馮嬌，劉楠楠

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地；2.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院全軍心血管病研究所，遼寧 沈陽 110016)

心力衰竭嚴(yán)重影響并危害居民健康，其診療工作仍是亟待解決的問題[1]。心力衰竭的臨床前期研究仍然嚴(yán)重依賴于小鼠心力衰竭模型，實驗性復(fù)制心力衰竭的動物模型有助于我們理解疾病所涉及的細(xì)胞和分子機(jī)制，在心力衰竭開發(fā)新的預(yù)防和治療方法上發(fā)揮著重要作用[2]。心衰模型以不良的心臟重構(gòu)過程為特征[3]，應(yīng)用最廣泛的是Rockman等人[4]描述的橫向主動脈弓縮窄(TAC)模型。該模型在某種程度上模擬人類的高血壓狀態(tài)，出現(xiàn)左心室肥大及收縮或舒張功能不全，長期進(jìn)展為心力衰竭[5]。心臟結(jié)構(gòu)和功能的評估是驗證試驗?zāi)Ｐ统晒εc否的關(guān)鍵之一，自從引入小鼠超聲心動圖以來，大多數(shù)TAC模型的研究報告使用超聲心動圖記錄心臟尺寸和功能[6]。

超聲心動圖可在鎮(zhèn)靜的動物身上快速進(jìn)行[7]，為活體心功能評估提供了獨特的手段，對實驗室監(jiān)測各種心臟模型、心臟結(jié)構(gòu)與功能改變有重要應(yīng)用價值[8]。二維B型顯像用于檢測心臟的異常運動或結(jié)構(gòu)改變，一維M型顯像用于量化心臟的大小和收縮力[9]。由于超聲成像技術(shù)的進(jìn)步，超聲系統(tǒng)已經(jīng)具備了獲得精確可靠的小鼠心臟圖像的能力，本實驗主要通過高頻超聲心動圖測量左心腔大小、左室壁厚度及收縮功能，并結(jié)合其他輔助檢查對小鼠主動脈弓縮窄所引發(fā)的心衰模型做出綜合評價。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SPF級C57BL/6J小鼠20只，8周齡，21～24克/只，訂購于沈陽北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院科研基地[SCXK(遼)2020-0001]，適應(yīng)性喂養(yǎng)于全軍重癥戰(zhàn)創(chuàng)傷中心實驗室[SYXK(遼)2020-0005]，1 w內(nèi)自由活動與飲食。實驗經(jīng)醫(yī)院動物護(hù)理委員會批準(zhǔn)(2019-1008)。

1.2 制作實驗動物模型

20只小鼠隨機(jī)分為兩組，假手術(shù)組(SHAM)6只，手術(shù)組(TAC)14只，手術(shù)前禁喂食物，隨意飲水，進(jìn)行主動脈弓縮窄術(shù)。如之前發(fā)表的文獻(xiàn)[10-11]，TAC組創(chuàng)建主動脈弓縮窄模型，使用腹腔注射進(jìn)行麻醉，將甲苯噻嗪(10 mg/kg)、氯胺酮(100 mg/kg)混于生理鹽水，完全麻醉小鼠后，將其固定在小動物手術(shù)臺上。對手術(shù)區(qū)域進(jìn)行脫毛，使用碘伏進(jìn)行消毒，在臺式手術(shù)顯微鏡(鎮(zhèn)江中天 XTS-4A)下操作，切開胸部皮膚，暴露胸骨，沿小鼠前正中線自胸骨上窩至胸骨角下剪開胸骨，通過開胸器撐開暴露胸腺。沿左右脂肪墊連接處撥開，暴露出主動脈胸段。游離主動脈弓，于下方穿入7-0絲線，將27G針頭與主動脈弓平行放置，共同結(jié)扎。結(jié)扎后抽出細(xì)針觀察小鼠情況，對比右側(cè)無名動脈與左側(cè)頸總動脈充血情況，然后用5-0絲線連續(xù)縫合胸骨與皮膚，涂抹適量消炎藥。SHAM組開胸分離主動脈弓后用7-0絲線纏繞但不進(jìn)行結(jié)扎。術(shù)后將小鼠放在保溫墊上保溫，蘇醒后根據(jù)活動情況放回飼養(yǎng)籠內(nèi)進(jìn)行日常飼養(yǎng)。對兩組小鼠進(jìn)行生存分析，術(shù)后至模型建立后6 w內(nèi)，每天檢查籠內(nèi)是否有動物死亡。

1.3 經(jīng)胸超聲心動圖

從頸部到胸部劍突水平去除毛發(fā)以優(yōu)化聲學(xué)界面，用異氟醚麻醉小鼠(2%用于誘導(dǎo)，1.5%用于維持)，體溫保持在36 ℃～37 ℃，在整個成像過程中監(jiān)測心率和呼吸。使用高頻超聲探頭進(jìn)行經(jīng)胸超聲檢查。術(shù)前1 d、術(shù)后1 w、術(shù)后6 w使用小動物超聲儀和30 MHz線性陣列換能器(Vevo 2100 Imaging System，Serial Number：2100-0335)觀察小鼠主動脈弓處血流情況，多個視圖完成二維長軸、連續(xù)短軸視圖和四腔心多普勒超聲檢查。避免在圖像采集過程中胸部受到任何壓縮和探頭無傾向性傾斜，多普勒波束與流向截角控制在60°以內(nèi)。采集反應(yīng)心室結(jié)構(gòu)的參數(shù)：左室舒張末期后壁厚度(LVPWd)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左心室舒張末期容積(LVEDV)，左心室收縮末期容積(LVESV)，計算出反應(yīng)左心室收縮功能的指標(biāo)：射血分?jǐn)?shù)(EF)、短軸縮短率(FS)。

1.4 病理組織學(xué)分析

術(shù)后6 w超聲檢查后24 h，小鼠按照手術(shù)方法麻醉，頸椎脫臼進(jìn)行安樂死，切除心臟并進(jìn)行器官稱重，計算心體比值(HW/BW)，取對照組3只、手術(shù)組6只，心臟組織進(jìn)行切片，固定、脫水處理后，石蠟包埋，自然冷卻后，病理切片機(jī)切成4 μm厚的病理切片，用蘇木精和伊紅染色，并在光鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)分析。HE染色觀察心肌細(xì)胞。通過馬松染色對纖維化的情況進(jìn)行觀察，細(xì)胞核、纖維素、肌纖維顯像為黑色，而膠原纖維顯像成藍(lán)色。使用Media Cybernetics的Image-Pro Plus 2D軟件對圖像膠原含量進(jìn)行分析。

1.5 Western Blot檢測蛋白質(zhì)水平

另取對照組小鼠3只、手術(shù)組小鼠6只，整個心臟組織進(jìn)行蛋白印跡檢測，心臟研磨后加入組織裂解緩沖液中，于4 ℃、12 000×g離心15 min，使用BCA protein 測定試劑盒檢測蛋白質(zhì)的濃度。在10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠中分離等量的蛋白質(zhì)樣品，并轉(zhuǎn)移到硝NC膜，再將NC膜用5%的脫脂牛奶密封2 h，然后在4 ℃下與ANP抗體(abcam，ab180649)孵育，隔夜后PBST沖洗，用對應(yīng)的二級抗體(1∶1000)在室溫下孵育90 min，PBST洗膜后用ECL發(fā)光液顯影。密度分析使用ImageJ圖像軟件。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗，各組間比較采用重復(fù)測量方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠存活率

術(shù)后至術(shù)后6 w每天記錄小鼠生存情況。手術(shù)組14只小鼠，2只在術(shù)后1 d死亡，假手術(shù)組小鼠無死亡，手術(shù)組小鼠存活率為85.7%。

2.2 高頻超聲心動圖檢測心臟結(jié)構(gòu)與功能變化

小鼠各超聲數(shù)值之間均存在交互效應(yīng)，提示兩組小鼠隨著實驗周數(shù)的延長，心臟結(jié)構(gòu)與收縮功能變化情況不同；成對比較結(jié)果提示對照組小鼠各超聲指標(biāo)未隨時間變化產(chǎn)生統(tǒng)計學(xué)意義，而手術(shù)組小鼠術(shù)后6 w與術(shù)前1 d、術(shù)后1 w時各超聲指標(biāo)比較有顯著差異性；與對照組小鼠相比，術(shù)前1 d，兩組小鼠各超聲指標(biāo)均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1；術(shù)后1 w時，TAC組小鼠左心室后壁厚度增加，左室大小及容積未見明顯變化，左室短軸縮短率無明顯變化，見表2；術(shù)后6 w時，TAC組小鼠左室舒張末期和收縮末期內(nèi)徑和容積增加，左室射血分?jǐn)?shù)及短軸縮短率減少，左室后壁厚度變薄，但尚未產(chǎn)生統(tǒng)計學(xué)差異，見表3。兩組小鼠不同時間段有代表性的M型超聲，見圖1。

表1 術(shù)前1 d小鼠左室形態(tài)結(jié)構(gòu)與收縮功能參數(shù)

表2 術(shù)后1 w小鼠左室形態(tài)結(jié)構(gòu)與收縮功能參數(shù)

表3 術(shù)后6 w小鼠左室形態(tài)結(jié)構(gòu)與收縮功能參數(shù)

圖1 有代表性的M型超聲心動圖

2.3 蛋白印跡法檢測結(jié)果

術(shù)后6 w測量心肌組織中心肌肥大相關(guān)蛋白ANP水平，TAC組較SHAM組表達(dá)水平增強(qiáng)，見圖2。

圖2 兩組小鼠心肌組織ANP蛋白表達(dá)水平

2.4 形態(tài)學(xué)及病理組織學(xué)改變

6 w時兩組小鼠之間體重(BW)沒有差異性，但是手術(shù)組小鼠心臟重量(HW)及心體比值(HW/BW)較對照組增加，見表4。HE染色顯示，與對照組心肌細(xì)胞大小均勻、形態(tài)完整相比，手術(shù)組小鼠心肌細(xì)胞肥大，胞漿染色加深，并可見心肌細(xì)胞壞死。Masson染色顯示，對照組心肌纖維排布整齊，手術(shù)組心肌纖維排布紊亂，并見大量間質(zhì)膠原纖維，表明心肌細(xì)胞纖維化明顯，見圖3。

表4 兩組小鼠術(shù)后6 w時心臟、體重、心體比值

A：術(shù)后6 w兩組小鼠心肌HE染色；B：術(shù)后6 w兩組小鼠心肌Masson染色圖3 小鼠心肌組織病理學(xué)圖像

3 討 論

本研究通過外科方法建立主動脈弓縮窄模型，綜合應(yīng)用高頻超聲心動圖及多種病理學(xué)方法，展示了小鼠TAC模型的病理發(fā)展進(jìn)程，其表現(xiàn)為代償性心肌肥厚到失代償擴(kuò)張型收縮期心衰的階段特征，為日后小鼠主動脈弓縮窄模型的使用提供相關(guān)理論基礎(chǔ)。術(shù)后1 w時小鼠出現(xiàn)心肌厚度增加但未出現(xiàn)心室擴(kuò)張及收縮功能障礙，術(shù)后6 w時小鼠有顯著的收縮功能減低，心肌組織肥大、壞死，纖維化明顯，ANP蛋白表達(dá)增強(qiáng)。本實驗結(jié)果提示TAC模型建模后成功率高、心功能減低理想，是一種良好的由后負(fù)荷增加導(dǎo)致的心衰模型。

實驗中主動脈縮窄術(shù)后1 d有2只小鼠死亡，尸解后見肺充血，死亡原因可能為急性左心衰，其余小鼠至實驗結(jié)束時未發(fā)生死亡，證明該模型穩(wěn)定性良好，可廣泛應(yīng)用于壓力負(fù)荷性心衰疾病過程中的研究。

術(shù)后1 w時，小鼠的心腔大小、體重及容積未發(fā)生明顯變化，但已經(jīng)出現(xiàn)左室壁心肌增厚，提示此階段心臟表現(xiàn)為因后負(fù)荷增加所致的代償性心肌肥厚。同時，射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率作為左室收縮功能的主要指標(biāo)，分別代表了左室排空功能和心肌縮短能力，并未發(fā)生明顯統(tǒng)計學(xué)變化，但呈現(xiàn)出輕微的增強(qiáng)，考慮為收縮功能代償性增加。有實驗證明，TAC術(shù)后1 w就能出現(xiàn)左室肥厚[12]，而在術(shù)后2 w將會達(dá)到峰值[13]，與本實驗結(jié)果相近。

術(shù)后6 w時，小鼠大體表現(xiàn)為HW/BW的比值增加。ANP蛋白能特異性反映心肌細(xì)胞肥大并提示存在早期心力衰竭，在壓力超負(fù)荷法建立的模型中有較明顯的優(yōu)勢[14]。術(shù)后6 w的小鼠心肌細(xì)胞ANP表達(dá)增強(qiáng)，組織染色見細(xì)胞壞死、心肌纖維紊亂，間質(zhì)膠原纖維含量增多。此階段超聲測量的小鼠結(jié)構(gòu)方面，心腔增大、心室壁變薄；在心功能方面，收縮功能代償性增加的優(yōu)勢消失，左室壁運動普遍減弱，射血乏力，從代償進(jìn)入失代償狀態(tài)。以上結(jié)果均證明了術(shù)后6 w充血性心力衰竭的存在。

小鼠主動脈弓縮窄模型由于操作者手法及小鼠個體差異性，致使獲得的實驗?zāi)Ｐ托氖曳屎衽c心衰出現(xiàn)的時間也各不相同[15]，模型廣泛應(yīng)用心衰發(fā)病機(jī)理及藥物治療的研究[16]，本實驗驗證了該模型早期表現(xiàn)出代償性心肌增厚以適應(yīng)后負(fù)荷增加，此階段與人類高血壓性心臟病相似。繼續(xù)發(fā)展可出現(xiàn)左心室舒張末期壓力增加，可能會造成舒張功能不全近年來舒張性心衰受到越來越多的關(guān)注，該模型的應(yīng)用也得到了認(rèn)可[17]。

心臟功能是臨床和科學(xué)研究的關(guān)鍵指標(biāo)。標(biāo)準(zhǔn)的左室M型超聲心動圖能夠檢測TAC小鼠的心臟收縮功能障礙。因尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)界定小鼠心臟大小及收縮功能正常值，所以本實驗以術(shù)前1 d小鼠數(shù)據(jù)為基數(shù)。小鼠的心臟大小因品系、性別和年齡而異，故對小鼠進(jìn)行舒張功能評估的可行性必須謹(jǐn)慎[18]。小鼠心臟的心尖視圖不易再現(xiàn)，頻譜采樣時二尖瓣血流方向與超聲束不平行，缺乏可靠的角度校正法。更重要的是，小鼠心率快常伴隨著二尖瓣E波和A波的融合。為了區(qū)分E波和A波，常需減慢心率，而通過麻醉劑減慢心率時對小鼠舒張功能是否有影響尚不清楚[19]，因而應(yīng)使用多種方法綜合評價左室舒張功能。王冠等[20]證實了左心房面積和IVRT的改變可能是小鼠充盈壓升高和舒張功能不全的早期標(biāo)志，而LVEDP升高可能提示舒張功能不全的晚期指標(biāo)，重申了用多種方法測定小鼠心臟舒張功能的優(yōu)勢。本次實驗以小鼠收縮功能指標(biāo)為重點，尚未全面驗證舒張功能指標(biāo)。

隨著最近的技術(shù)進(jìn)步，新發(fā)布的超聲系統(tǒng)提供了更高的圖像分辨率和幀頻率，以確保小動物的精準(zhǔn)定量測量。新的超聲心動圖技術(shù)也將進(jìn)一步增強(qiáng)超聲成像系統(tǒng)評價心臟功能的敏感性。例如，斑點追蹤應(yīng)變成像已被用于精確測量局部心肌功能。目前正在開發(fā)的新傳感器技術(shù)將為三維、四維成像提供更大的發(fā)展空間。

本實驗結(jié)果表明，結(jié)扎主動脈弓后心臟發(fā)生一系列因壓力負(fù)荷增加導(dǎo)致的心臟結(jié)構(gòu)功能變化，模型可用于舒張與收縮功能障礙性疾病的進(jìn)一步研究，超聲心動圖準(zhǔn)確反應(yīng)心臟結(jié)構(gòu)功能變化特征，是一種相對簡單和無創(chuàng)性的技術(shù)，可以在不影響血管通路的情況下評估小鼠的心臟結(jié)構(gòu)細(xì)微變化，超聲心動圖將為研究小鼠各種心血管疾病模型的評估提供更大的幫助。