王德海，陳文文，朱金海，李春秋，李鵬，孫東波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319）

豬細(xì)環(huán)病毒是一種無囊膜單股負(fù)鏈DNA病毒，早期曾被稱為豬輸血傳播病毒（Transfusion transmitted virus，TTV）、豬源細(xì)環(huán)病毒（Porcine torque teno virus，PTTV）[1-2]。TTSuV在豬群中具有很高的感染率，并能通過多種傳播途徑進(jìn)行傳播，還會對生物制品及公共環(huán)境等造成污染。雖然TTSuV單獨(dú)感染可能并不引發(fā)臨床癥狀，但已許多研究顯示其可與其他多種病原混合感染，促使疾病的發(fā)生、加劇疾病的臨床表現(xiàn)。TTSuV為無囊膜、呈二十面體對稱、單股負(fù)鏈、環(huán)狀DNA病毒，其基因組全長約2.7~3.0 kb，主要包括非編碼區(qū)（Untranslated region，UTR）和編碼區(qū)（Translated region，TR）兩個(gè)部分。TTSuV各基因型及亞型間的基因組結(jié)構(gòu)比較保守。根據(jù)ICTV第10次在線報(bào)告，指環(huán)病毒科共包含12個(gè)病毒屬（Alphatorquevirus-Zetatorquevirus），68種病毒；其中TTSuV分布于Iotatorquevirus和Kappatorquevirus病毒屬，前者包含兩個(gè)種，分別命名為TTSuV 1a和TTSuV 1b，而后者也包含兩個(gè)種分別命名為TTSuV k2a和TTSuV k2b[3-4]。目前，國內(nèi)外許多學(xué)者仍習(xí)慣將TTSuV分為TTSuV1（Iotatorquevirus）和TTSuV2（Kappatorquevirus）兩種基因型[5-6]，研究也沿用此分類名稱。

TTSuV是一種變異速率很快的病毒，不同基因型毒株間同源性低于50%，但目前關(guān)于TTSuV基因組及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的研究卻很少。TTSuV UTR的核苷酸片段長約800 bp，占整個(gè)基因組的28%~30%。其包含一段長度不等的高GC含量短序列（G+C含量超過90%），研究發(fā)現(xiàn)該區(qū)域在空間上會形成一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，對PCR擴(kuò)增及基因測序造成很大影響[7-8]。此外，UTR還包含啟動子區(qū)、TATA box（ATATAA）及Poly（A）尾等轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。Cornelissen-Keijsers等[9]研究發(fā)現(xiàn)啟動子區(qū)序列在TTSuVk2a和TTSuVk2b型毒株之間高度保守。TTSuV的UTR相比TR更為保守，且不受自然選擇壓力的影響，但其在不同基因型毒株中卻能表現(xiàn)出很高的遺傳多樣性，因此國內(nèi)外許多學(xué)者常將UTR作為鑒定及區(qū)分不同類型TTSuV毒株的一種分子標(biāo)記[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)TTSuV的TR存在多個(gè)相互重疊的開放閱讀框（Open reading frame，ORF），病毒在轉(zhuǎn)錄過程中可形成三個(gè)或更多mRNA，編碼至少6種蛋白，其中ORF1和ORF2由未剪輯的mRNA1編碼，ORF1/1和ORF2/2由剪輯內(nèi)含子1的mRNA2編碼，而ORF1/1/2和ORF2/2/3則由剪輯內(nèi)含子1和2的mRNA3編碼[12-13]。

大量的流行病學(xué)研究表明TTSuV流行范圍十分廣泛，目前北美洲、南美洲、歐洲、亞洲、澳洲、非洲中至少18個(gè)國家對該病進(jìn)行了報(bào)道。TTSuV在世界范圍內(nèi)持續(xù)存在且不斷變異，給養(yǎng)豬行業(yè)的健康發(fā)展帶來巨大威脅。因此，持續(xù)監(jiān)測TTSuV的流行與遺傳變異情況對其病原特性的研究及該病的防控具有重要意義。通過普通PCR方法，對2015~2016年華東地區(qū)采集的仔豬腹瀉樣品進(jìn)行TTSuV2檢測，并對該病毒在華東地區(qū)流行情況及基因型進(jìn)行分析，為TTSuV2的流行情況和遺傳進(jìn)化情況提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為該病毒在我國的預(yù)防提供了可參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

采集自2016年9月-2017年12月，中國東北、華東、華中、華北、華南、西南、西北7個(gè)地區(qū)規(guī)?；i場發(fā)病豬只的腸組織或糞便樣品共325份；將樣品根據(jù)不同豬場與發(fā)病日期進(jìn)行整理標(biāo)記，保存于-80℃冰箱。

1.1.2 主要試劑

表1 主要生化試劑Table 1 The detail information of reagents

1.1.3 儀器設(shè)備

表2 儀器設(shè)備Table 2 The detail information of machines

1.1.4引物設(shè)計(jì)

通過巢式PCR方法擴(kuò)增UTR基因，引物序列參照王礞礞等[17]研究；另外合成一對引物用于擴(kuò)增TTSuV2基因組的高變區(qū)，目的基因的引物序列參照Martí等[14]研究，詳細(xì)信息見表3。

表3 TTSuV2 UTR和ORF1基因擴(kuò)增引物Table 3 Primers for the amplification of UTR and ORF1 genes of TTSuV2

1.2 方法

1.2.1 樣品的處理與基因組的提取

稱取1 g腸組織/糞便樣品，加入液氮研磨至粉末狀（糞便樣品省略此步驟）；加入3倍體積PBS，渦旋振蕩5 min，4℃4 200×g離心15 min取上清液，按照病毒DNA提取試劑盒說明書提取樣品中病毒DNA。提取的DNA保存在-20℃。

1.2.2 目的基因PCR擴(kuò)增與測序

使用表3中設(shè)計(jì)的引物對UTR基因進(jìn)行特異性巢式PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系見表4。外套PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 sec，52℃退火30 sec，72℃延伸40 sec，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸10 min。內(nèi)套PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 sec，55℃退火30 sec，72℃延伸30 sec，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸10 min。取內(nèi)套擴(kuò)增產(chǎn)物3 μL經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，同時(shí)以DL2 000 DNA Marker作為參照，在紫外凝膠成像儀上觀察并記錄結(jié)果。

TTSuV2基因組高變區(qū)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系見表4。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃熱變性30 sec，60℃退火45 sec，72℃延伸3 min，共40個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸7 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物3 μL經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，同時(shí)以DL 2 000 DNA Marker作為參照，在紫外凝膠成像儀上觀察并記錄結(jié)果。將陽性產(chǎn)物送由哈爾濱博仕生物有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

進(jìn)化樹分析方法與前研究相似[19]，使用MEGAⅩ（網(wǎng)址：https：//www.megasoftware.net/）軟件對試鑒定毒株基因序列與參考序列進(jìn)行多序列比對，將對齊后的序列應(yīng)用MEGAⅩ軟件中鄰接法（Neighborjoining method，NJ法）結(jié)合最大復(fù)合似然法模型（Maximum Composite Likelihood）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，bootstrap（自展值）：1 000。

表4 PCR反應(yīng)體系Table 4 PCR reaction system

1.2.4 目的基因序列核苷酸與氨基酸同源性分析

使用DNASTARTM5.06軟件包中MegAlign程序?qū)y序得到的目的基因序列進(jìn)行核苷酸同源性分析，分別選取Kappatorquevirus病毒屬國內(nèi)外代表性毒株作為參考毒株，其中TTSuV k2a基因型：2p（Brazil）、Porcine TTV 2 from China（China）、PTTV2c-VA（USA）、472142（Germany）、TTSuV2-KU2（Japan）；TTSuV k2b基因型：38E23（New Zealand）。按照系統(tǒng)進(jìn)化樹劃分體系分別與以上參考毒株進(jìn)行比對，分析其同源性關(guān)系。

1.2.5 核苷酸與氨基酸序列比對

選取美洲型代表性毒株ATCC VR-2332、中國早期經(jīng)典毒株CH-1a、高致病性代表性毒株JXA1以及NADC30毒株為參考毒株，使用BioEdit（v7.05）軟件（網(wǎng)址：https：//www.bioedit.com/）對56株TTSuV2型鑒定毒株以及參考毒株的Nsp2蛋白序列進(jìn)行比對。

1.2.6 重組分析

使用RDP4軟件中RDP、GENECONV、BootScan、MaxChi、Chimaera、SiScan和3eq方法檢測潛在的重組事件及確定最可能含有重組基因片段的毒株，只有5種及以上的方法都認(rèn)定為重組且其P值<0.05，才判定該事件中的毒株為重組毒株。其中BootScan檢測方法的臨界值百分率設(shè)為70%，窗口大小為200 bp，步長為20 bp其他參數(shù)為默認(rèn)數(shù)值。使用SimPlot（v3.5.1）軟件進(jìn)一步檢驗(yàn)重組事件，窗口大小設(shè)置為200 bp，步長設(shè)置為20 bp，其他參數(shù)為默認(rèn)數(shù)值。

1.2.7 選擇壓力分析

使用在線分析服務(wù)器Datamonkey（http：//www.datamonkey.org/）對鑒定的TTSuV2型毒株的ORF5基因進(jìn)行選擇壓力分析，用SLAC、FEL、MEME、REL和FUBAR方法進(jìn)行正選擇壓力分析，前3種方法的p值<0.1具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義且差異顯著；REL方法以貝葉斯因子為統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)（Bayes Factors>50），F(xiàn)UBAR方法以后驗(yàn)概率為統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)（posteriori Probability>0.9）；用SLAC、FEL、REL和FUBAR方法進(jìn)行負(fù)選擇壓力分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)和正選擇壓力分析相同。比較不同方法所得結(jié)果，只有2種及以上的方法檢測到密碼子位點(diǎn)受到非中性選擇，且相應(yīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測方法均顯示差異顯著時(shí)，則認(rèn)定該位點(diǎn)受到相對應(yīng)的正選擇壓力或負(fù)選擇壓力。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因PCR擴(kuò)增

采用巢式PCR方法對樣品的UTR基因進(jìn)行特異性擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳顯示PCR擴(kuò)增得到大約250 bp目的片段（圖1、圖2），針對TTSuV2高變區(qū)目的基因進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳顯示擴(kuò)增得到目的片段大小約719 bp，均與預(yù)期大小相符（圖3）。

圖1 TTSuV2 UTR基因第1輪PCR鑒定Fig.1 The identification for TTSuV2 UTR gene by first round PCR

圖2 TTSuV2 UTR基因第2輪PCR鑒定Fig.2 The identification for TTSuV2 UTR gene by second round PCR

圖3 TTSuV2基因組高變區(qū)PCR鑒定Fig.3 The identification for TTSuV2 genomic hypervariable region by PCR

2.2 TTSuV2樣品陽性率統(tǒng)計(jì)

PCR檢測結(jié)果顯示，2016年收集中國6個(gè)地區(qū)腹瀉樣品共計(jì)174份，陽性樣品66份，陽性率為37.93%；其中華南地區(qū)感染率最高，為56%；東北地區(qū)感染率最低，為30.26%。2017年收集中國5個(gè)地區(qū)腹瀉樣品共計(jì)151份，陽性樣品26份，陽性率17.22%；其中華東地區(qū)感染率最高，為27.27%；華中地區(qū)感染率最低，為9.1%；相比2016年，東北、華北、華東、華中地區(qū)感染率均降低，且2017年總感染率也低于2016年。2016-2017年共計(jì)325份腹瀉樣品中陽性樣品總數(shù)為92份，平均陽性率為28.31%（表5）。對92份陽性樣品的目的基因進(jìn)行克隆，結(jié)果共成功克隆出目的基因31條，并將測得目的基因序列處理后提交GenBank。

表5 2016-2017年TTSuV2樣品陽性率統(tǒng)計(jì)Table 5 TTSuV2 sample positive rate statistics during 2016-2017

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

根據(jù)99株TTSuV毒株構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，試驗(yàn)所鑒定31株TTSuV毒株全部屬于Kappatorquevirus屬，TTSuV k2a基因型。根據(jù)毒株間的親緣關(guān)系將所有鑒定毒株劃分為2個(gè)群（Group1-2）（圖4）。共有來源于東北、華北、華東、華南、西南5個(gè)地區(qū)的21株TTSuV鑒定毒株分布于Group1。來源于東北、華北、華東3個(gè)地區(qū)的10株TTSuV鑒定毒株分布于Group2。Group1中前9株鑒定毒株與鑒定毒株與該屬原型毒株2p及國內(nèi)代表性毒株P(guān)orcine TTV 2 from China親緣關(guān)系較近，其余12株鑒定毒株則與國內(nèi)地方野毒株親緣關(guān)系較近。Group2中前7株鑒定毒株與日本野毒株TTSuV2-KU2、TTSuV2-KU5親緣關(guān)系最近，而鑒定毒株TTSuV2/508、TTSuV2/512與吉林野毒株TTV2Jl27親緣關(guān)系最近，鑒定毒株TTSuV2/407則與廣西野毒株TTV2Gx4親緣關(guān)系最近。試驗(yàn)所有TTSuV鑒定毒株整體與2009-2011年國內(nèi)野毒株親緣關(guān)系較近，而與TTSuV k2b基因型毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.4 核苷酸與氨基酸同源性分析

全長目的基因核苷酸同源性比對結(jié)顯示：31株TTSuV鑒定毒株自身相比，核苷酸同源性為87.5%~99.7%；與參考毒株相比，其與各國TTSuV k2a基因型代表性毒株的核苷酸同源性比較接近，均在86.7%~99.0%之間；與TTSuV k2b基因型代表性毒株38E23的核苷酸與氨基酸同源性很低，僅為59.9%~64.3%（表6）。

圖4 TTSuV2基因組高變區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic analysis of TTSuV2 strains using genomic hypervariable region

表6 TTSuV2基因組高變區(qū)核苷酸同源性分析（%）Table 6 Nucleotide homology analysis of TTSuV2 genomic hypervariable region

2.5 目的基因核苷酸與氨基酸序列比對

UTR基因序列比對結(jié)果顯示：所有鑒定毒株的核苷酸突變位點(diǎn)主要集中在第51~230 nt，而其前50 nt及靠近ORF2的核苷酸序列比較保守，且所有毒株的TATA box基序均十分保守，未出現(xiàn)突變（圖5）。

圖5 UTR基因序列比對Fig.5 Alignment of UTR gene sequences

ORF2蛋白序列比對結(jié)果顯示：所有鑒定毒株在第1~17 aa、22~34 aa、52~65 aa均比較保守，而在第39~44 aa、47~49 aa變異程度較大，所有鑒定毒株在蛋白酪氨酸磷酸酶基序的關(guān)鍵位點(diǎn)也比較保守，只有鑒定毒株TTSuV2/171出現(xiàn)一處突變，H25→Q25（圖6）。Group1中鑒定毒株與國內(nèi)代表性Porcine TTV 2 from China相比，氨基酸序列相似度很高；而與原型毒株2p相比主要出現(xiàn)4處氨基酸一致性突變，分別為S18→G18/D18/A18、E39→G39、H42→Q42/E42/R42、G43→E43。此外，鑒定毒株TTSuV2/207、TTSuV2/228、TTSuV2/247還存在1處與其他鑒定毒株不同的氨基酸突變，TGG47-49→HTD47-49。相比Group1，Group2中鑒定毒株的變異位點(diǎn)更多，也主要集中在39~49 aa；與原型毒株2p相比，其主要存在12處氨基酸一致性突變，分別為S18→D18、D21→N21/E21、D36→A36、D40→G40、R41→P41、G43→A43、D44→G44、T47→D47/V47/E47、G49→D49、D51→S51/G51/P51、A66→I66/T66、Q67→T67/I67；此外，所有Group2中鑒定毒株在第65~66 aa之間均插入一個(gè)D。

圖6 ORF2蛋白基因序列比對Fig.6 Alignment of ORF2 protein sequences

部分ORF1蛋白序列比對結(jié)果顯示：所有鑒定毒株在1~18 aa、35~38 aa、41~46 aa、50~58 aa、70~83 aa均比較保守，而在第19~23 aa、28~34 aa、39~40 aa、47~49 aa、59~63 aa變異程度較大（圖7）。Group1中鑒定毒株與國內(nèi)代表性Porcine TTV 2 from China相比，氨基酸序列相似度很高；而與原型毒株2p相比主要出現(xiàn)3處氨基酸一致性突變，分別為T39→A39/P39、K46→R46/G46、F54→N54。此外，鑒定毒株TTSuV2/207、TTSuV2/228、TTSuV2/247還存在2處與其他鑒定毒株不同的氨基酸突變，T14→R14、HR19-20→TH19-20。相比Group1，Group2中鑒定毒株的變異位點(diǎn)更多，與原型毒株2p相比，其主要存在14處氨基酸一致性突變，分別為H18→R18、R23→K23、R29→W29、Y30→H30、A33→P33、P34→T34/Y34、T39→H39/Y39、K47→R47、SR57-58→TI57-58、T60→N60、L62→Y62/F62、E64→K64、F66→I66、F75→L75；此外，所有Group2中鑒定毒株均在第38~39 aa之間均插入一個(gè)Y/R；除TTSuV2/141外，其余9株毒株均在第45~46 aa之間均插入一個(gè)V/I。

圖7 ORF2蛋白基因序列比對Fig.7 Alignment of ORF2 protein sequences

2.6 重組分析

選取國內(nèi)外參考毒株與試驗(yàn)鑒定毒株進(jìn)行重組分析，結(jié)果顯示共存在1個(gè)潛在的重組事件，事件僅包含潛在重組毒株TTSuV2/515，屬于Group2（圖8、表7）。其主要親本毒株SH屬于Group1，而次要親本毒株TTV2_USA12屬于Group2。BootScan檢驗(yàn)和SimPlot序列相似性分析顯示，潛在重組毒株TTSuV2/515毒株目的基因序列的前310 nt與上海野毒株SH序列高度相似，而后400 nt則與美國流行毒株TTV2_USA12高度相似。

表7 TTSuV2鑒定毒株重組分析Table7 Recombination analysis of identified TTSuV2 strains

圖8 BootScan和SimPlot檢驗(yàn)Fig.8 BootScan and SimPlot verification

2.7 選擇壓力分析

ORF2基因進(jìn)行選擇壓力分析結(jié)果顯示，共檢測到3個(gè)密碼子位點(diǎn)受到正選擇壓力，與參考毒株相比均屬于變異性較高的位點(diǎn)。共檢測到4個(gè)密碼子位點(diǎn)受到負(fù)選擇壓力，其中前3個(gè)密碼子位點(diǎn)在參考毒株與所有鑒定毒株中均十分保守。此外，分析鑒定毒株ORF2基因的平均ω值為0.504，表明研究鑒定毒株的ORF2基因處于選擇負(fù)壓力（表8、表9）。

表8 正選擇壓力分析Table 8 Analysis of positive selection of pressure

表9 負(fù)選擇壓力分析Table 9 Analysis of negative selection of pressure

3 討論

2009年，王礞礞等[7]采用巢式PCR方法對TTSuV進(jìn)行檢測；研究借鑒此檢測方法對2016-2017年中國7個(gè)地區(qū)TTSuV2的流行情況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果與國內(nèi)外學(xué)者對同種類型樣品TTSuV2的檢測結(jié)果存在一定差異，如：Opriessnig等[15]通過多重實(shí)時(shí)定量PCR方法對美國不同豬場腹瀉豬的88份糞便樣品進(jìn)行多種腹瀉病原的檢測，結(jié)果顯示TTSuV2的陽性率為48.9%。而將研究結(jié)果與近3年國內(nèi)各地區(qū)學(xué)者報(bào)道TTSuV2的感染率相比，也存在一定的差異，如：2016年，王偉松等[16]通過多重巢式PCR方法對江西省11個(gè)縣市采集的169份血清與組織樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示TTSuV總陽性率為50.3%，而其中TTSuV2的陽性率為40.83%。綜合以上結(jié)果可知，TTSuV2在糞便中的檢出率普遍低于血清與組織樣品，這主要與TTSuV在各組織臟器中分布不同；此外，不同的檢測方法、樣本數(shù)量及來源也會導(dǎo)致陽性率的差異。此外，研究及國內(nèi)許多研究者的檢測結(jié)果也表明目前TTSuV2在我國的流行情況比較復(fù)雜，因此，TTSuV2變異情況及其與腹瀉疾病的關(guān)聯(lián)仍有待進(jìn)一步深入研究。

系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，研究所有TTSuV鑒定毒株均屬于Kappatorquevirus屬的TTSuV k2a基因型，其陽性率為33.7%（31/92），未發(fā)現(xiàn)TTSuV k2b基因型毒株。鑒定毒株的組群分布顯示所有鑒定毒株被劃分為2個(gè)群（Group1-2），結(jié)合鑒定毒株信息表分析發(fā)現(xiàn)，TTSuV2鑒定毒株的組群分布與其地域來源分布并不統(tǒng)一，許多來源相同的毒株卻被劃分到不同的組群。這表明研究鑒定毒株的組群分布無明顯的地域性規(guī)律，各地區(qū)存在不同類型毒株的混合感染。這與梅淼[17]、張志成等[18]的研究結(jié)果相似。

基于全長目的基因與完整ORF2基因核苷酸同源性分析結(jié)果顯示，研究TTSuV鑒定毒株自身相比，核苷酸同源性分別為87.5%~99.7%和84.2%~100%；與各國TTSuV k2a基因型代表性毒株的核苷酸同源性比較接近，均在86.7%~99.0%和85.0%~99.6%之間；而與TTSuV k2b基因型代表性毒株38E23的核苷酸與氨基酸同源性很低，僅為59.9%~64.3%和37.3%~41.8%。這與Cadar[25]、Liu[20]、Cornelissen-Keijsers等[9]研究結(jié)果相類似。其中，Group1中鑒定毒株自身相比，核苷酸同源性差異度低于Group2，且與參考毒株P(guān)TTV2c-VA相比核苷酸同源性最高，與TTSuV2-KU2的核苷酸同源性最低，而Group2中鑒定毒株則與之相反。這表明Group2中鑒定毒株的核苷酸與氨基酸變異程度更大，毒株間序列差異也更大。

UTR核苷酸序列比對結(jié)果顯示：所有鑒定毒株核苷酸突變位點(diǎn)主要集中在51~230 nt，而其兩端的核苷酸區(qū)域比較保守。研究鑒定毒株與原型毒株2p相比，存在多處核苷酸插入/缺失突變，其中大部分鑒定毒株只存在1~2處插入/缺失突變，但Group2中鑒定毒株除TTSuV2/515之外，均在第121~122 nt之間存在連續(xù)11 nt的插入，這與溫立斌等[21]研究結(jié)果相類似。此外，研究還發(fā)現(xiàn)一些組群特征性的核苷酸突變，由于TTSuV的UTR包含重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，這些核苷酸的突變不僅會影響其基因組的大小，還有可能改變TTSuV的轉(zhuǎn)錄效率。

ORF2蛋白序列比對結(jié)果顯示：所有鑒定毒株均在第39~49 aa變異程度較大，而Group2中鑒定毒株的ORF2蛋白序列比Group1鑒定毒株變異程度更大，突變位點(diǎn)也更多。目前，人們對于ORF2蛋白結(jié)構(gòu)與功能還并不了解[23]，因此以上這些突變是否會影響TTSuV的ORF2蛋白的活性與功能，還需要進(jìn)行更深入的研究。

部分ORF1蛋白序列比對結(jié)果顯示：研究鑒定毒株均在第19~50 aa變異程度較大，而之前有研究表明在TTSuV2毒株ORF1蛋白N末端，尤其是前50 aa是該蛋白的親水區(qū)，也高抗原性區(qū)域，因此該區(qū)域的突變可能有利于TTSuV逃避宿主的免疫應(yīng)答[8，22]。

研究表明：TTSuV的平均遺傳進(jìn)化率為5.29~5.51×10-4site/y，且TTSuV的核苷酸替代率遠(yuǎn)高于典型的DNA病毒；而與RNA病毒的水平相當(dāng)[24]。研究對31株鑒定毒株進(jìn)行重組分析，結(jié)果顯示共存在1株潛在重組毒株TTSuV2/515，屬于Group2組群。其主要親本毒株SH屬于Group1，而次要親本毒株TTV2_USA12屬于Group2，重組斷點(diǎn)位于UTR。這與之前同源性分析及序列比對結(jié)果推測相符，也與之前Cadar等[25]研究結(jié)果相類似。以上研究結(jié)果表明基因重組是TTSuV快速變異的重要方式之一。

2011年，Cortey等[24]基于不同基因型TTSuV毒株全基因組研究其遺傳變異和系統(tǒng)發(fā)育特點(diǎn)，結(jié)果顯示TTSuV2毒株的ORF2基因中14個(gè)密碼子位點(diǎn)受到正選擇壓力，其主要集中在第40~69 aa；9個(gè)密碼子位點(diǎn)受到負(fù)選擇壓力，其主要集中在第20~40 aa，ω值約為0.269。隨后，Cadar等[19]在TTSuV2型毒株中也鑒定出14個(gè)碼子位點(diǎn)受到正選擇壓力，也主要集中在ORF2基因的C末端，TTSuV2-2a平均ω值為0.87，TTSuV1-2b平均ω值為0.51。與以上研究結(jié)果相比，鑒定毒株的ORF2基因中3個(gè)受到正選擇壓力的密碼子位點(diǎn)也均位于ORF2基因的C末端，而研究檢測到4個(gè)受到負(fù)選擇壓力的密碼子位點(diǎn)則位于ORF2基因的兩端。此外，鑒定毒株ORF2基因的平均ω值為0.504，高于Cortey等研究結(jié)果而低于Cadar等研究結(jié)果。

4 結(jié)論

2016-2017年中國7個(gè)地區(qū)均存在TTSuV2型毒株的流行，平均感染率為28.31%，且許多地區(qū)存在不同組群毒株混合感染的情況。

TTSuV發(fā)生較大程度的變異，大部分流行毒株的基因序列中存在不同程度的插入/缺失突變，甚至還存在基因重組現(xiàn)象。