楊鑫萍，連琪，余伯陽，劉吉華，劉秀峰

(中國藥科大學江蘇省中藥評價與轉(zhuǎn)化重點實驗室，中國藥科大學中藥可追溯與標準化研究中心，江蘇 南京 210009)

血栓性疾病一直都是人類健康的一大殺手。全球每年有超過2 600萬人死于各類血栓性疾病，且發(fā)病率逐年上升[1-2]。因此血栓性疾病的防治是當前公共衛(wèi)生及醫(yī)療領(lǐng)域所面臨的重要課題。目前可用于預防或治療血栓性疾病的藥物都存在不同程度的副作用，同時在使用這些藥物的過程中往往會增加出血的風險，更甚者危及生命。因此在治療血栓方面，迫切需要開發(fā)新的靶點及藥物。近年來研究發(fā)現(xiàn)，抑制凝血因子Ⅻ(FⅫ)有相當大的可能在預防或治療血栓的同時，不阻礙自身凝血[3]，是一個非常有前景的防治血栓藥物開發(fā)靶點。

1 FⅫ作為抗血栓藥物靶點的背景

血液凝固對于止血至關(guān)重要，但過度凝固又會導致血栓形成。目前用于防治血栓性疾病的藥物，如肝素、維生素K拮抗劑(華法林)、凝血酶抑制劑和Xa因子抑制劑，大都針對凝血級聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)鍵酶，這些酶對纖維蛋白的形成缺一不可，纖維蛋白的形成是生理止血必不可少的環(huán)節(jié)[4]。因此，靶向這些關(guān)鍵酶的抗凝劑都會增加出血的風險，甚至危及生命[5]。近年來有研究表明FⅫ在體外可以促進凝血，而FⅫ基因缺乏的動物都具有完全正常的止血功能。

Kleinschnitz等[6]通過短暫閉塞小鼠腦動脈后，發(fā)現(xiàn)FⅫ基因缺乏組和FⅫ抑制劑治療組的腦梗死體積明顯小于野生型對照組，并且未出現(xiàn)梗死相關(guān)的出血。FⅫ功能缺失使缺血血管中纖維蛋白的形成減少，加入重組人的FⅫ蛋白后，纖維蛋白形成功能得以恢復。Renné等[7]通過比較FⅫ基因敲除小鼠和野生型小鼠，分別使用 3種動脈血栓模型探討FⅫ 對血栓形成的影響：在FeCl3誘導的腸系膜動脈血栓模型中，野生型鼠腸系膜動脈幾乎全部發(fā)生血栓閉塞，而FⅫ 基因缺乏小鼠中僅半數(shù)出現(xiàn)栓塞，即使出現(xiàn)血液凝固現(xiàn)象也僅是短暫的不穩(wěn)定的孤立性栓塞；在機械性損傷腹主動脈、結(jié)扎損傷頸總動脈模型中也出現(xiàn)類似現(xiàn)象，F(xiàn)Ⅻ 基因缺乏小鼠基本無閉塞性血栓形成，并且活化部分凝血活酶時間 (APTT)明顯延長，但在小鼠斷尾實驗中的出血檢測或外科手術(shù)過程中未出現(xiàn)異常自發(fā)性出血或長時間損傷相關(guān)出血。此外，使用人的FⅫ蛋白治療的FⅫ基因缺乏小鼠APTT回歸正常，并恢復了血栓形成的能力。Revenko等[8-9]也證明了FⅫ基因缺乏或功能缺陷可以減少動脈和靜脈血栓形成模型中的血栓形成，且對自身凝血功能未造成不良影響。抑制FⅫ功能可以減少血管中纖維蛋白的形成，說明FⅫ有助于通過內(nèi)在途徑進行病理性凝血。這些數(shù)據(jù)表明，病理性血栓形成中涉及的一些過程與正常止血不同。由于 FⅫ 似乎對病理性纖維蛋白的形成有促進作用，且對于自身凝血功能是可有可無的，因此以FⅫ 作為抗血栓藥物新靶點可能為安全防治血栓栓塞性疾病提供選擇。

2 FⅫ的生理作用及其在血栓形成中的作用

FⅫ參與體內(nèi)血液凝固、炎癥和免疫等多種生理過程(見圖1)。生理情況下血液凝固是由兩種不同的途徑相互合作形成的。這兩種途徑分別由組織因子(TF)和FⅫ觸發(fā)，后一種途徑被稱為“內(nèi)源性凝血途徑”。FⅫ與聚陰離子表面(如玻璃，聚磷酸鹽或鞣花酸)接觸而被激活形成FⅫa(稱為接觸活化)，F(xiàn)Ⅻa是絲氨酸蛋白酶家族中的一員。然后，活化的FⅫa啟動兩種生理功能，一是內(nèi)在凝血：通過激活FⅫa底物因子Ⅺ(FⅪ)形成有活性的FⅪa(也是一種絲氨酸蛋白酶)；二是激肽釋放酶-激肽酶系統(tǒng)，產(chǎn)生促炎介質(zhì)緩激肽，導致血管擴張，從而降低血壓。當血管或組織破損時，TF暴露從而與FⅦa結(jié)合，外源性凝血途徑啟動，繼而通過激活FⅩ進入凝血級聯(lián)反應(yīng)的共同途徑，從而生成最初的凝血酶。但是生成的TF-FⅦa復合物數(shù)目有限，并且生成的凝血酶很快會被組織因子途徑抑制物(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)所抑制，所以最終只產(chǎn)生微量凝血酶。這些微量的凝血酶可以進一步活化血小板、FⅧ及對FⅪ的正反饋作用而產(chǎn)生放大效應(yīng)，繼而內(nèi)源性途徑參與形成足夠達到止血需要的凝血酶。因此，生理止血是由TF激活的外源性凝血途徑啟動，而內(nèi)在凝血途徑主要參與凝血的放大和擴布，對凝血反應(yīng)開始后的維持和鞏固起非常重要的作用。病理情況下，還同時存在接觸激活的內(nèi)在凝血途徑，主要途徑是活化的FⅫa激活FⅪ，通過全程的(以FⅫ為起點)內(nèi)在凝血途徑的瀑布反應(yīng)，生成超大量的凝血酶，促使血栓形成。臨床觀察也發(fā)現(xiàn)，先天性缺乏FⅫ和前激肽釋放酶或高分子量激肽原的患者，幾乎沒有出血癥狀，表明這些因子參與的表面激活過程在體內(nèi)生理性止血中不起主要作用，卻可以促進病理血栓的形成。由此表明，血栓形成與生理止血過程存在接觸激活相的不同。

圖1 FⅫ 的生理功能機制圖

接觸活化系統(tǒng)是由FⅫ激活引發(fā)的蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)。該系統(tǒng)分別通過凝血的內(nèi)在途徑和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)啟動促凝反應(yīng)和促炎反應(yīng)。體外的生化原理已經(jīng)有大量的研究，而體內(nèi)的接觸活化系統(tǒng)的激動劑及其對疾病的影響仍存在疑問。最近的實驗和臨床數(shù)據(jù)確定了錯誤折疊的蛋白質(zhì)，膠原蛋白和多磷酸鹽是體內(nèi)接觸系統(tǒng)的激活劑[10]。經(jīng)接觸系統(tǒng)活化的FⅫ啟動了凝血的內(nèi)在途徑，而FⅫ缺乏的個體卻未出現(xiàn)病理性出血，這表明FⅫ在受傷的血管壁未被激活，或FⅫa對纖維蛋白的形成沒有顯著的作用。

3 FⅫ作為抗血栓藥物靶點的重要依據(jù)

3.1 理論依據(jù) FⅫ不僅是內(nèi)源性凝血途徑的起點，更是接觸活化系統(tǒng)的中心[11]。在內(nèi)源性途徑中，F(xiàn)Ⅻ通過接觸活化成FⅫa，F(xiàn)Ⅻa進一步激活FⅪ，從而激活FⅨ，快速引起凝血級聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生大量凝血酶。FⅫa驅(qū)動的纖維蛋白形成對于病理性血栓形成和穩(wěn)固至關(guān)重要，而對于生理性損傷部位止血期間的纖維蛋白形成沒有突出的貢獻。然而，凝血級聯(lián)反應(yīng)中其他因子的缺乏，如因子Ⅷ和Ⅸ，將會導致嚴重的出血風險(分別為血友病A和B)。FⅫ在介導病理性血栓形成方面的這種可選擇性，為抑制FⅫa活性從而預防病理性血栓形成提供了安全策略[12]。

3.2 動物實驗依據(jù) Pauer等[13]使用基因靶向技術(shù)通過兩種不同的遺傳手段生成了FⅫ基因缺陷的小鼠，相比之下，凝血因子ⅪⅧ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅶ、Ⅴ、Ⅱ和纖維蛋白原的表達在FⅫ基因缺乏組和野生型組之間沒有差異。根據(jù)孟德爾遺傳規(guī)律的內(nèi)容來看，F(xiàn)Ⅻ基因缺乏不會增加胎兒死亡率。此外，F(xiàn)Ⅻ基因缺乏的雄性和FⅫ基因缺乏的雌性交配后的產(chǎn)仔量是正常的，表明FⅫ基因缺陷不會影響妊娠。并且，F(xiàn)Ⅻ基因缺陷小鼠的解剖結(jié)構(gòu)與兩種遺傳背景上的野生型幼崽的解剖結(jié)構(gòu)難以區(qū)分，說明FⅫ的缺乏不會引起體內(nèi)纖維蛋白溶解受損，亦不會導致易栓癥[14]。綜上，缺乏FⅫ基因的小鼠不會影響小鼠的生長發(fā)育和繁殖。

Müller等[15]發(fā)現(xiàn)FⅫ和FⅪ雙基因缺乏小鼠與僅缺乏其中一種基因的小鼠相似，均免受多磷酸鹽導致的致命性肺栓塞，這表明FⅫa是通過激活FⅪ啟動內(nèi)源性凝血途徑從而產(chǎn)生纖維蛋白的。與此相一致的是，特異性靶向FⅫa介導FⅪ激活的抗FⅪ單克隆抗體可有效干擾血漿中內(nèi)在途徑介導的纖維蛋白形成以及小鼠和狒狒血栓形成[16]。Müller等[17]發(fā)現(xiàn)FⅫ基因缺乏可使小鼠各種動脈和靜脈血管中血栓形成減少，且避免了各種機械或化學損傷導致的血栓。FⅫ濃度僅有正常血漿一半的小鼠與野生型小鼠的血栓形成程度相似，表明50%的FⅫ便足以促使閉塞性凝塊形成。目前使用的許多抗凝劑抗凝效果隨著其血漿濃度的增加而提高的同時出血風險也隨之增加，而FⅫ抑制劑在高血藥濃度的情況下，不僅保持良好的抗凝效果也不存在出血風險。由此可見，抑制FⅫ/FⅫa對不同動物模型動靜脈血栓形成均有抑制作用，且優(yōu)于傳統(tǒng)抗血栓藥物。

4 以FⅫ為抗血栓靶點的藥物開發(fā)與研究進展

在過去的三十年中，已經(jīng)開發(fā)了各種類型抗FⅫ/FⅫa的藥物。目前為止，F(xiàn)Ⅻ/FⅫa的抑制劑領(lǐng)域仍由大分子主導，小分子較為稀缺?，F(xiàn)總結(jié)了三十年以來專利及非專利文獻報道的靶向FⅫ/FⅫa的抑制劑并進行匯總(見表1)。主要概括了抑制劑類型、開發(fā)階段及適應(yīng)證。

表1 現(xiàn)有靶向FⅫ/FⅫa的藥物開發(fā)情況

表1(續(xù))

表1概括了近三十年來靶向FⅫ/FⅫa的抑制劑，主要包括小分子配體、肽類、蛋白質(zhì)、反義寡核苷酸、siRNA和單克隆抗體。其中一些是直接作用于FⅫa活性位點的抑制劑，而另一些則是靶向FⅫ酶原或破壞其生物合成。雖然許多FⅫ抑制劑尚處于早期研究階段，但已有幾種在血栓形成、敗血癥、HAE、阿爾茨海默病(AD)、多發(fā)性硬化(MS)的動物模型中顯示出其功效，甚至進展到人體臨床試驗中。這些抑制劑的臨床應(yīng)用價值，有待進一步研究，或許可為設(shè)計新的高效、特異性FⅫ/FⅫa抑制劑提供參考。

5 總結(jié)

綜上所述，F(xiàn)Ⅻ參與血栓形成和炎癥發(fā)生，是一個新的有開發(fā)前景的藥物靶點。在過去三十年中，靶向 FⅫ/FⅫa的抑制劑在小分子和大分子開發(fā)均取得成效，處于不同的發(fā)展階段。已開發(fā)的這些藥物的臨床研究使人們有理由相信其中一些將成為獲批準的藥物。我國是一個天然藥物資源庫，為從天然產(chǎn)物中尋找以FⅫ為靶點的抗血栓藥物提供了資源保障。目前國內(nèi)外多個課題組正在進行與FⅫ在健康和疾病中的相關(guān)研究，這些研究結(jié)果將進一步促進新的FⅫ抑制劑的開發(fā)，將對血栓性疾病的防治發(fā)揮重要的作用。