田雨

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

瑞舒伐他汀是一種高選擇性3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，通過減少肝臟膽固醇的合成，從而降低血脂水平[1]。此外，其還具有穩(wěn)定斑塊、抗氧化和降低炎癥介質(zhì)等多種作用。替格瑞洛是一種新型的抗血小板藥物，能夠可逆地與血小板二磷酸腺苷受體發(fā)生相互作用，影響信號傳導(dǎo)和血小板活化，其療效確切，出血風(fēng)險小，是抗血小板治療的一線用藥[2]。兩藥在心腦血管疾病的治療中均占有重要地位，并且在臨床上常常聯(lián)合應(yīng)用。

由于替格瑞洛主要經(jīng)細(xì)胞色素P450 3A4酶(cytochrome P450 3A4，CYP3A4)代謝，而瑞舒伐他汀是細(xì)胞色素P450的弱底物，僅發(fā)生有限代謝，CYP3A4參與代謝程度低，因而普遍認(rèn)為二者發(fā)生藥物相互作用的風(fēng)險小。但近幾年來，國內(nèi)外報道了多例瑞舒伐他汀聯(lián)用替格瑞洛后誘發(fā)橫紋肌溶解癥的案例[3-5]，引發(fā)了二者之間是否存在某種相互作用的思考。以往的研究多集中在替格瑞洛和主要經(jīng)CYP3A4代謝的他汀類藥物，如辛伐他汀和阿托伐他汀等，而對瑞舒伐他汀和替格瑞洛的藥動學(xué)研究較少。為此，本文建立了LC-MS/MS法同時測定大鼠血漿中瑞舒伐他汀和替格瑞洛的濃度，并研究二者之間的藥動學(xué)相互作用，以期為臨床合理應(yīng)用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-30AD 超高速液相色譜系統(tǒng)(島津公司)，Qtrap 5500型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(AB Sciex公司)，MS105分析天平(Mettler公司)，H-101型漩渦混合器(上海康禾光電儀器公司)，5810R型低溫冷凍離心機(jī)(Eppendorf 公司)，Tube-Heater L-119A氮吹儀(北京來亨公司)，Millipore 超純水儀(Milipore公司)。

1.2 試劑

瑞舒伐他汀鈣(含量：97.6%，批號：101028-201202，中國食品藥品檢定研究院)，替格瑞洛(含量：99.7%，批號：1489-090A1，深圳博泰爾生物技術(shù)有限公司)，卡馬西平(含量：99.7%，批號：100142-201105，中國食品藥品檢定研究院)，甲醇、乙腈、甲酸(色譜純，Merck公司)，甲基叔丁基醚(分析純，天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司)，超純水，肝素鈉注射液(國藥集團(tuán)容生制藥有限公司)。

1.3 實(shí)驗動物

健康SD大鼠(SPF級，雄性，體重200～220 g)，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司(SCXK(遼)2015-0001)。購入后于實(shí)驗室(溫度20 ℃～25 ℃，濕度50%～70%)適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，自由攝食飲水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters XTerra MS C18(150 mm×2.1 mm，5μm)，預(yù)柱為SecurityGuard Cartridges C18(4.0 mm×3.0 mm，Phenomenex)，流動相為甲醇-乙腈-水(含0.1%甲酸)(80∶10∶10)，等度洗脫，流速為0.2 mL/min，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源為ESI源；正離子方式檢測；多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)模式；離子源噴射電壓為4500 eV；離子源溫度為450 ℃；離子源氣體1∶40 psi；離子源氣體2∶20 psi；氣簾氣25 psi；碰撞氣壓力為medium；瑞舒伐他汀、替格瑞洛和內(nèi)標(biāo)卡馬西平碰撞能量(CE)及用于定量分析的離子對(m/z)分別為42 eV和482.2→258.2、44 eV和523.3→127.1、27 eV和237.2→201.4。

2.3 工作溶液和質(zhì)控(QC)溶液的配制

分別稱取適量瑞舒伐他汀鈣和替格瑞洛對照品，精密稱定，置于容量瓶中，用甲醇定容，獲得質(zhì)量濃度均為100 g/mL的儲備液。取各儲備液適量，用甲醇稀釋，配成瑞舒伐他汀濃度分別為5、10、25、100、250、500、1000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液和10、100、800 ng/mL的QC溶液，替格瑞洛濃度分別為20、40、100、400、1000、2000、4000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液和40、400、3200 ng/mL的QC溶液。

稱取適量卡馬西平對照品，精密稱定，置于容量瓶中，用甲醇定容，獲得質(zhì)量濃度為100 g/mL的內(nèi)標(biāo)儲備液。取儲備液適量，用甲醇稀釋，配制濃度為100 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品及QC樣品的制備

取瑞舒伐他汀和替格瑞洛的標(biāo)準(zhǔn)溶液各20 μL，加入空白血漿160 μL，配制含瑞舒伐他汀/替格瑞洛血漿濃度分別為0.5/2、1/4、2.5/10、10/40、25/100、50/200、100/400 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品；取QC工作液，配制含瑞舒伐他汀/替格瑞洛血漿濃度分別為1/4、10/40、80/320 ng/mL的QC樣品，冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 血漿樣品處理

取待測血漿樣品100 μL，加入內(nèi)標(biāo)工作液10 μL，渦旋震蕩30 s，加入甲基叔丁基醚3 mL，渦旋震蕩3 min，4 ℃下離心10 min(1.3×104r/ min)。分取有機(jī)相，氮?dú)獯蹈?40 ℃)，甲醇復(fù)溶，4 ℃下離心10 min(8.5×103r/min)，取上清液進(jìn)樣分析。

2.6 動物實(shí)驗給藥方案

18只健康雄性SD大鼠，隨機(jī)分成3組(n=6)，單劑量給藥，給藥方式如下：第一組單獨(dú)灌胃給予替格瑞洛8.5 mg/kg；第二組單獨(dú)灌胃給予瑞舒伐他汀鈣1 mg/kg；第三組同時灌胃給予替格瑞洛8.5 mg/kg +瑞舒伐他汀鈣1 mg/kg。

2.7 生物樣品采集

采血前12 h，給予大鼠禁食不禁水處理。分別于給藥前(0 h)和給藥后 0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24和36 h經(jīng)大鼠眼眶后靜脈叢采血約0.3 mL，置于含肝素的離心管內(nèi)，離心10 min(5×103r/min)，分離上層血漿，于 -70 ℃保存待測。

2.8 分析方法確證

2.8.1 專屬性

取大鼠空白血漿，按“2.5”項下操作(用等體積甲醇替代內(nèi)標(biāo))，獲得空白血漿色譜圖。取空白血漿加入對照品溶液(0.5 ng/mL瑞舒伐他汀和2 ng/mL替格瑞洛)和給藥后1 h血漿樣品，按“2.5”項下操作，獲得相應(yīng)的色譜圖。瑞舒伐他汀、替格瑞洛和卡馬西平的保留時間分別為2.1 min、2.8 min和2.3 min。結(jié)果顯示，在分析物和內(nèi)標(biāo)相應(yīng)保留時間的地方，無干擾峰出現(xiàn)，專屬性良好，見圖1。

A：空白血漿；B：空白血漿加瑞舒伐他汀/替格瑞洛(0.5 ng/mL/2 ng/mL)和內(nèi)標(biāo)；C：灌胃給藥后1 h血漿樣品；Ⅰ：瑞舒伐他汀；Ⅱ：替格瑞洛；Ⅲ：卡馬西平圖1 瑞舒伐他汀、替格瑞洛和卡馬西平的典型色譜圖

2.8.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限

取標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，按“2.5”項下操作，將待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比同待測物濃度，通過加權(quán)最小二乘法[6]進(jìn)行回歸運(yùn)算。經(jīng)計算，替格瑞洛的線性回歸方程為y=6.94×10-3x+1.61×10-2(r=0.9995)，瑞舒伐他汀的線性回歸方程為y=3.04×10-3x+2.08×10-2(r=0.9996)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，瑞舒伐他汀和替格瑞洛線性范圍分別為2～400 ng/mL和0.5～100 ng/mL。

2.8.3 精密度與準(zhǔn)確度

取3個濃度的QC樣品各6份，按“2.5”項下操作，連續(xù)測定3 d。根據(jù)當(dāng)天標(biāo)準(zhǔn)曲線計算QC樣品的濃度，考察方法的精密度和準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示，瑞舒伐他汀和替格瑞洛每一QC濃度水平的日內(nèi)、日間精密度均小于15%，準(zhǔn)確度在96%～109%之間，滿足中國藥典(2020 版)9012 指導(dǎo)原則的要求，見表1。

2.8.4 提取回收率

取3個濃度的QC樣品各6份，按“2.5”項下操作，獲得相應(yīng)峰面積。另取空白血漿，按“2.5”項下操作(用等體積甲醇替代內(nèi)標(biāo))，取全部上清液，加入相應(yīng)濃度的QC溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混合后，取上清液進(jìn)行LC-MS/MS分析，記錄峰面積。用兩種處理方法的峰面積比計算提取回收率。結(jié)果顯示，本方法條件下，瑞舒伐他汀和替格瑞洛QC樣品的平均提取回收率均在96.1%以上，RSD均小于15%，見表1。

2.8.5 穩(wěn)定性

取低、高濃度的QC樣品各3份，按“2.5”項下操作，分別在處理前室溫放置2 h和處理后室溫放置4 h，-70 ℃冷凍-解凍循環(huán)3次和-70 ℃放置30 d的條件下測定。結(jié)果顯示，瑞舒伐他汀和替格瑞洛血漿樣品濃度的RSD均小于15%，RE均在±15%之間，表明在上述條件下穩(wěn)定性良好，見表2。

表1 血漿樣品中瑞舒伐他汀和替格瑞洛的準(zhǔn)確度、精密度和提取回收率(n=6，%)

表2 血漿樣品中瑞舒伐他汀和替格瑞洛的穩(wěn)定性(n=3，%)

2.8.6 基質(zhì)效應(yīng)

取不同來源的空白血漿6份，按“2.5”項下操作(用等體積甲醇替代內(nèi)標(biāo))，取全部上清液，加入相應(yīng)濃度的QC溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混合后，取上清液進(jìn)行LC-MS/MS分析，記錄峰面積。用超純水代替空白血漿，依同法操作，獲得相應(yīng)的峰面積。用峰面積比值計算基質(zhì)效應(yīng)。經(jīng)計算，低、高濃度瑞舒伐他汀QC樣品經(jīng)內(nèi)標(biāo)校正的基質(zhì)效應(yīng)因子變異系數(shù)分別為3.3%和4.5%，替格瑞洛分別為4.2%和4.3%。表明可忽略基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用 WinNonlin 8.1軟件計算主要藥動學(xué)參數(shù)，并通過SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。以秩和檢驗法對Tmax進(jìn)行非參數(shù)檢驗，對其他藥動學(xué)參數(shù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥后，瑞舒伐他汀Cmax增加0.55倍(P<0.05)，AUC0-∞和AUC0-t增加1.48倍(P<0.05)，Cl降低1.8倍(P<0.05)，MRT0-t和MRT0-∞延長約1h(P<0.05)；替格瑞洛Tmax縮短約1 h(P<0.05)，MRT0-t縮短約2.5 h(P<0.05)，Cmax、AUC0-∞和AUC0-t均下降，但無統(tǒng)計學(xué)意義。瑞舒伐他汀和替格瑞洛的藥時曲線見圖2、表3。

圖2 大鼠血漿中瑞舒伐他汀(I)和替格瑞洛(II)的平均血藥質(zhì)量濃度-時間曲線

表3 大鼠血漿中瑞舒伐他汀和替格瑞洛的主要藥動學(xué)參數(shù)

3 討 論

3.1 大鼠血漿中瑞舒伐他汀和替格瑞洛含量測定的方法學(xué)研究

目前關(guān)于同時測定體內(nèi)瑞舒伐他汀和替格瑞洛血藥濃度的方法未見報道，本研究建立了LC-MS/MS法同時測定大鼠血漿中二者的質(zhì)量濃度，并進(jìn)行方法學(xué)驗證，用于兩者的大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)研究。

流動相分別考察了甲醇-水，乙腈-水、甲醇-乙腈-水溶液。當(dāng)流動相采用甲醇-乙腈-水時，待測物分離相對較好。而在水溶液中加入甲酸后，色譜峰型改善，保留時間縮短，儀器響應(yīng)較高，最終選擇甲醇-乙腈-水(含0.1%甲酸)作為流動相。

在選擇樣品處理方法時，考察了蛋白沉淀法和液-液萃取法。蛋白沉淀法考察了甲醇和乙腈溶液作為蛋白沉淀劑，但提取后干擾物質(zhì)影響較大，待測物和內(nèi)標(biāo)峰形較差。考察液-液萃取法時，查閱相關(guān)文獻(xiàn)[7]，分別選擇了乙酸乙酯、甲基叔丁基醚和正己烷作為萃取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正己烷提取回收率低，乙酸乙酯干擾物質(zhì)的影響較大，重現(xiàn)性差。甲基叔丁基醚提取回收率在85%以上，響應(yīng)高，重現(xiàn)性良好。

3.2 大鼠體內(nèi)瑞舒伐他汀和替格瑞洛的藥動學(xué)相互作用

本研究分別考察了單獨(dú)用藥和聯(lián)合用藥后，大鼠體內(nèi)瑞舒伐他汀和替格瑞洛的藥代動力學(xué)特征。結(jié)果表明兩者單次口服給藥后存在一定的藥動學(xué)相互作用。替格瑞洛在體內(nèi)主要經(jīng)CYP3A4代謝，瑞舒伐他汀僅少部分經(jīng)肝藥酶代謝，且主要經(jīng)CYP2CP代謝，少量經(jīng)CYP3A4代謝，大量研究結(jié)果也證實(shí)[8-9]，酶競爭作用幾乎不影響兩者的藥動學(xué)特征。查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)瑞舒伐他汀是有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體多肽OATP1B1的高親和力底物，與之結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟[10]。當(dāng)瑞舒伐他汀與OATP1B1抑制劑，如吉非貝奇[11]或依折麥布[12]聯(lián)用后，達(dá)峰濃度和藥時曲線下面積均明顯升高。而Christoph等[13]研究結(jié)果表明替格瑞洛瑞對OATP1B1有明顯的抑制作用。此外，P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)可能也有參與。瑞舒伐他汀是P-gp的底物，Verhulst等[14]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)P-gp抑制劑長春堿和瑞舒伐他汀聯(lián)用后，瑞舒伐他汀的血藥濃度增加了1.6倍，而替格瑞洛是P-gp的弱效抑制劑。因此，替格瑞洛可能通過抑制OATP1B1和P-gp，降低瑞舒伐他汀的肝臟攝取和外排作用，使其Cmax、AUC0-∞和AUC0-t明顯增加，MRT0-t和MRT0-∞顯著延長，導(dǎo)致體內(nèi)暴露量增加，提高了不良反應(yīng)的發(fā)生風(fēng)險。聯(lián)合用藥后，替格瑞洛的Tmax和MRT0-t顯著縮短，Cmax、AUC0-∞、AUC0-t均有所降低，可能是瑞舒伐他汀加快了替格瑞洛的吸收速度和代謝速度，是否存在酶誘導(dǎo)作用，還有待進(jìn)一步研究。

本研究尚有不足之處。因瑞舒伐他汀和替格瑞洛的代謝和分布均受基因變異影響，個體差異性較大，尚需擴(kuò)大樣本量，延長觀察時間，以獲得更豐富的數(shù)據(jù)和更準(zhǔn)確地評價。