陳雪梅，陳春樺，楊治華，袁中勛，陳張婷，李昌曉

1. 西南大學 生命科學學院， 重慶 400715；2. 重慶市北碚區(qū)王樸中學校， 重慶 400717

三峽工程完全建成后， 在“冬蓄夏排”的水位調(diào)度方式下， 形成了垂直落差達30 m的消落帶． 庫區(qū)消落帶原有的植物因受到長時間反季節(jié)水淹而大量消亡， 進而導致消落帶生物多樣性降低， 水土流失加劇， 生態(tài)屏障功能減退． 研究表明人工植被修復與重建是恢復消落帶植被的有效方法． 落羽杉Taxodiumdistichum(L.) Rich.耐水淹能力強， 在三峽消落帶的生長表現(xiàn)良好， 是消落帶植被修復重建的首選樹種之一[1-4]， 目前已被廣泛用于消落帶植被修復重建項目中． 然而， 當前用于消落帶植被修復重建的落羽杉苗木基本上來自省外采購， 病蟲害發(fā)生率較高， 苗木質(zhì)量參次不齊， 一級苗占比較低， 運輸、 栽植及管護成本居高不下． 落羽杉為杉科(Taxodiaceae)落羽杉屬(TaxodiumRich.)落葉性大喬木， 樹干通直， 基部常較粗大， 原產(chǎn)地位于北美， 現(xiàn)已廣泛引種到世界各地[5]． 落羽杉的種子繁殖實驗表明， 因種皮太厚且種子具有明顯銳利的棱脊， 發(fā)芽率低， 利用種子大規(guī)模繁殖較為困難[6]． 與此同時， 落羽杉的扦插繁殖也存在插穗數(shù)量受限、 時間耗費較長、 成本較高、 采條部位對插苗的性狀表現(xiàn)影響較大等諸多問題[7]． 因此， 組織培養(yǎng)已經(jīng)成為落羽杉種苗擴繁的重要途徑． 如果將長期處于三峽庫區(qū)消落帶水淹—落干—水淹—落干逆境條件且已完全適應的落羽杉人工林作為組培外植體， 無疑將會明顯加快所需落羽杉種苗的繁育速度并提高繁育成效． 組織培養(yǎng)繁殖速度快、 不受季節(jié)限制、 能保存母本的全部優(yōu)良性狀[8-12]． 在組織培養(yǎng)時， 對于不同物種外植體的選取不盡相同[13-14]， 通常用于組織培養(yǎng)的外植體主要有胚軸、 葉片、 葉柄、 莖段等． 目前落羽杉的組織培養(yǎng)多采用種子成熟胚或幼苗為外植體[15-16]， 這對于三峽庫區(qū)消落帶而言， 這些外植體來源受到明顯的限制(種子及幼苗極少)． 相反， 如果以三峽庫區(qū)消落帶現(xiàn)有長勢良好的落羽杉莖段為外植體來源， 則可以獲得大量來自于消落帶原位生境的組培材料， 進而為三峽庫區(qū)消落帶提供大量落羽杉良種壯苗， 為三峽庫區(qū)消落帶生態(tài)修復與重建所需種苗做出切實貢獻． 當前， 有關以三峽庫區(qū)消落帶現(xiàn)有適生的落羽杉莖段為外植體來源進行組培的研究還未見報道． 因此， 本文以生長于三峽庫區(qū)消落帶原位的10年生落羽杉優(yōu)株為試驗材料， 選取落羽杉莖段為外植體進行組織培養(yǎng)， 探索三峽庫區(qū)消落帶落羽杉外植體的最佳組培實踐技術， 以期為三峽庫區(qū)消落帶原位生長的落羽杉優(yōu)株快速擴繁提供技術支撐．

1 材料與方法

1.1 外植體類型的篩選

試驗材料選自三峽庫區(qū)重慶市忠縣石寶鎮(zhèn)汝溪河消落帶落羽杉人工林． 在165～175 m海拔之間選擇長勢良好的10年生落羽杉隨機剪取樹冠中部的當年生未木質(zhì)化枝條、 半木質(zhì)化枝條， 長約15 cm， 及時噴水保濕， 24 h內(nèi)帶回實驗室處理． 剪去針狀葉片， 用洗衣粉清洗3遍， 置于水龍頭下沖洗2 h． 用75%的乙醇漂洗30 s， 無菌水沖洗3次， 再用0.1% HgCl2消毒3 min， 無菌水沖洗3～5次， 切割成2～3 cm的莖段， 接種到MS培養(yǎng)基上． 本試驗隨機設置3個重復小區(qū)， 每個小區(qū)接種外植體70個， 每個處理共接種外植體210個， 培養(yǎng)15 d后觀察統(tǒng)計外植體的存活率和污染率．

1.2 外植體部位的篩選

根據(jù)1.1試驗結果， 選取最佳外植體類型， 消毒方法同1.1， 將其切割分為上、 中、 下3部分， 分別接種到MS培養(yǎng)基上． 隨機設置3個重復小區(qū)， 每個小區(qū)接種外植體16個， 每個處理共接種外植體48個， 培養(yǎng)15 d后觀察統(tǒng)計外植體的存活率和污染率．

1.3 表面消毒劑和消毒時間的篩選

根據(jù)1.2試驗結果， 選取明確的最佳外植體部位， 在無菌條件下， 先用75%的乙醇消毒不同時間(10 s， 20 s， 30 s， 40 s)， 無菌水沖洗3次后接種到MS培養(yǎng)基中． 選擇乙醇的最佳消毒時間進行第1次消毒后分別用2% NaCIO， 5% NaCIO， 0.1% HgCl2消毒不同時間(1 min，1.5 min，2 min，2.5 min，3 min)， 無菌水沖洗3～5次． 切割成2～3 cm長的莖段， 接種于MS培養(yǎng)基中． 隨機設置3個重復小區(qū)， 每個小區(qū)接種外植體8個， 每個處理共接種24個外植體， 培養(yǎng)15 d后觀察統(tǒng)計外植體的存活率和污染率．

1.4 抑菌劑的篩選

選取1.2試驗結果中最佳外植體部位， 選取1.3中明確的最佳消毒方法， 培養(yǎng)基中分別加入PPM(0.1%， 0.2%， 0.4%)和益培靈(0.05 g/L， 0.1 g/L， 0.2 g/L)， 隨機設置3個重復小區(qū)， 每個小區(qū)接種外植體8個， 每個處理共接種24個外植體， 培養(yǎng)25 d后觀察統(tǒng)計外植體的存活率和污染率．

1.5 落羽杉莖段腋芽的誘導

選取1.2試驗結果中最佳外植體部位， 選取1.3中明確的最佳消毒方法， 之后切成2～3 cm的莖段， 培養(yǎng)基中加入0.2% PPM， 接種到以下含不同植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中： MS+激動素(KT)(0.5 mg/L， 1 mg/L， 2 mg/L)+萘乙酸(NAA)(0.1 mg/L， 0.2 mg/L， 0.4 mg/L)． 隨機設置3個重復小區(qū)， 每個小區(qū)接種外植體8個， 每個處理共接種24個外植體， 培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計腋芽的誘導率、 繁殖系數(shù)和生長狀況．

1.6 落羽杉叢芽誘導

誘導出的莖段腋芽約長至2 cm時， 接種到以下含不同植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中， DCR+6-芐氨基嘌呤(6-BA)(0.5 mg/L， 1 mg/L)+吲哚丁酸(IBA)(0.2 mg/L， 0.4 mg/L， 0.6 mg/L)；1/2 MS+6-BA(0.5 mg/L， 1 mg/L)+IBA(0.2 mg/L， 0.4 mg/L， 0.6 mg/L)， 均去除細胞分裂素濃度低于生長素濃度的組合． 隨機設置3個重復小區(qū)， 每個小區(qū)接種外植體4個， 每個處理共接種12個外植體， 培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計叢芽的誘導率、 繁殖系數(shù)和生長狀況．

1.7 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基含蔗糖30 g/L， 瓊脂6.5 g/L， pH值為5.8． 培養(yǎng)溫度為(25±1)℃， 光照強度為30 μmol/(m2·s)， 光照時間12 h/d．

1.8 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Excel 2010和SPSS 22.0 軟件對測定的原始數(shù)據(jù)進行處理， 采用獨立樣本t檢驗和單因素方差(One-way ANOVA)進行統(tǒng)計分析． 單因素方差分析采用Duncan多重比較(Duncan’s multiple range test)進行顯著性檢驗， 顯著性水平設為α=0.05． 所有圖像均用Origin 9.0(Origin lab Corporation)軟件制圖．

2 結果

2.1 落羽杉外植體類型的篩選

從表1可以看出， 未木質(zhì)化莖段的存活率和污染率與半木質(zhì)化莖段差異有統(tǒng)計學意義． 半木質(zhì)化莖段的污染率達到了71.24%， 而未木質(zhì)化莖段的污染率卻只有21.91%， 提高了2.25倍． 試驗觀察記錄也發(fā)現(xiàn)， 半木質(zhì)化莖段絕大部分長菌， 未木質(zhì)化莖段長菌較少． 與此同時， 半木質(zhì)化莖段的存活率只有19.05%， 與未木質(zhì)化莖段的存活率達到60%相比， 降低了2.15倍． 因此， 以存活率和污染率綜合評判， 未木質(zhì)化莖段為最佳的外植體類型．

表1 不同外植體類型的污染率和成活率

2.2 外植體部位的篩選

將外植體切割成上、 中、 下3部分之后， 分別接種于培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)15 d后觀察統(tǒng)計外植體的存活率和污染率． 對存活率和污染率方差分析結果進行比較發(fā)現(xiàn)(表2)， 3個部位莖段的存活率相互之間差異無統(tǒng)計學意義；盡管中部莖段的存活率最高且達到41.67%， 但與上部和下部莖段的存活率相差不大． 相反， 下部莖段的污染率和上部、 中部莖段相比差異均具有統(tǒng)計學意義， 下部莖段污染率為50.00%， 達到最高， 顯著高出中部0.33倍， 高出上部0.85倍． 因此， 基于存活率和污染率進行綜合判定， 莖段中部為外植體最佳選取部位．

表2 外植體不同部位處理的存活率和污染率

2.3 表面消毒劑和消毒時間的篩選

經(jīng)消毒處理的外植體在培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d后， 其存活率和污染率情況分別見表3和表4． 結果表明， 不同種類及濃度的消毒劑對外植體的污染率和存活率影響差異有統(tǒng)計學意義． 由表3可知， 用75%乙醇溶液漂洗30 s時存活率最高(29.17%)， 漂洗10 s， 20 s時外植體全部長菌污染死亡． 用75%乙醇溶液漂洗40 s時污染率最低(37.50%)， 但其存活率較30 s時有所下降． 由表4可知， 當用2% NaCIO消毒1 min， 1.5 min， 在第5d， 6 d時外植體就會全部長菌． 消毒時間延長至3 min時， 污染率依舊達到83.33%． 增加NaCIO的濃度到5%后， 在相同的消毒時間內(nèi)， 隨著NaCIO濃度的升高消毒效果明顯增強， 消毒時間為3 min時效果最好， 污染率降到41.67%， 存活率也提高到45.83%． 用0.1% HgCI2漂洗1 min時外植體全部長菌， 隨著HgCI2消毒時間的延長， 污染率逐漸降低， 漂洗3 min時是所有消毒處理中效果最好的， 污染率降至33.33%． 綜上所述， 在本試驗中， 先用75%乙醇漂洗30 s， 再用0.1% HgCI2消毒3 min是落羽杉莖段消毒的最佳處理方法．

表3 乙醇消毒時間對外植體消毒效果的影響

表4 消毒試劑次氯酸鈉(NaCIO)與氯化汞(HgCI2)在不同消毒時間條件下對外植體消毒效果的影響

2.4 抑菌劑對外植體存活率和污染率的影響

將消毒過后的外植體接種至加入了抑菌劑的培養(yǎng)基中， 結果表明， 加入抑菌劑組和對照組(CK)相比存活率、 污染率差異均有統(tǒng)計學意義(表5)． 與對照組相比， 加入抑菌劑后的處理組污染率顯著降低， 其中0.2% PPM組污染率最低， 只有16.67%． 盡管加入0.2 g/L益培靈處理組污染率最高， 達到33.33%， 但仍然顯著低于對照組． 相應地， 各處理組存活率與對照組相比顯著提高， 存活率提高最大的是培養(yǎng)基中加入0.2% PPM處理組， 其存活率達到75.00%， 高出對照組1.25倍；即使是存活率提高最低的0.05 g/L益培靈處理組， 存活率也達到了50.00%， 高出對照組0.5倍．

表5 不同抑菌劑對外植體存活率和污染率的影響

2.5 落羽杉莖段腋芽的誘導

將消毒過后的外植體接種到腋芽誘導培養(yǎng)基中， 結果表明， 不同植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度組合顯著影響莖段腋芽的誘導(表6)． 由表6可知， 與不加激素(圖1a)相比， 單一激素也能誘導腋芽萌發(fā)， 并隨著NAA濃度的升高萌發(fā)率也升高， MS+0.4 mg/L NAA處理組的萌發(fā)率達到25.00%． 混合激素對腋芽萌發(fā)的效果更好， 當KT濃度為0.5 mg/L時， 隨著NAA濃度的升高， 腋芽萌發(fā)率和繁殖系數(shù)均升高， 萌發(fā)率最高達到66.67%(圖1b)， 繁殖系數(shù)達1.50倍． 當KT濃度為2 mg/L時， 隨著NAA濃度的升高， 腋芽萌發(fā)率和繁殖系數(shù)均下降， 萌發(fā)率最高為33.50%， 繁殖系數(shù)最高為1.00倍． 當NAA濃度為0.1 mg/L時， 隨著KT濃度的升高， 萌發(fā)率和繁殖系數(shù)呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢， 當NAA濃度為0.2 mg/L和0.4 mg/L時， 萌發(fā)率和繁殖系數(shù)均隨著KT濃度的升高呈現(xiàn)下降的趨勢． 在本次試驗中， 從繁殖系數(shù)和萌發(fā)率來看， 最適合落羽杉腋芽誘導的培養(yǎng)基為A6， 即MS+0.5 mg/L KT+0.4 mg/L NAA， 且腋芽生長較快， 其次為A5．

表6 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對落羽杉莖段腋芽的誘導

圖1 落羽杉莖段腋芽誘導

2.6 落羽杉叢芽誘導

以落羽杉腋芽(無菌苗)為外植體接種到設定的誘導培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)， 結果表明， 不同基本培養(yǎng)基和不同植物生長調(diào)節(jié)劑種類、 濃度組合顯著影響落羽杉叢芽的誘導(表7， 圖2)． 比較B1-B6可知， 除B5外， 加入激素的處理組叢芽誘導率和繁殖系數(shù)均比不加激素的高；當6-BA濃度一定時， 叢芽的誘導率和繁殖系數(shù)隨著IBA濃度的升高而降低；當IBA濃度一定時， 6-BA濃度越高誘導率和繁殖系數(shù)越低， 誘導率最高達75.00%， 繁殖系數(shù)最高為2.25倍． 比較B7-B12可知， 當6-BA濃度為0.5 mg/L時， 隨著IBA濃度的升高， 誘導率和繁殖系數(shù)也升高． 當6-BA濃度為1 mg/L時， 隨著IBA濃度的升高， 誘導率和繁殖系數(shù)先升高后降低． 當IBA濃度一定時， 誘導率和繁殖系數(shù)均隨著6-BA濃度的升高而降低． 誘導率最高為83.33%， 繁殖系數(shù)最高為2.58倍． 綜合繁殖系數(shù)、 叢芽誘導率、 單芽總數(shù)等指標， 腋芽叢芽在B8培養(yǎng)基中誘導率和繁殖系數(shù)最高， 顯著高出其他處理組， 而且B8的叢芽長勢和生長狀態(tài)相較更好， 因此腋芽叢芽誘導最佳的培養(yǎng)基為B8， 即1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.4 mg/L IBA， 其次為B1和B3．

表7 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對叢芽誘導的影響

圖2 叢芽誘導

3 討論

3.1 落羽杉莖段外植體的初代培養(yǎng)

試驗研究發(fā)現(xiàn)， 與大多數(shù)植物一樣， 在落羽杉組織培養(yǎng)過程中， 外植體污染是普遍遇到的難題， 若外植體材料污染的問題無法得到有效解決， 則將十分影響后續(xù)階段培養(yǎng)步驟的進行[17-18]． 所以科學合理的消毒滅菌步驟顯得尤為重要． 獲取外植體的環(huán)境條件、 取材部位、 取材時間以及接種時操作是否規(guī)范都會對外植體的帶菌情況造成影響， 尤其是長期生長在室外環(huán)境條件下的植物自身易攜帶大量的細菌微生物， 表面消毒時化學消毒劑很難將其徹底殺死[19-20]． 目前許多外植體消毒都是用單一的消毒劑進行消毒， 不能達到良好的效果． 組織培養(yǎng)常用的消毒劑有乙醇、 次氯酸鹽、 HgCl2、 過氧化氫等． 75%的乙醇具有一定的殺菌力， 而且具有濕潤作用， 可排除掉植物材料上的空氣， 利于與其他消毒劑配合使用[21]． 次氯酸通過侵入細胞內(nèi)與蛋白質(zhì)發(fā)生氧化作用或破壞其磷酸脫氫酶， 使糖代謝失調(diào)而致細胞死亡；HgCl2中的Hg2+可與帶負電的細菌蛋白質(zhì)結合， 使蛋白變性， 酶蛋白失活， 進而使細胞致死[22]． 本試驗采用了乙醇與HgCl2和NaCIO聯(lián)合消毒的方式， 大大提高了消毒的效果． 試驗結果顯示， 2%的NaCIO滅菌效果差， 增大濃度到5%之后隨著消毒時間的延長， 污染率出現(xiàn)明顯的降低， 但在相同的消毒時間內(nèi)效果不如0.1% HgCl2， 這與茶條槭(Acerginnala)外植體消毒效果相似[23]． 這極有可能是因為NaCIO滅菌作用較溫和且容易去除， 配置后穩(wěn)定性較差， 容易分解． 在試驗過程中還發(fā)現(xiàn)， 雖然采取聯(lián)合消毒的方式對外植體進行消毒的效果更好， 但總體的污染率還是很高， 部分外植體在接種1個月后有腋芽萌動時還會出現(xiàn)污染， 給后續(xù)試驗帶來很大程度的干擾． 因此， 在初代培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基中有必要加入一定濃度的植物抗菌劑來抑制外植體攜帶的各種微生物污染． 植物抑菌劑可以有效抵制酶催化作用， 影響菌體細胞壁的合成， 最終導致微生物生長受阻[24]． 加入抑菌劑后， 外植體污染率大大降低， 這與辣木(MoringaoleiferaLam.)結果相似[25]． 本次試驗中雖然提高了NaCIO的濃度， 但是沒有延長消毒時間， 在接下來的試驗中我們將考慮延長NaCIO消毒的時間， 觀察其滅菌效果．

3.2 落羽杉莖段腋芽的誘導

通過腋芽增殖和間接器官發(fā)生的方法建立腋芽增殖體系， 能否成功誘導出腋芽是其中關鍵的一步[26]． 在落羽杉莖段腋芽誘導階段一般采用細胞分裂素與生長素相結合的辦法． 落羽杉屬常用的激素有6-BA， NAA， KT， ZT等[16， 27]． 在墨西哥落羽杉組織培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)其對6-BA的濃度變化較為敏感， 濃度達到1～2 mg/L就會出現(xiàn)誘導率降低， 甚至出現(xiàn)玻璃化、 白化芽的現(xiàn)象[28]． 激動素(Kinetin)是一種非天然的細胞分裂素， 它可以促進細胞分化、 分裂、 生長， 誘導組織長芽， 解除頂端優(yōu)勢． 它的活性比腺嘌呤更高， 一般用來促進生芽[29]． NAA是生長素的一種， 通過在植物體內(nèi)促進一系列的合成反應， 進而促進蛋白質(zhì)含量的上升， 蛋白質(zhì)的積累有益于促進營養(yǎng)器官縱向生長[30]． KT與NAA的組合在落羽杉腋芽萌發(fā)過程中誘導率最高達66.67%， 幾乎未出現(xiàn)玻璃化， 每個莖段產(chǎn)生腋芽數(shù)2～5個， 且在適宜的濃度下腋芽生長速度較快， 30 d左右腋芽能長至1～1.5 cm， 顏色嫩綠， 長勢良好． 試驗中還發(fā)現(xiàn)在低濃度的NAA中， 容易出現(xiàn)膨大的芽， 這與百合(LiliumL.)試管鱗莖結果相似[31]， 膨大的芽簇生在一起長勢較慢．

3.3 叢芽誘導與褐化

針葉樹種離體快繁在增殖誘導階段時， 通常使用6-BA與IBA或6-BA與NAA的組合來誘導不定芽[32]． 不同生長調(diào)節(jié)劑的混合使用效果遠優(yōu)于單一激素[33-34]． 在這個階段采用0.5 mg/L 6-BA和0.4 mg/L IBA組合叢芽誘導率最高， 這與墨西哥落羽杉幼苗為起始外植體的組培結果相似[28]． 在試驗過程中我們發(fā)現(xiàn)， 落羽杉莖段組培芽在添加激素的條件下進行增殖培養(yǎng)30 d后會有叢芽產(chǎn)生， 多數(shù)單芽萌發(fā)多個叢芽， 但不添加激素時幾乎沒有叢芽產(chǎn)生． 落羽杉莖段組培芽培養(yǎng)30 d后， 部分芽苗葉緣慢慢發(fā)黃， 最終整個外植體枯黃死亡． 究其原因可能是木本植物本身含有較多的酚類物質(zhì)， 將腋芽切割下來用于叢芽誘導時， 外植體細胞受到破壞， 細胞內(nèi)的過氧化物酶、 多酚氧化酶等酶釋放或合成， 在合適的pH值、 溫度、 光照等條件下， 與細胞液泡里的酚類物質(zhì)發(fā)生酶促氧化反應， 形成有毒的棕褐色醌類物質(zhì)， 從而使組織發(fā)生褐變[35-36]． 隨著培養(yǎng)時間的延長， 醌類物質(zhì)逐漸積累， 最終導致整個外植體死亡． 在本試驗中， 通過在培養(yǎng)基中添加不同濃度的吸附劑AC[37-38]， 褐化程度有一定的緩解， 但是隨著培養(yǎng)時間的延長， 最終芽苗還是會枯黃死亡， 對于這個現(xiàn)象的解決辦法還有待進一步的研究．

4 結論

本研究運用組織培養(yǎng)技術獲得了一定數(shù)量的無菌外植體， 再通過腋芽誘導和叢芽誘導擴繁獲得了無菌苗． 結果表明， 在落羽杉組培初代培養(yǎng)階段外植體的存活率和污染率受外植體類型、 外植體部位、 消毒劑的種類、 消毒劑作用時間等多個因素的影響， 選擇最佳的外植體以及消毒方式對之后的培養(yǎng)過程至關重要． 在本試驗中采用乙醇與HgCl2和NaClO聯(lián)合消毒并加入植物抑菌劑的方法， 顯著提高了消毒的效果． 在腋芽誘導和叢芽誘導階段， 不同植物生長調(diào)節(jié)劑以及濃度均顯著影響其誘導率．