任振堃，聶進(jìn)

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

高原地區(qū)具有的特殊低壓低氧的自然環(huán)境會對進(jìn)入該地區(qū)的非藏族人群造成各種損傷，如出現(xiàn)頭暈、惡心、失眠健忘、不由自主哭泣等癥狀，嚴(yán)重者會出現(xiàn)高原性腦水腫、肺水腫等致命性的疾病[1]。低壓低氧的高紫外線輻射會導(dǎo)致身體各組織中出現(xiàn)活性氧大量蓄積的現(xiàn)象，使其損傷DNA、核酸、蛋白質(zhì)等各種生物大分子，從而誘發(fā)組織損傷。有研究表明熱休克蛋白70(HSP70)具有重要的細(xì)胞作用，其在高原地區(qū)低壓低氧條件刺激下，應(yīng)激生成的HSP70可以提高機(jī)體對再次同類型刺激的耐受程度，從而使細(xì)胞能夠維持基本的生理代謝，增強(qiáng)細(xì)胞的有效生存率[2-5]。

實驗表明：HSP70是應(yīng)激反應(yīng)條件下機(jī)體活細(xì)胞對刺激產(chǎn)生的應(yīng)答物質(zhì)，能促使機(jī)體及細(xì)胞對低壓低氧環(huán)境應(yīng)激的適應(yīng)；低壓低氧環(huán)境應(yīng)激使HSP70的誘導(dǎo)應(yīng)激表達(dá)強(qiáng)烈；王曉林等[6]人發(fā)現(xiàn)熱休克反應(yīng)是哺乳動物對高海拔(缺氧)的一種適應(yīng)形式。低海拔哺乳動物進(jìn)入不同高海拔地區(qū)均出現(xiàn)不同程度的高原反應(yīng)，海拔與缺氧成正性相關(guān)，進(jìn)入高海拔地區(qū)機(jī)體細(xì)胞層面內(nèi)的HSP70誘導(dǎo)應(yīng)激表達(dá)越強(qiáng)，但海拔應(yīng)激存在閾值，超過閾值后其保護(hù)作用會極大減弱或消失。而HSP70的應(yīng)激改變?nèi)Q于轉(zhuǎn)錄及翻譯水平[7]。實驗證明HSP70敏感性較強(qiáng)單獨為一過性表達(dá)，而GRP78也是被人類較早發(fā)現(xiàn)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白之一，是與腫瘤及創(chuàng)傷應(yīng)激等相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激表達(dá)中含量比較高的一種葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白。從傳統(tǒng)模式生物(線蟲、非洲爪蟾等)到哺乳動物(小鼠、兔子、狗、獼猴)乃至人類，都存在與GRP78同源的一些基因?，F(xiàn)在主流研究多是關(guān)注葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRPs)在饑餓、缺氧、氧化應(yīng)激與炎癥、缺血再灌注等情況下，引起未折疊與錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔系統(tǒng)之中積累，同時又造成鈣離子平衡的混亂，從而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)啟動應(yīng)激，進(jìn)而誘導(dǎo)了GRPs基因的應(yīng)激表達(dá)，形成保護(hù)效應(yīng)[9-15]。GRP78作為在腫瘤缺氧和創(chuàng)傷應(yīng)激時，率先啟動的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白和駐留蛋白[8-15]是熱休克蛋白70家庭成員之一。HSP70與GRP78之間的存在著60%以上的氨基酸的序列同源性，不同種屬哺乳動物之間GRP78氨基酸序列高度同源，像爪蟾的GRP78序列和大鼠為90.7%，與人類的同源性為89.9%．故本實驗采用直接一步進(jìn)藏法和預(yù)留低海拔時原始血樣研究GRP78及HIF-1α、HSP70等的表達(dá)對初次入藏人群的保護(hù)作用，通過考察相關(guān)的生化指標(biāo)和蛋白表達(dá)的變化，一起闡明其保護(hù)作用機(jī)制。

1 材 料

1.1 試劑

人葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白-78(GRP78)ELISA酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(批號E20201210)購自江萊生物科技有限公司、HIF-1α ELISA酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(批號E20201210)購自江萊生物科技有限公司、人熱休克蛋白70(HSP70)ELISA酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(批號E20201210)購自江萊生物科技有限公司。

1.2 儀器

MuLISKANMK3多功能酶標(biāo)儀(Thermo公司)；LRH生化培養(yǎng)箱(上海-恒科科學(xué)儀器有限公司)；冷凍高速離心機(jī)(Thermo公司)。

1.3 一步法進(jìn)藏缺氧耐受實驗

由6名健康成年男女組成的旅行團(tuán)(49.67±12.45)歲，按照年齡性別分成3組男女各半，分為30～35歲組、50～55歲組、60～62歲組。分別于從低海拔出發(fā)當(dāng)天，到達(dá)西藏拉薩24、72、168 h后為限，分別進(jìn)行采集血清和血漿各2管/(人·次)，并存放于-30 ℃的冰箱內(nèi)待用。

1.4 蛋白表達(dá)水平的檢測

將在藏期間取樣-30 ℃的人體血清血漿標(biāo)本：(1)使用試劑盒自帶緩沖液把抗體液稀釋至1～10 μg/mL。在96孔板的反應(yīng)孔中加0.1 mL稀釋后的抗體，然后4 ℃過夜。次日棄去反應(yīng)孔內(nèi)的溶液，使用洗滌緩沖液洗洗滌3次；(2)加樣：加一定量的稀釋后的待檢樣品0.05 mL于上述已被包被之反應(yīng)孔之中，置于37 ℃恒溫孵育箱內(nèi)孵育1 h。然后洗滌(同時做好空白孔，陰性對照孔與陽性對照孔)；(3)加酶標(biāo)抗體：于各個反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(且過經(jīng)滴定后的稀釋度)0.05 mL。置于37 ℃恒溫孵育箱內(nèi)孵育0.5～1 h，然后進(jìn)行洗滌；(4)加底物液顯色：在各個反應(yīng)孔之內(nèi)加入當(dāng)天配制好的0.1 mL TMB底物溶液，37 ℃孵箱內(nèi)孵育10～30 min；(5)終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2 M硫酸0.05 mL；(6)結(jié)果判定：可用于白色背景，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450 nm(若以ABTS顯色，則410 nm)處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 通過ELISA酶聯(lián)免疫檢測法測定進(jìn)藏后不同時間的GRP78/HSP70/HIF-1α的熱休克反應(yīng)

因?qū)嶒炄巳阂?guī)模較小，可能對于結(jié)果造成偏移，以現(xiàn)有實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析可知：在男性人群進(jìn)藏后第3日表達(dá)最強(qiáng)，男性與女性組間在第3日的OD值無統(tǒng)計學(xué)意義，第3日后表達(dá)開始下降，在第10日左右表達(dá)低于女性；在女性人群進(jìn)藏后平均第7日表達(dá)最強(qiáng)，同時表達(dá)強(qiáng)度也低于男性；因年輕人群活動量較大，所以表達(dá)強(qiáng)度較中年、老年人群強(qiáng)烈，同時在第10日左右，因為機(jī)體適應(yīng)能力較強(qiáng)會造成表達(dá)強(qiáng)度開始大幅度低于中老年組，見表1、圖1。

表1 進(jìn)藏后不同組各時間點的GRP78的熱休克反應(yīng)的OD值

通過球形驗證證明，總體人群和男性人群的基于組別：測量時間的GRP78的表達(dá)差異(P>0.05)不具有統(tǒng)計學(xué)意義。而女性的基于組別：測量時間的GRP78的表達(dá)差異P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義，意味著GRP78的表達(dá)可能存在性別差異。

低海拔地區(qū)的男性女性在直接進(jìn)入高海拔的后據(jù)出現(xiàn)HSP70的強(qiáng)烈表達(dá)，年紀(jì)大的組別表達(dá)強(qiáng)度大于低年齡組。同時女性組表達(dá)強(qiáng)度高于男性組，且表達(dá)持續(xù)時間較長，男性中高年齡組基本上在10 d左右就恢復(fù)到內(nèi)地表達(dá)水平。而女性組較長期維持高于內(nèi)地的表達(dá)水平，見表2。

圖1 進(jìn)藏后不同組別時間的GRP78的熱休克反應(yīng)的OD值柱狀圖

表2 進(jìn)藏后不同組各時間點的HSP70的熱休克反應(yīng)的OD值

經(jīng)過球形檢驗證明組間對比，各時間點上存在顯著差異，組別：測量時間P<0.05?，F(xiàn)有結(jié)果顯示女性的HIF-1α的應(yīng)激表達(dá)較男性較晚，且最大表達(dá)強(qiáng)度略低。但是女性高表達(dá)時間較長，可以較長期(如1 w左右)維持。男性應(yīng)激表達(dá)啟動較快，但下降較快不能長期維持，見表3。

表3 進(jìn)藏后不同組各時間點的HIF-1α的OD值

經(jīng)過球形檢驗證明HIF-1α的表達(dá)在組別：測量時間方面P=0.993(P>0.05)不具備統(tǒng)計學(xué)意義，且經(jīng)過以性別分別建組驗證均未發(fā)現(xiàn)組別：測量時間方面存在具備統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 現(xiàn)有實驗組在高原上高原應(yīng)激反應(yīng)情況

因?qū)嶒灄l件所限造成樣本總量較小，實驗代表性與可靠性可能存在不足，通過現(xiàn)有實驗發(fā)現(xiàn)女性的缺氧耐受情況可能優(yōu)于男性，但存在女性在高原地區(qū)缺氧低壓環(huán)境下睡眠質(zhì)量較低的現(xiàn)象，高年齡組有出現(xiàn)需要內(nèi)地1倍以上的劑量的安眠藥保證睡眠的情況。同時，30～35歲組與50～55歲組因為活動量較大造成吸氧批次較高，但高年齡組因為總體活動量受限吸氧較少，見表4。

表4 進(jìn)藏后不組別高原反應(yīng)情況(0～10 d)

3 討 論

本文利用ELISA酶聯(lián)免疫檢測法等手段對高高原地區(qū)低壓低氧條件下誘導(dǎo)的熱休克反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行研究，并且利用相關(guān)實驗重現(xiàn)了驗證了處于高高原條件下時，因為急性相關(guān)高原反應(yīng)產(chǎn)生呼吸困難等臨床現(xiàn)象。同時因?qū)嶒灄l件所限樣本量較小，且使用的ELISA酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測精度、樣本保存運輸環(huán)境都可能造成樣本偏移，現(xiàn)有實驗結(jié)果表明：其可能是促使生物機(jī)體在細(xì)胞層面應(yīng)對低氧低壓環(huán)境的條件反應(yīng)產(chǎn)生的保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)，使機(jī)體及細(xì)胞在低壓低氧情況能夠有效活動及生存；低氧低壓環(huán)境的應(yīng)激條件下誘導(dǎo)得GRP78的表達(dá)效果強(qiáng)烈，是被公認(rèn)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激最敏感標(biāo)志性蛋白之一。哺乳動物在長期生存得相對低海拔地區(qū)快速由飛機(jī)等載體到達(dá)高海拔低壓低氧環(huán)境后，均會被誘導(dǎo)出現(xiàn)不同程度上不同種類的熱休克反應(yīng)。ELISA酶聯(lián)免疫檢測測定發(fā)現(xiàn)不同性別/不同年齡的人群在高海拔地區(qū)的表達(dá)量不同。以GRP78表達(dá)為例：其的表達(dá)存在性別差異性，在男性人群進(jìn)藏后第3日表達(dá)最強(qiáng)，第3日后表達(dá)開始下降，在第10日左右表達(dá)低于女性；在女性人群進(jìn)藏后平均第7日表達(dá)最強(qiáng)，同時表達(dá)強(qiáng)度也低于男性，且通過球形驗證證明，總體人群和男性人群的基于組別：測量時間的GRP78的表達(dá)差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。而女性的基于組別：測量時間的GRP78的表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。同時，意味著GRP78的表達(dá)可能存在性別差異。年輕人群表達(dá)強(qiáng)度較中年、老年人群強(qiáng)烈，第10日左右，因為機(jī)體適應(yīng)能力較強(qiáng)會造成表達(dá)強(qiáng)度開始大幅度低于中老年組而差異顯著。實驗結(jié)果顯示：高原缺氧環(huán)境可以使人群的外周血液中GRP78的表達(dá)顯著升高，而在平原低海拔地區(qū)人群如果無炎癥、腫瘤等外源性因素，其外周血液中GRP78表達(dá)水平較低。通過ELISA酶聯(lián)免疫檢測測定，原生低海拔人群直接進(jìn)入高原地區(qū)，在低壓低氧條件下，原生低海拔人群的GRP78熱休克蛋白會由于缺氧應(yīng)激而出現(xiàn)高表達(dá)，且男女差異較大維持時間及反應(yīng)表達(dá)峰值均出現(xiàn)性別差異。說明機(jī)體為了維持缺氧環(huán)境下的有效生存會在一定程度上通過GRP78的快速而有效表達(dá)于維持機(jī)體在細(xì)胞水平上的正常生理功能。