馮曉碩，雷杰云，梁喜龍，欒曉燕，劉鑫磊，方淑梅

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所）

連作障礙（Continuous cropping obstacles），也稱為重茬或再植病害（（Replant disease），是指連續(xù)在同一地塊土壤上栽培同種作物或近緣作物，即使正常管理也會(huì)出現(xiàn)作物生長(zhǎng)發(fā)育不良、產(chǎn)量降低和品質(zhì)下降的現(xiàn)象[1]。為減輕連作障礙的影響，種植者常采用施用化肥、農(nóng)藥等措施，不僅對(duì)生態(tài)環(huán)境造成破壞，并且過(guò)量施肥反而會(huì)引起連作障礙[2-4]。微生物肥料在抑制植物病原菌、促進(jìn)作物生長(zhǎng)、提高作物產(chǎn)量方面有亮眼表現(xiàn)，又復(fù)合生態(tài)農(nóng)業(yè)的要求，日益得到科研人員的重視[5]。植物根際促生菌（plant growthpromoting rhizobacteria，PGPR）是微生物肥料的研究熱點(diǎn)。植物根際促生菌是根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的重要組成部分，具有加快土壤養(yǎng)分循環(huán)、促進(jìn)植物對(duì)礦物營(yíng)養(yǎng)的吸收的作用，還能分泌具有抑菌作用的次生代謝物、增強(qiáng)植物的抗病害能力[6-7]。因此，篩選優(yōu)良的PGPR制成菌肥，既能抑制連作障礙促進(jìn)作物生長(zhǎng)，又不損害生態(tài)環(huán)境，一舉多得。

研究從連作大豆的根際土中篩選出22株細(xì)菌，分別對(duì)其固氮、解磷、分泌植物生長(zhǎng)素（IAA）、ACC脫氨酶活性以及發(fā)芽與苗期促生效果進(jìn)行測(cè)定，旨在篩選出連作條件下優(yōu)質(zhì)、高效、促生效果明顯的大豆根際促生菌，為下一步研制和開發(fā)應(yīng)用可抵抗連作障礙的微生物菌肥奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土樣

2019年9月于黑龍江大慶市林甸縣試驗(yàn)基地采集連作多年的大豆根際土為樣品，做好標(biāo)記后裝入無(wú)菌袋中保存，將樣品于24 h內(nèi)分離。或保存到4℃冰箱，48 h內(nèi)分離。

1.1.2 主要培養(yǎng)基及試劑

LB培養(yǎng)基；NFM培養(yǎng)基；NBRIP培養(yǎng)基；PKO培養(yǎng)基，ADF培養(yǎng)基；剛果紅液體培養(yǎng)基[8]。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化

菌株分離純化用的是平板涂布法。取根際土壤懸液稀釋涂布于LB平板，28℃培養(yǎng)3～4 d，挑取形態(tài)大小不同的菌落采用稀釋平板劃線進(jìn)行純化，純化后加甘油-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株的鑒定

對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，于光鏡下觀察菌體細(xì)胞形態(tài)；將菌種涂布在LB平板上，28℃培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)。生理生化指標(biāo)鑒定參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[9]。分子生物學(xué)鑒定送由生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2.3 菌株解磷能力測(cè)定

將在甘油管中保存的菌株，活化后點(diǎn)接種于NBRIP平板上，28℃恒溫培養(yǎng)，第10天后觀察、測(cè)量各菌株形成的溶磷圈大小。根據(jù)溶磷圈直徑（D）和菌落直徑（d）比值（D/d）初步確定菌株溶磷能力進(jìn)行定性測(cè)定。用鉬銻抗比色法[10]測(cè)定有效磷增量，測(cè)定結(jié)果為3次重復(fù)值。

1.2.4 菌株分泌IAA能力測(cè)定

將菌株接入滅完菌的液體剛果紅培養(yǎng)基內(nèi)，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基（不接種菌株）為對(duì)照。置于28℃、130 r·min-1搖床培養(yǎng)12 d。離心后取上清液加入比色液置于暗處30 min后迅速用分光光度計(jì)比色（波長(zhǎng)530 nm），標(biāo)準(zhǔn)曲線用純3-吲哚乙酸制作[11]。測(cè)定結(jié)果為3次重復(fù)值。

1.2.5 菌株ACC脫氨酶酶活性的測(cè)定

分離菌株在LB培養(yǎng)液中過(guò)夜培養(yǎng)后4℃離心收集，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物做標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用Bradford法[12]測(cè)定蛋白質(zhì)含量。做3次平行試驗(yàn)，取平均值用于分析。ACC脫氨酶活力測(cè)定方法參照Bhusan H等[13-14]。

1.2.6 菌株固氮能力測(cè)定

將在甘油管中保存的菌株，活化后點(diǎn)接種于NFM平板上，28℃恒溫培養(yǎng)5 d后觀察菌株是否能在平板上生長(zhǎng)。

1.2.7 菌株促生效果試驗(yàn)

將分離純化保存的菌種活化后接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基中，28℃，180 r·min-1培養(yǎng)24 h。將活化后不同菌種的菌液濃度調(diào)至OD600值為2.0。

種子萌發(fā)促生試驗(yàn)：將培養(yǎng)皿內(nèi)鋪兩層濾紙，每個(gè)培養(yǎng)皿放置20粒飽滿無(wú)損壞的大豆（東農(nóng)豆252）。處理組加入4 mL不同菌液，以4 mL蒸餾水為對(duì)照。置于暗處培養(yǎng)，記錄、拍照對(duì)比菌液是否對(duì)種子萌發(fā)有促生效果，每個(gè)處理3次重復(fù)。苗期促生試驗(yàn)：以滅菌蛭石作為栽培基質(zhì)，將大豆盆栽置于25℃溫室內(nèi)培養(yǎng)25 d，每組設(shè)置10個(gè)重復(fù)。在各處理組植株根際加入2 mL菌液，空白培養(yǎng)液為對(duì)照。取大豆幼苗測(cè)量其形態(tài)指標(biāo)[15]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理與分析使用Excel與SPSS軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 PGPR菌株的分離篩選

從連作大豆根際土壤中分離并初步篩選（固氮、溶磷）得到22株促生細(xì)菌。菌株編號(hào)分別為C22-1、C19、XC31、XC19、XC68、XC29、XC23、XC75、XC46、XC35、XC9、XC98、XC109、XC32、XC30、XC22、C27、XC78、XC82、XC45、XC118、XC26。

2.2 PGPR菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定

22株促生菌的形態(tài)學(xué)特征及部分生理生化指標(biāo)的鑒定結(jié)果分別見表1、表2及圖1、圖2。菌株的細(xì)胞形態(tài)有粗桿狀與近卵狀2種。菌落顏色有白色與淡黃色兩種。17株菌株12 h內(nèi)可觀察到生長(zhǎng)，5株菌24 h內(nèi)可觀察到生長(zhǎng)。

表1 22株P(guān)GPR菌株的形態(tài)學(xué)特征Table 1 Morphological characteristics of 22 PGPR strains

表2 22株P(guān)GPR菌株的部分生理生化指標(biāo)Table 2 Some physiological and biochemical parameters of 22 PGPR strains

續(xù)表2 22株P(guān)GPR菌株的部分生理生化指標(biāo)Continued table 2 Some physiological and biochemical parameters of 22 PGPR strains

圖1 22株促生菌菌落形態(tài)圖Fig.1 Colony morphology of 22 growth-promoting strains

圖2 22株菌株革蘭氏染色圖Fig.2 Gram staining of 22 strains

2.3 菌株解磷、固氮能力測(cè)定結(jié)果

對(duì)22株P(guān)GPR菌株進(jìn)行解磷能力的測(cè)定，結(jié)果如表4所示。其中，菌株XC22與XC46的解磷能力最強(qiáng)，D/d值分別為2.16和1.33，有效增磷量分別為17.49 mg·L-1和14.72 mg·L-1。菌株C22-1無(wú)解磷能力。各菌株產(chǎn)生溶磷透明圈結(jié)果如圖3所示。

觀察22株菌株在固氮培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，22株菌株均能生長(zhǎng)，其中菌株C22-1與XC98在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況最好（圖4）。

2.4 產(chǎn)激素能力測(cè)定結(jié)果

2.4.1 菌株產(chǎn)IAA測(cè)定結(jié)果

對(duì)22株P(guān)GPR菌株的產(chǎn)生IAA測(cè)定結(jié)果如表3所示，22株菌株均有產(chǎn)生IAA的能力。其中產(chǎn)IAA能力最強(qiáng)的菌株為C27與XC98，分別為75.65 μg·mL-1和88.21 μg·mL-1。產(chǎn)IAA能力較弱的菌株為XC118與XC46，分別為17.97 μg·mL-1和17.72 μg·mL-1。

2.4.2 菌株ACC脫氨酶活性測(cè)定結(jié)果

對(duì)22株P(guān)GPR菌株的產(chǎn)生IAA測(cè)定結(jié)果如表3所示，22株菌株均有一定的ACC酶活性，但酶活性均不高。其中ACC脫氨酶活性最高的菌株是XC75，活性最低的菌株為C27，分別為0.67 U·mg-1和0.33 U·mg-1。

2.5 分子生物學(xué)鑒定

對(duì)分離篩選得到的22株P(guān)GPR菌株的16S rDNA序列通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，完成分子生物學(xué)鑒定。結(jié)果如表4顯示，菌株中分別歸屬于假單胞菌屬（Pseudomonas），腸桿菌屬（Enterobacter），土壤桿菌屬（Agrobacterium），檸檬酸桿菌屬（Citrobacter），沙雷氏菌屬（Serratia），克雷伯氏菌屬（Klebsiella），共6種菌屬。其中，同屬沙雷氏菌屬（Serratia）的11株菌株（XC75、XC31、XC32、XC68、XC30、XC35、XC45、XC78、XC19、XC23、XC82）模 式菌株相同且相似度皆高于97%，菌落形態(tài)及生理生化性質(zhì)相似，因此判定為相同菌株；同屬檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）的2株菌株XC29、XC118模式菌株相同且相似度皆為99.86%且菌落形態(tài)及生理生化性質(zhì)相似，判定為同一菌株。同屬克雷伯氏菌屬（Klebsiella）的2株菌株XC98、XC109模式菌株相同且相似度皆為99.86%1且菌落形態(tài)及生理生化性質(zhì)相似，判定為同一菌株。最終得到10株不同菌株。用MEGA X構(gòu)建的發(fā)育進(jìn)化樹（圖3）。

圖3 解磷培養(yǎng)基測(cè)定結(jié)果圖Fig.3 Determination results of phosphorous solubilizing medium

表3 22株菌株的促生特性測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of growth promoting characteristics of 22 strains

續(xù)表3 22株菌株的促生特性測(cè)定結(jié)果Continued table 3 Determination results of growth promoting characteristics of 22 strains

圖4 菌株固氮能力測(cè)定結(jié)果圖Fig.4 Results of determination of nitrogen fixation ability of strains

2.6 種子萌發(fā)及苗期促生結(jié)果

選取10株不同株菌株對(duì)大豆種子萌發(fā)的促生效果如圖6所示。經(jīng)XC45、XC26、C27、XC46，XC22、XC109、XC118菌液處理后的種子發(fā)芽率顯著高于對(duì)照組種子發(fā)芽率，表明這7株菌株對(duì)大豆種子發(fā)芽有顯著促進(jìn)作用。其中經(jīng)XC46菌液處理后種子發(fā)芽率最高，比對(duì)照組高48.3%。

表4 22株P(guān)GPR菌株的16S rDNA對(duì)比結(jié)果Table 4 Comparison results of 16S rDNA of 22 PGPR strains

圖5 22株菌株基于16S rDNA的序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Sequence phylogenetic tree of 22 strains based on 16S rDNA

10株菌株對(duì)大豆苗期的促生效果如表5所示。菌株XC118對(duì)株高促生效果最好；菌株XC26對(duì)莖粗促生效果最好；菌株XC22對(duì)根長(zhǎng)促生效果最好；菌株XC22對(duì)根體積促生效果最好；菌株XC109、XC9對(duì)地上干重促生效果最好；菌株XC22、C22-1對(duì)地下干重促生效果最好。從綜合來(lái)看，菌株XC22和C22-1的促生效果較好。XC22對(duì)各項(xiàng)（共6項(xiàng)）形態(tài)指標(biāo)均有促生作用，C22-1對(duì)五項(xiàng)形態(tài)指標(biāo)有促生作用。

圖6 10株菌株對(duì)種子萌發(fā)的影響（P<0.05）Fig.6 Effects of 10 strains on seed germination（P<0.05）

表5 10株菌株對(duì)大豆苗期促生作用（P<0.05）Table 5 Effects of 10 strains on seedling growth promotion of soybean（P<0.05）

3 結(jié)論與討論

連作障礙對(duì)大豆等油料作物危害極大，對(duì)大豆的產(chǎn)量、生理指標(biāo)和病蟲侵害都有不良影響。研究表明，一些PGPR通過(guò)產(chǎn)生植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)植物生長(zhǎng)和產(chǎn)量產(chǎn)生有益的影響[16-22]。研究篩選出的22株P(guān)GPR菌中又21株具有溶磷能力，有效增磷量范圍為0.19～17.49 mg·L-1；22株菌株具有固氮能力，其中2株菌株固氮能力較強(qiáng)；22株菌株均可分泌IAA，產(chǎn)量范圍為17.72～88.21 μg·mL-1；22株菌株均具有ACC脫氨酶活性，酶活力范圍為0.33～0.67 U·mg-1。與以往研究相比，篩選出的PGPR菌株溶磷能力較好，郭英等[23]從野生大豆根際促分離篩選出11株具有解磷促生菌，有效解磷量范圍在2.87～57.31 mg·L-1。研究篩選出的PGPR菌株分泌IAA能力較好，劉長(zhǎng)征等[24]從何首烏根際土壤中篩選出2株促生菌，IAA產(chǎn)量分別為38.65、33.64 μg·mL-1，張英等[25]從三葉草根際分離出10株具菌株的IAA產(chǎn)量范圍在0.36～20.39 μg·mL-1。研究篩選出的PGPR菌株ACC脫氨酶活性較低，姬文秀等[26]從人參中篩出的產(chǎn)ACC脫氨酶內(nèi)生細(xì)菌的酶比活力在0.2～10 U·mg-1之間，最高為9.73 U·mg-1，可能的原因是在連作逆境對(duì)促生菌的ACC酶活力有不良影響?？傮w來(lái)看，22株P(guān)GPR菌株中的溶磷能力和產(chǎn)IAA能力這兩項(xiàng)促生特性較好，ACC脫氨酶能力較低。說(shuō)明研究的22株P(guān)GPR菌株的溶磷和產(chǎn)IAA能力在連作大豆促生發(fā)揮的作用值得深入分析研究。

試驗(yàn)得到22株P(guān)GPR菌株，經(jīng)鑒定分別屬于6種菌屬，通過(guò)菌落形態(tài)、理化性質(zhì)及模式菌株對(duì)比后，判定為10株不同菌株，研究證明連作大豆根際細(xì)菌具有較豐富的種屬多樣性。秦士嬌等[27]從黃瓜根際土壤中篩選出1株粘質(zhì)沙雷氏菌，對(duì)黃瓜苗有顯著的促生作用并且有良好的防病促生作用。在種子萌發(fā)與苗期試驗(yàn)中，XC46、XC22、C22-1對(duì)大豆的發(fā)芽和苗期生長(zhǎng)都有很好的促生效果，且這3株促生菌株具有優(yōu)良的固氮、分泌IAA和溶磷等特性，與促生試驗(yàn)結(jié)果相符合。分析結(jié)果說(shuō)明：篩選出的這3株菌株可以作為優(yōu)良的PGPR接種劑加以利用。研究結(jié)果可為后續(xù)PGPR微生物菌肥的研制與開發(fā)提供理論依據(jù)。

植物根際促生菌（PGPR）的應(yīng)用是一種生態(tài)友好的化肥替代方法。因?yàn)樗龠M(jìn)增產(chǎn)、消除了土壤帶來(lái)的問題，并保持了生態(tài)系統(tǒng)的清潔[28-30]。目前的新的研究趨勢(shì)是加入PGPR以促進(jìn)植物發(fā)育。盡管迄今為止已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究，但仍有許多難題需要解決，以促進(jìn)PGPR的實(shí)際農(nóng)業(yè)應(yīng)用[31]。因此，需要制定適當(dāng)?shù)膽?zhàn)略并進(jìn)行更多的研究和試驗(yàn)。