元曉靜

（中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九○○醫(yī)院，福建 福州 350000）

香砂平胃顆粒是由炒蒼術(shù)、姜炙厚樸、陳皮、醋香附、甘草、砂仁制成的中藥復(fù)方制劑，具有健脾、溫中、燥濕功效，用于治療飲食不節(jié)、食濕互滯、胃脘脹痛、消化不良［1］。《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn) 中藥成方制劑》WS3- B2369 - 97 中僅有顆粒劑檢查項(xiàng)，相關(guān)文獻(xiàn)僅采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)方中姜炙厚樸、陳皮的3個(gè)成分做了定量檢測(cè)。指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)已廣泛用于評(píng)價(jià)中藥及其制劑的質(zhì)量，其中指紋圖譜通過HPLC 法得到中藥或中藥制劑的特征成分色譜圖，借助相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥及其制劑內(nèi)在質(zhì)量的一致性評(píng)價(jià)和產(chǎn)品穩(wěn)定性的全面監(jiān)測(cè)［2-4］。聚類分析（CA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法可對(duì)分散的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析［5-7］，發(fā)揮其高預(yù)測(cè)精度優(yōu)勢(shì)，篩選出質(zhì)量差異標(biāo)志物，二者結(jié)合既能體現(xiàn)整體信息，又能說明個(gè)體差異。本研究中通過建立HPLC 指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析出不同批次香砂平胃顆粒的相似性和穩(wěn)定性，篩選出差異性成分，為香砂平胃顆粒標(biāo)準(zhǔn)的全面提升提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司），配有可變換波長紫外檢測(cè)器；BT55S 型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，精度為0.01 mg）；KQ -550D型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

對(duì)照品蒼術(shù)素（批號(hào)為111924 - 202006，含量99.3%），厚樸酚（批號(hào)為 110729 - 202015，含量99.4%），和厚樸酚（批號(hào)為 110730 - 202111，含量99.1%），橙皮苷（批號(hào)為 110721 - 202116，含量95.3%），川陳皮素（批號(hào)為 112055 - 202102，含量99.6%），甘草苷（批號(hào)為 111610 - 202113，含量97.8%），均購自中國食品藥品檢定研究院；蒼術(shù)醇（成都曼思特生物其余科技有限公司，批號(hào)為200759-21-4，純度為99.1%）；其余試劑均為色譜純，水為屈臣氏蒸餾水；香砂平胃顆粒［云南騰藥制藥股份有限公司，規(guī)格為每袋10 g，共14 批，編號(hào)為S1 - S5（生產(chǎn)于2021年），S6-S10（生產(chǎn)于2020 年），S11-S14（生產(chǎn)于2019年）］。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters XTERRA C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相［8-10］：乙腈（A）- 0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～20 min 時(shí) 20%A → 45%A，20～32 min 時(shí)45%A → 60%A，32～43 min 時(shí) 60%A，43～60 min 時(shí)60%A → 85%A）；波長：220 nm（20～32 min 時(shí)蒼術(shù)素、蒼術(shù)醇），284 nm（0～20 min時(shí)甘草苷、橙皮苷，32～60 min，厚樸酚、和厚樸酚、川陳皮素）；流速：1.0 mL/ min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

取蒼術(shù)素、蒼術(shù)醇、厚樸酚、和厚樸酚、橙皮苷、川陳皮素、甘草苷對(duì)照品各適量，精密稱定，加甲醇溶解，得質(zhì)量濃度分別為0.113 2，0.100 5，0.100 2，0.098 6，0.057 4，0.050 1，0.030 8 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

取樣品5 袋，研勻，取2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為450 W）40 min，稱定質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

按處方組成和生產(chǎn)工藝分別制備缺炒蒼術(shù)、姜炙厚樸、陳皮和甘草的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)為S2）適量，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次。結(jié)果以12號(hào)峰蒼術(shù)素為參照，其余22個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.39%～0.57%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD為1.18%～1.74%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別于0，3，6，9，12，15，20 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，以12號(hào)峰蒼術(shù)素為參照，其余22個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.46%～0.72%（n= 7），相對(duì)峰面積的RSD為1.33%～1.85%（n=7），表明供試品溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)為S2）各適量，共6份，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果以12 號(hào)峰蒼術(shù)素為參照，其余22 個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.13%～0.26%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD為1.05%～1.42%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜［11-12］

指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià)：取14批樣品（編號(hào)為S1 - S14），按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。根據(jù)中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012A 版，以編號(hào)為S2 樣品的色譜圖為參考，建立香砂平胃顆粒指紋圖譜的共有模式，確定共有峰23個(gè)，詳見圖1。其中，12號(hào)峰（蒼術(shù)素）保留時(shí)間適中，色譜峰響應(yīng)最大，故選擇為參照峰（R）。與對(duì)照?qǐng)D譜比較，各指紋圖譜的相似度在0.971～0.994 之間，表明樣品各批次間共有成分基本一致。相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見表1。

表1 14批香砂平胃顆粒相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab.1 Results of similarity evaluation of 14 batches of Xiangsha Pingwei Granules

圖1 14批香砂平胃顆粒高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.1 HPLC superimposed fingerprint of 14 batches of Xiangsha Pingwei Granules

共有峰指認(rèn)及歸屬：取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，并與圖1 進(jìn)行對(duì)比指認(rèn)，結(jié)果見圖2 和圖3。共有峰中，3，4，9，12，17，20，21 號(hào)色譜峰分別指認(rèn)為甘草苷、橙皮苷、蒼術(shù)醇、蒼術(shù)素、川陳皮素、和厚樸酚、厚樸酚；其中，3 號(hào)峰歸屬于甘草，4 號(hào)峰和17 號(hào)峰歸屬于陳皮，9號(hào)峰和12號(hào)峰歸屬于炒蒼術(shù)，20號(hào)峰和21號(hào)峰歸屬于姜炙厚樸。

圖2 混合對(duì)照品溶液高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of mixed reference solution

圖3 陰性對(duì)照品溶液高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of negative reference solution

2.5 CA

采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，以14批樣品中23個(gè)共有峰的峰面積為變量，采用組間連接CA［13］。由圖4可知，14 批樣品按生產(chǎn)年份可聚為三類，分別為S1-S5，S6-S10，S11-S14。

圖4 14批香砂平胃顆粒聚類分析圖Fig.4 Cluster analysis of 14 batches of Xiangsha Pingwei Granules

2.6 OPLS-DA

以14 批樣品中23 個(gè)共有峰的峰面積為變量，采用SIMCA 14.1 軟件進(jìn)行 OPLS-DA［5，14］，得出造成 3 組間差異的標(biāo)志性共有峰，詳見圖5。結(jié)合變量重要性投影值（VIP）篩選出導(dǎo)致14 批樣品差異的主要共有峰。以VIP>1 為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出5 個(gè)差異性標(biāo)志物的色譜峰，分別為7號(hào)峰、9號(hào)峰（蒼術(shù)醇）、20號(hào)峰（和厚樸酚）、21號(hào)峰（厚樸酚）、16 號(hào)峰，表明上述峰的差異對(duì)分類的影響較大。詳見圖6。

圖5 14批香砂平胃顆粒OPLS-DA得分散點(diǎn)圖Fig.5 OPLS-DA scoring plot of 14 batches of Xiangsha Pingwei Granules

圖6 共有峰VIP圖Fig.6 VIP plot of common peaks

3 討論

圖6 顯示，造成樣品質(zhì)量差異的5 個(gè)差異性標(biāo)志物的色譜峰分別為7 號(hào)峰、9 號(hào)峰（蒼術(shù)醇）、20 號(hào)峰（和厚樸酚）、21號(hào)峰（厚樸酚）、16號(hào)峰，其中20號(hào)峰和21號(hào)峰均來源于姜炙厚樸，9 號(hào)峰來源于炒蒼術(shù)。因此，建議生產(chǎn)企業(yè)將蒼術(shù)醇、厚樸酚、和厚樸酚作為內(nèi)控指標(biāo)納入含量測(cè)定，并嚴(yán)格把關(guān)藥材質(zhì)量，以保證產(chǎn)品的均一性。

本研究中采用波長切換法建立了14 批樣品的HPLC 指紋圖譜，相似度值均>0.970，表明產(chǎn)品化學(xué)成分一致性較好。HPLC指紋圖譜共標(biāo)定23個(gè)共有峰，指認(rèn)出其中7個(gè)共有峰，化學(xué)計(jì)量學(xué)分析將14批樣品按生產(chǎn)年份聚為三類，表明不同年份樣品間的質(zhì)量存在一定差異，編號(hào)為S11-S14 中7 個(gè)成分的含量較低，可能與樣品生產(chǎn)時(shí)間較長有關(guān)，可進(jìn)一步考察產(chǎn)品穩(wěn)定性。

綜上所述，所建立的HPLC 指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法可用于香砂平胃顆粒的質(zhì)量控制，為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供參考。