed genes，DEGs)，然后進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.3 通路富集分析

通過Metascape 平臺(tái)(https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1)[7]對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO(geneontology)富集分析及KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析。富集分析以Enrichment>1.5為標(biāo)準(zhǔn)，以P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵基因篩選

使用STRING(http：//www.string-db.org/)，其實(shí)置信度得分高于0.9為顯著相關(guān)，結(jié)果在Cytoscape軟件中進(jìn)行可視化分析，CytoHubba插件進(jìn)行差異基因的上調(diào)及下調(diào)基因中關(guān)鍵基因的篩選，取Degree和MCC兩種算法得分，分別選取得分前10個(gè)基因確定為關(guān)鍵基因，并對(duì)兩算法結(jié)果取交集，獲得核心基因。

1.5 核心基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)與總體生存分析

利用GEPIA[7]1-18(http：//gepia.cancer-pku.cn/)數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證核心基因表達(dá)，并通過使用箱線圖來可視化基因在ccRCC與臨床分期關(guān)系和生存分析曲線。篩選條件設(shè)置：(1)Stage Plot；(2)Survival Plots；(3)基因；(4)Methods，Overall Survival；(5)腫瘤類型：腎透明細(xì)胞癌(KIRC)；(6)對(duì)應(yīng)TCGA正常組及GTEx數(shù)據(jù)，設(shè)置信評(píng)分>0.4。

1.6 腫瘤免疫浸潤相關(guān)性分析

使用TIMER網(wǎng)絡(luò)分析工具：https：//cistrome.shinyapps.io/timer/，設(shè)置檢索上述hub基因并與臨床生存有顯著關(guān)系的基因，限制癌癥類型為KIRC，關(guān)鍵基因表達(dá)驗(yàn)證，分析關(guān)鍵基因的表達(dá)，探究B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞的免疫浸潤情況，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.7 HPA 數(shù)據(jù)庫

在The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫(http：//www.proteinatlas.org/)內(nèi)輸入選擇癌癥類型為“RENAL CANCER”，找到腎癌中的相應(yīng)蛋白免疫組化實(shí)驗(yàn)展開分析[8]。

2 結(jié) 果

2.1 樣品表達(dá)與差異表達(dá)基因的篩選

如圖1所示，樣品表達(dá)水平處于相同水平。設(shè)置表達(dá)倍數(shù)變化值的對(duì)數(shù)值|LogFC|≥0.7，且P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，DEGs含有242個(gè)上調(diào)，137個(gè)下調(diào)，見圖2。

圖1 樣本表達(dá)校正箱式圖 圖2 差異表達(dá)基因火山圖

2.2 GO基因功能及KEGG通路富集分析

選取P<0.01為標(biāo)準(zhǔn)，生物過程、細(xì)胞組分、分子功能分別富集到617、87、85條，提示DEGs主要涉及生物過程。每個(gè)部分單獨(dú)按照P值排序，主要涉及細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞粘附的調(diào)控等生物過程，含有膠原蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)、膠原蛋白三聚物等細(xì)胞組分；主要富集在細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、血小板衍生生長因子結(jié)合等分子功能，見表1。KEGG 通路分析，共富集到50條信號(hào)通路，主要為蛋白質(zhì)消化吸收、人類乳頭瘤病毒感染、吞噬體等，見表2、圖3。

表1 差異表達(dá)基因的GO功能注釋

表2 差異基因KEGG通路富集

圖3 差異基因KEGG通路富集

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵基因篩選

使用STRING數(shù)據(jù)庫，對(duì)379個(gè)DEGs進(jìn)行PPI及可視化分析。STRING網(wǎng)絡(luò)共涉及318個(gè)節(jié)點(diǎn)(去除游離節(jié)點(diǎn))和190條邊，如圖4所示。再進(jìn)一步運(yùn)用Cytoscape 3.9.1軟件中degree算法，選取PPI 網(wǎng)絡(luò)中連通度排序前十的關(guān)鍵基因，發(fā)現(xiàn)ITGAV、STAT1、COL1A1、COL3A1、COL1A2、PSMB8、OAS2、ISG15、GBP2、IRF1基因?yàn)榕琶笆年P(guān)鍵基因，見圖5；MCC算法，排序前十的關(guān)鍵基因：STAT1、OAS2、ISG15、PSMB8、GBP2、IRF1、HLA-F、ISG20、HLA-B、IFI27，見圖6。兩者交集基因?yàn)镾TAT1、OAS2、ISG15、PSMB8、GBP2、IRF1，見圖7、表6，均為上調(diào)基因，我們將此基因集作為核心基因集進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證和篩選。

圖4 差異表達(dá)基因構(gòu)建的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖5 Degree算法關(guān)鍵基因

圖6 MCC算法關(guān)鍵基因

表3 MCC與Degree算法交集的核心基因

圖7 核心基因的熱圖

2.4 核心基因的表達(dá)情況驗(yàn)證

在TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫，正常腎臟組織與腎臟癌組織中表達(dá)比較顯示，OAS2、ISG15、PSMB8、GBP2腎透明細(xì)胞癌表達(dá)升高，明顯高于正常腎臟組織，與GEO結(jié)果相同，見圖8。

2.5 核心基因與患者生存時(shí)間的關(guān)系

GEO、EGA與 TCGA生存分析顯示，STAT1、OAS2、ISG15、GBP2與患者生存時(shí)間的關(guān)系相關(guān)，見圖9。

目前，提高制動(dòng)器壓盤錐窩耐磨性能的主要方法為表面感應(yīng)淬火，主要存在以下問題：感應(yīng)器仿形性差、淬火工藝難控制。由于制動(dòng)器壓盤錐窩形狀小而不規(guī)則，給感應(yīng)器的制作帶來很大困難，目前的感應(yīng)器多為“一字形”，窩頭一側(cè)涂覆上導(dǎo)磁粉，這種感應(yīng)器仿形性差，加熱效率低，從而導(dǎo)致表面硬度不足、淬硬層分布不均勻，若加熱時(shí)間過長則容易過燒甚至燒熔。

2.6 核心基因在腎透明細(xì)胞癌分期表達(dá)

依據(jù)2.4和2.5結(jié)果顯示，OAS2、ISG15、GBP2是明顯升高、同時(shí)與生存時(shí)間顯著相關(guān)的基因，我們進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證和篩選，ISG15、GBP2與腫瘤分期明顯相關(guān)(P<0.05)隨分期級(jí)別表達(dá)增高，與GEO數(shù)據(jù)集分析結(jié)果基本一致，見圖10。

2.7 ISG15和GBP2在ccRCC中的表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系

通過TIMER 數(shù)據(jù)庫分析得到ISG15 表達(dá)與ccRCC免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性結(jié)果，表明ISG15 基因表達(dá)與細(xì)胞純度明顯負(fù)相關(guān)性，與CD8+T細(xì)胞、與樹突狀細(xì)胞的免疫浸潤水平呈顯著正相關(guān)，巨噬細(xì)胞負(fù)相關(guān)。GBP2的表達(dá)與ccRCC免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性結(jié)果，表明GBP2 基因表達(dá)與細(xì)胞純度明顯負(fù)相關(guān)性，與B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞的免疫浸潤水平呈顯著正相關(guān)。提示ISG15和GBP2有可能參與ccRCC細(xì)胞的免疫浸潤過程，在ccRCC的腫瘤免疫細(xì)胞浸潤水平中發(fā)揮重要用，見圖11、圖12。

2.8 ISG15和GBP2在ccRCC中的表達(dá)相同驗(yàn)證

從HPA 數(shù)據(jù)庫中獲取到12例腎癌組織的蛋白表達(dá)情況，ISG15在3例正常腎臟中，腎小球中無表達(dá)，腎小管中高表達(dá)，主要在細(xì)胞漿和細(xì)胞膜上表達(dá)；癌組織中，高表達(dá)6例、中等表達(dá)4例、低表達(dá)2例，主要在細(xì)胞漿和細(xì)胞膜上，另外在細(xì)胞核也有表達(dá)。

GBP2在6例正常腎臟中，腎小球細(xì)胞核，腎小管中，主要在細(xì)胞漿和細(xì)胞核核膜上表達(dá)，均為中等表達(dá)；癌組織中，高表達(dá)5例、中等表達(dá)3例、低表達(dá)4例，主要在細(xì)胞漿、胞膜和細(xì)胞核上表達(dá)，見圖13。

STAT1OAS2ISG15PSMB8GBP2IRF1圖8 核心基因在正常腎臟組織與腎臟癌組織中的表達(dá)

圖9 核心基因與患者生存時(shí)間的關(guān)系

OAS2ISG15GBP2圖10 核心基因在腎透明細(xì)胞癌分期表達(dá)情況

圖11 ISG15在ccRCC中的表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系

圖12 GBP2在ccRCC中的表達(dá)和免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系

免疫組化法，DAB顯色，200×圖13 ISG15和GBP2在正常組織與腎細(xì)胞癌組織中的表達(dá)

3 討 論

以往的研究主要集中在腫瘤組織與正常組織表達(dá)差異的生物標(biāo)志物的篩選上。然而，在更致命和治療相關(guān)的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移性腫瘤中，基因表達(dá)譜卻不多見。微陣列技術(shù)是世界上許多研究人員用來探索癌癥基因表達(dá)水平的主要方法之一。因此，我們研究的基因微陣列從GEO下載并分析，本研究通過生物信息學(xué)對(duì)腎透明細(xì)胞癌芯片進(jìn)行分析獲得相關(guān)差異基因，并通過對(duì)差異基因進(jìn)行GO富集分析以及KEGG通路富集分析，篩選關(guān)鍵基因，通過生物信息學(xué)初步驗(yàn)證，為腎透明細(xì)胞癌的機(jī)制研究進(jìn)一步提供研究方向及依據(jù)。

本研究通過生物信息學(xué)分析方法，從GSE105288基因芯片篩選出了379個(gè)差異表達(dá)基因，包括242個(gè)上調(diào)，137個(gè)下調(diào)，最后通過腫瘤分期和生存分析等方法，最終篩選出ISG15和GBP2可能為核心基因。

GBP2是也是一種干擾素誘導(dǎo)蛋白，目前中文對(duì)其研究的報(bào)道不多，生物信息學(xué)報(bào)道顯示GBP5可能通過影響寡聚化域樣受體信號(hào)通路活性從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，針對(duì)GBP2基因，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證表明GBP2過表達(dá)可促進(jìn)ccRCC的遷移和侵襲能力，提示GBP2有望成為ccRCC免疫相關(guān)的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[13-14]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞是腫瘤免疫環(huán)境的主要組成部分[15]。本文數(shù)據(jù)庫分析顯示ISG15和GBP2基因表達(dá)與細(xì)胞純度明顯相關(guān)性，與B細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等的免疫浸潤水平呈顯著相關(guān)。因此，我們的認(rèn)為ISG15和GBP2可能對(duì)ccRCC的免疫浸潤有影響。

綜上所述，我們?cè)诒狙芯恐型ㄟ^生物信息學(xué)分析了ccRCC樣本中的DEGs，并篩選出與ccRCC相關(guān)的基因。我們的綜合生物信息學(xué)分析顯示，ISG15和GBP2在轉(zhuǎn)移性ccRCC組織中顯著上調(diào)，提示ISG15和GBP2轉(zhuǎn)移中具有原癌基因效應(yīng)。對(duì)于ccRCC患者，ISG15和GBP2基因表達(dá)與細(xì)胞純度明顯相關(guān)性，與CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞的免疫浸潤水平呈顯著相關(guān)。雖然本文我們研究的樣本較少，結(jié)果存在了一定的局限性，并且暫時(shí)還有一些問題沒有解決，但是我們的研究有助于更好地理解ccRCC，對(duì)改善ccRCC患者轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)、ccRCC的診斷、治療策略和預(yù)后預(yù)測研究具有重要的臨床意義。