朱艷芳，朱 斌，梁志鵬，董 慶，薛 濤，盛 瑋

（1.淮北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 淮北 235000；2.安徽省特色資源植物利用工程實(shí)驗(yàn)室，安徽 淮北 235000）

0 引言

半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit為天南星科半夏屬多年生草本植物，其塊莖為主要的藥用部位，是一種常用的中草藥. 半夏在中藥處方中的使用率位居前列，有著很高的藥用價(jià)值［1］. 半夏始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，中國藥典記載其功效為燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)等，可用于治療濕痰寒痰、咳喘痰多、痰飲眩悸、風(fēng)痰眩暈、痰厥頭痛、嘔吐反胃、胸脘痞悶、梅核氣等，外治癰腫痰核. 現(xiàn)代臨床應(yīng)用中，證明半夏具有治療惡性腫瘤的重要作用［2］. 目前，普遍認(rèn)為半夏提取物以及半夏化學(xué)成分中的半夏蛋白、半夏總生物堿、谷甾醇和半夏多糖等都具有抗腫瘤作用［3］.

半夏蛋白是半夏的主要藥效成分之一，主要由半夏胰蛋白酶抑制劑和半夏凝集素組成［4］. 半夏凝集素屬于單子葉甘露糖凝集素，能夠識(shí)別并特異性的結(jié)合甘露糖，具有抑菌、殺蟲、凝血和抗腫瘤等多種生理功能［5-10］. 由于半夏凝集素的生理功能多樣，對(duì)半夏凝集素的研究一直是個(gè)熱點(diǎn)，其研究多集中于對(duì)該蛋白的提取純化［4，11］、功能研究［3-4，12］、基因克隆［13］、異源轉(zhuǎn)化［8，14］等方面. 宿半夏是分布于皖北的道地藥材，尚未見針對(duì)宿半夏凝集素的相關(guān)報(bào)道. 因此，本研究以宿半夏的塊莖為試驗(yàn)材料，對(duì)其凝集素基因進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究宿半夏凝集素及深入開發(fā)宿半夏資源利用奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用半夏為安徽道地藥材宿半夏P.ternata的新鮮塊莖. 宿半夏塊莖盆栽于淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，以盆栽宿半夏葉柄為外植體，經(jīng)消毒后接種于MS基本培養(yǎng)基，獲得宿半夏無菌苗，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光暗周期為12 h/12 h，光照強(qiáng)度為2 000 lx.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取、檢測(cè)及反轉(zhuǎn)錄

以無菌組培的半夏新鮮塊莖為材料，上海生工Total RNA Extractor（Trizol）試劑提取新鮮塊莖總RNA，利用微量分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA 的質(zhì)量和濃度. 高質(zhì)量的RNA 用莫納生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，-70 ℃保存?zhèn)溆?

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)半夏塊莖發(fā)育轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)合Genbank數(shù)據(jù)庫登錄半夏屬凝集素基因序列，設(shè)計(jì)半夏凝集素基因（PtPTA）上下游引物，用于半夏凝集素基因的克隆，引物序列為：

PTA-F：5’-ATGGCCTCCAAGCTCCTCCTC-3’

PTA-R：5’-TTAATTCACCTTCTCCGTCACCATG-3’

1.2.3PtPTA克隆、膠回收及測(cè)序

以cDNA為模板，PTA-F、PTA-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng). PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%瓊脂糖凝膠電泳，回收純化目標(biāo)基因，并與克隆載體pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，37 ℃在含Amp的LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng). 以載體通用引物做菌落PCR檢測(cè)，將陽性轉(zhuǎn)化子送通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司測(cè)序.

1.2.4 生物信息學(xué)分析

將測(cè)序獲得的PtPTA序列進(jìn)行在線分析和軟件分析：用NCBI ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）在線查找序列的最大開放閱讀框；用在線分析工具ProtParam（http：//www.expasy.ch/tools/protparam/html）分析蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)；在NCBI 網(wǎng)站的Conserved Domain Database 數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）分析蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域；用DNAMAN 軟件將天南星科不同來源的數(shù)種凝集素蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多序列比對(duì)（參數(shù)均為默認(rèn)值）；用MEGA7.0 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（Bootstrap 為1 000）；用WoLF PSORT（http://wolfpsort.hgc.jp）對(duì)該蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；用TMHMM Serer V2.0對(duì)蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；用SOMPA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；用SWISS-MODEL（https：//www.expasy.org/resources/swiss-model）在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的3D結(jié)構(gòu).

2 結(jié)果與分析

2.1 半夏塊莖總RNA質(zhì)量檢測(cè)

電泳檢測(cè)提取半夏塊莖RNA 質(zhì)量，結(jié)果如圖1 所示. 分別得到3 條清晰的RNA 條帶，即28S、18S 和5S RNA條帶，其中28S RNA 條帶的亮度是18S RNA條帶亮度的2倍，說明提取的總RNA完整性好，幾乎無降解. 超微量分光光度計(jì)檢測(cè)樣品RNA的A260/A280為1.913，A260/A230為0.998，結(jié)果顯示樣品的RNA純度高，污染少，可用于后續(xù)的基因克隆實(shí)驗(yàn).

圖1 RNA凝膠電泳圖

2.2 半夏凝集素基因（PtPTA）的克隆及測(cè)序

以cDNA為模板，以PTA-F，PTA-R為引物，PCR 擴(kuò)增PtPTA. 將PCR產(chǎn)物凝膠電泳，其電泳結(jié)果如圖2所示. 與Marker相比，在750 bp和1 000 bp之間有一條明亮的帶，得到約800 bp特異片段.

圖2 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果圖

對(duì)PCR擴(kuò)增所得條帶膠回收并測(cè)序，獲得一條開放閱讀框全長為810 bp的序列，編碼269個(gè)氨基酸（圖3）. 將目的基因編碼的蛋白質(zhì)與NCBI中登錄的其它6種半夏植物凝集素蛋白進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果顯示，幾種半夏植物凝集素的同源性比較高，一致性達(dá)到97.82%（圖4）.

圖3 PtPTA全長cDNA序列及其推導(dǎo)氨基酸序列

2.3 PtPTA編碼蛋白（PTA）特性分析

2.3.1 PTA理化性質(zhì)

理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，PTA 蛋白的分子式為C1305H2028N354O391S11，由269 個(gè)氨基酸殘基組成，總分子量為29 285.25，理論等電點(diǎn)（pI）為6.58；帶負(fù)電氨基酸殘基（Asp+Glu）總數(shù)為23，帶正電氨基酸殘基（Arg+Lys）總數(shù)為22. 不穩(wěn)定系數(shù)為25.30，脂肪系數(shù)為87.70，親水性系數(shù)為-0.161，屬于穩(wěn)定的親水性蛋白.

2.3.2 PTA的跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)

用TMHMM預(yù)測(cè)PTA的N-端第5～27 個(gè)氨基酸殘基位于跨膜區(qū)域（圖5），說明PTA屬于跨膜蛋白，推測(cè)PTA 可能定位于細(xì)胞膜上，屬于分泌蛋白.用WoLF PSORT 預(yù)測(cè)該蛋白亞細(xì)胞定位于細(xì)胞外，與TMHMM預(yù)測(cè)相一致.SignalP預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)有信號(hào)肽的概率為99.700%，信號(hào)肽類型為SP（Sec/SPI），切割位點(diǎn)位于第24位丙氨酸A和第25為纈氨酸V殘基之間，信號(hào)肽序列為:MASKLLLFLLPAILGLVIPPAATA.

圖5 PTA跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)分析

2.3.3 PTA疏水性分析

通過Protscale 對(duì)PTA 的疏水性進(jìn)行預(yù)測(cè)表明，多肽鏈第6 位的亮氨酸（Leu，L）具有最高分值2.98，第182位的賴氨酸（Lys，K）具有最低的分值-2.19. 已知氨基酸分值越低親水性越強(qiáng)，反之分值越高疏水性越強(qiáng)，可以得出在第182位的Lys親水性最強(qiáng)，第6位的Leu疏水性最強(qiáng). 從圖6中可以看出，該蛋白質(zhì)N-端部分氨基酸殘基和中間區(qū)域的部分氨基酸殘基是由一些疏水性氨基酸組成，其余區(qū)域主要由親水性氨基酸組成. 從整體看，其疏水性氨基酸少于親水性氨基酸，所以推測(cè)其為親水性蛋白.

圖6 PTA疏水性分析

2.3.4 PTA結(jié)構(gòu)域分析

NCBI在線分析PTA結(jié)構(gòu)域，如圖7所示，該蛋白質(zhì)包括2個(gè)B-lectin結(jié)構(gòu)域，屬于B-lectin超家族，且包含3個(gè)甘露糖結(jié)合位點(diǎn)，見圖4中黑色下劃線標(biāo)示序列. 由圖4可知，3個(gè)甘露糖結(jié)合位點(diǎn)的保守性不同，第1和第2個(gè)甘露糖結(jié)合位點(diǎn)保守性高，而第3個(gè)甘露糖結(jié)合位點(diǎn)氨基酸組成差異大，保守性低，說明不同半夏植株的凝集素仍存在一定差異.

圖7 PTA結(jié)構(gòu)域

2.3.5 PTA二級(jí)結(jié)構(gòu)及三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

用SOPMA在線預(yù)測(cè)PTA二級(jí)結(jié)構(gòu)見圖8，PTA二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是無規(guī)則卷曲，占據(jù)45.72%的氨基酸殘基；其次是β-折疊，占據(jù)33.46%的氨基酸殘基；α-螺旋占據(jù)11.15%的氨基酸殘基；最少的是β-轉(zhuǎn)角，占據(jù)9.67%的氨基酸殘基. α-螺旋主要位于蛋白質(zhì)的兩端，β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲散布在蛋白質(zhì)中間.

圖8 PTA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過SWISS-MODEL 在線比對(duì)，發(fā)現(xiàn)PTA 有2 個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別比對(duì)到氨基酸序列相似度都在80%以上的高度相似的模板，模板分別是Structure of Lectin fromColocasia esculenta（L.）Schott（SMTL ID：5j76.1）和Structure ofColocasia esculentaagglutinin（SMTL ID：5d5g.2），分別是芋的貯藏蛋白植物凝集素和芋塊莖凝集素. 以2個(gè)已知蛋白模型為基礎(chǔ)，預(yù)測(cè)PTA兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的3D結(jié)構(gòu)見圖9，A是1～109個(gè)氨基酸形成結(jié)構(gòu)域的3D結(jié)構(gòu)，B是117～227個(gè)氨基酸形成結(jié)構(gòu)域的3D結(jié)構(gòu).

圖9 PTA三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.3.6 PTA系統(tǒng)進(jìn)化

從NCBI 數(shù)據(jù)庫中選取12 條凝集素蛋白與PTA 進(jìn)行相似性比較，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖10）. 結(jié)果表明：本次克隆的宿半夏凝集素基因編碼的蛋白PTA 與其他6 種半夏凝集素AAR27794.1、ABX47148.1、AAU29612.1、AFY06641.1、QNL35375.1和AAP20876.1遺傳關(guān)系近，聚為一支，與海芋凝集素ABC69036.1的關(guān)系最遠(yuǎn). 說明半夏凝集素的進(jìn)化關(guān)系與物種進(jìn)化關(guān)系基本一致. 半夏凝集素與掌葉半夏凝集素AAR27793.1聚為一大支，與石蜘蛛凝集素AOA49622.1未聚在一起，還有一種半夏凝集素AEZ35184.1未與多種半夏凝集素聚合在一起.

圖10 利用NJ法構(gòu)建植物凝集素間的進(jìn)化樹

3 討論和結(jié)論

植物凝集素是一類分布廣泛的非免疫來源的糖結(jié)合蛋白，由于其具有顯著的生物活性而得到廣泛的研究和應(yīng)用. 植物凝集素可以通過識(shí)別并結(jié)合動(dòng)物、昆蟲腸胃及微生物表面特異性糖基，從而發(fā)揮促進(jìn)有絲分裂、抗氧化、抗腫瘤、降血糖、抗菌、殺蟲、抗病毒等活性［15］；也可以提高植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力，如耐旱、耐鹽、耐熱性［16］；植物凝集素廣泛存在于植物的各種組織器官中，在根、莖、葉、花、果實(shí)中都能被檢測(cè)到，以種子和營養(yǎng)貯存器官（如塊莖、鱗莖、塊根）中最為豐富，參與植物的生長發(fā)育過程［17］.

半夏凝集素（Pinellia ternataagglutinin，PTA）是一種典型的具有甘露糖結(jié)合位點(diǎn)的植物凝集素［4］，屬于雪花蓮家族（GNA）的凝集素［18］. 半夏蛋白具有很多生理功能，其中半夏凝集素是半夏蛋白發(fā)揮其生理功能的重要成分之一. 盡管對(duì)不同產(chǎn)地的半夏凝集素開展一定的研究［4，13，18-19］，但是由于半夏的高度遺傳多樣性，不同半夏之間遺傳物質(zhì)有一定的差異［20］. 宿半夏的凝集素至今未見報(bào)道，本研究克隆宿半夏的凝集素基因，為宿半夏凝集素的應(yīng)用及優(yōu)良品種選育提供參考.

本試驗(yàn)成功克隆半夏塊莖中的凝集素基因，其開放閱讀框長度為810 bp，編碼269個(gè)氨基酸，分子量為29 285.25，等電點(diǎn)為6.58，具有典型的跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于跨膜親水蛋白，預(yù)測(cè)定位于細(xì)胞膜，與趙歡等［18］研究結(jié)果PTA亞細(xì)胞定位于細(xì)胞膜上相一致. 多序列比對(duì)結(jié)果顯示該蛋白與其他6種半夏植物凝集素氨基酸序列具有高度的相似性，相似度達(dá)97.82%，說明不同半夏植株的凝集素序列具有高度的保守性，該結(jié)果與趙歡［18］的研究結(jié)果一致. 不同產(chǎn)地、不同生境下，不同半夏植株的半夏凝集素也存在一定差異，尤其第3個(gè)甘露糖結(jié)合位點(diǎn)存在較大差別，該結(jié)果與張正英［13］研究結(jié)果一致，同樣也說明半夏的遺傳多樣性.

通過比對(duì)，本次克隆的宿半夏PTA與趙歡等［18］克隆的半夏凝集素蛋白序列（AGV40777.1）完全一致，趙歡所用材料是川半夏的主產(chǎn)區(qū)四川省南充市的野生半夏葉片DNA，本研究用的材料是安徽省淮北市道地藥材宿半夏塊莖RNA，兩半夏材料生境差別大，川半夏基因組的半夏凝集素和宿半夏塊莖中表達(dá)的半夏凝集素的氨基酸序列完全相同，那么2種半夏塊莖中凝集素的含量是否相同，其他藥效成分含量是否相近，2種半夏能否互相替代，還有待于進(jìn)一步深入研究. 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，大部分半夏凝集素聚合在一起，唯有半夏凝集素AEZ35184.1游離在外，分析發(fā)現(xiàn)半夏凝集素AEZ35184.1是由257個(gè)氨基酸組成，與半夏PTA 的一致性為91.88%. 而趙歡等［21］認(rèn)為半夏凝集素PTA 的氨基酸序列長度為268-269aa，半夏凝集素AEZ35184.1還有待于進(jìn)一步分析.