王然，范釗瑋，馬駿，段旭陽，王欣，劉碩，周玉龍，朱戰(zhàn)波，崔玉東，

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院）

奶牛乳房炎是嚴重影響奶牛養(yǎng)殖業(yè)和奶業(yè)健康發(fā)展的重要疾病，臨床上由革蘭氏陰性腸桿菌科細菌引起的感染常常占有較大比例[1-3]。引起奶牛乳房炎的腸桿菌科細菌中，除了常見的埃希氏大腸桿菌（Escherichia coli），還有克雷伯氏菌[4]、沙門氏菌[5]、志賀氏菌[6]、沙雷氏菌[7-8]、陰溝腸桿菌[9]、檸檬酸桿菌[10]、變形桿菌[11-12]等。隨著臨床上長期、大量使用抗生素防治奶牛乳房炎，這些病原菌逐漸產(chǎn)生了耐藥性和多耐藥性，導(dǎo)致抗生素療效甚微。進而，研究和使用疫苗預(yù)防大腸桿菌性乳房炎成為必然的選擇。自上世紀(jì)80年代末，人們開始研究和使用疫苗預(yù)防埃希氏大腸桿菌引起的奶牛乳房炎，但尚未獲得滿意的臨床可用疫苗[13-14]。近年來對E.coli外膜蛋白A（OmpA）抗原進行免疫試驗研究證實[15-16]，OmpA能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答和抗E.coli感染免疫保護作用，同時也能一定程度地抵抗志賀氏菌和克雷伯氏菌攻擊，展現(xiàn)了良好的開發(fā)和應(yīng)用前景。

OmpA是存在于革蘭氏陰性菌外膜上的一種蛋白質(zhì)，對維持外膜結(jié)構(gòu)完整性發(fā)揮重要作用，也是噬菌體感染的受體和吸收大腸桿菌素K和L的必需結(jié)構(gòu)[17]。但對引起奶牛乳房炎的腸桿菌科細菌的OmpA同源性、抗原性等尚缺乏認識。研究擬對引起奶牛乳房炎的腸桿菌科細菌OmpA的理化性質(zhì)、同源性和抗原表位進行生物信息學(xué)分析，為進一步研究OmpA誘導(dǎo)的交叉免疫保護作用和建立OmpA免疫牛血清抗體檢測方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗用菌株

試驗用菌株包括分離于奶牛乳房炎病牛乳汁的E.coli2002-1、SY200105和308-2株，分離于犢牛臨床腹瀉糞便樣品的E.coliN150601、JS160801和SH16041株，以上菌株均由實驗室鑒定保存；分離于病牛的肺炎克雷伯氏菌KPDN202010株來自于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物傳染病學(xué)實驗室；牛源沙門氏菌BNCC186363株購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；福氏志賀氏菌CMCC（B）51572株和粘質(zhì)沙雷氏菌CMCC41002株購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 菌種復(fù)蘇

試驗用上述菌株用接種環(huán)劃線接種于LB瓊脂平板上，于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h以上，檢查菌落形態(tài)特性和一致性，再挑取單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中，于37℃恒溫搖床180 r·min-1培養(yǎng)過夜，然后對細菌進行形態(tài)染色和主要生化特性檢查。

1.3 OmpA基因擴增及測序

為了擴增OmpA基因，使用Primer 5.0設(shè)計PCR擴增引物。根據(jù)GenBank中有關(guān)菌株的基因序列（NC_000913.3）設(shè)計的上游引物命名為OMPA-F，下游引物為OMPA-R；對于肺炎克雷伯氏菌（參考WP_148865386.1）和粘質(zhì)沙雷氏菌（參考WP_062792 903.1），下游引物分別為Kle-R和Ser-R，各引物序列詳見表1。反應(yīng)體系與反應(yīng)條件參照參考文獻［15］。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，送吉林庫美生物科技有限公司進行測序。

表1 OmpA基因PCR擴增引物Table 1 Primers used for OmpA gene amplification by PCR

1.4 參考菌株OmpA基因序列獲取

研究還從GenBank數(shù)據(jù)庫中選取19株細菌的OmpA基因序列作為參考（見表2），包括E.coli2株、肺炎克雷伯氏菌2株、牛源沙門氏菌2株、福氏志賀氏菌2株、粘質(zhì)沙雷氏菌2株、陰溝腸桿菌3株、弗氏檸檬酸桿菌3株、奇異變形桿菌3株。

1.5 OmpA蛋白理化性質(zhì)分析

使 用ExPASy（https：//www.expasy.org/）的Prot－Param功能分析OmpA蛋白的理化性質(zhì)、ProtScale功能分析OmpA蛋白的親疏水性；使用DNAstar軟件中Protean功能分析OmpA蛋白的抗原性。

表2 19株參考菌株OmpA基因序列Table 2 OmpA gene sequences of 19 reference strains from GenBank

1.6 OmpA蛋白二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)分析

使用PRABI（http：//www.prabi.fr/）的HNN二級結(jié)構(gòu)預(yù)測方法對OmpA蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行分析；使用SWISS-MODEL建模服務(wù)器（https：//swissmodel.expasy.org/）對OmpA蛋白的三級結(jié)構(gòu)進行建模。

1.7 OmpA遺傳進化分析與序列比對

使用BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對各菌株的OmpA氨基酸序列進行搜索比對，分析保守性；使用DNAstar軟件中MegAlign功能對OmpA蛋白進行同源性分析；使用Geneious Prime軟件對各菌株OmpA蛋白的氨基酸序列進行比對。

1.8 OmpA蛋白的表位預(yù)測

使用IEDB數(shù)據(jù)庫（http：//www.iedb.org/）與BepiPred1.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred-1.0/）預(yù)測OmpA蛋白的線性B細胞表位。使用NetMHCIIpan 4.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCIIpan/）與IEDB數(shù)據(jù)庫預(yù)測OmpA蛋白的CD4+T細胞表位。在B細胞預(yù)測結(jié)果中，構(gòu)成某區(qū)域的氨基酸評分越高，該區(qū)域成為B細胞表位的可能性越大。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

將OmpA基因的PCR擴增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠進行電泳，在1 000 bp之上的位置可見一條清晰的目的條帶（見圖1），與預(yù)期的基因片段大小吻合，但各菌株間堿基數(shù)略有差異。剩余的PCR擴增產(chǎn)物用于測序。

圖1 PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis results of the amplified products by PCR

2.2 OmpA蛋白理化性質(zhì)

E.coli、肺炎克雷伯氏菌、牛源沙門氏菌、福氏志賀氏菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、陰溝腸桿菌、弗氏檸檬酸菌、奇異變形桿菌的OmpA蛋白分別由346、356、350、359、348、351、352、358個氨基酸組成；等電點分別為5.43、5.72、5.18、5.17、7.04、5.47、5.46、5.66；不穩(wěn)定系數(shù)分別為22.47、23.15、29.15、23.72、17.80、28.01、27.12、34.13，全部小于40，判定為穩(wěn)定蛋白；親水性平均值分別為-0.399、-0.395、-0.425、-0.376、-0.387、-0.331、-0.379、-0.331，全部位于-2~2之間，表明各菌株的OmpA均為親水性蛋白；抗原性指數(shù)峰值越大則該部分抗原性越強，各菌株的OmpA均具有良好的抗原性（詳見圖2）。

圖2 OmpA蛋白抗原性指數(shù)Fig.2 Index of OmpA protein antigenicity

2.3 OmpA蛋白二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

在E.coli、肺炎克雷伯氏菌、牛源沙門氏菌、福氏志賀氏菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、陰溝腸桿菌、弗氏檸檬酸菌、奇異變形桿菌的OmpA蛋白二級結(jié)構(gòu)中，無規(guī)則卷曲各占61.80%、59.46%、62.20%、62.65%、55.12%、56.98%、56.82%、54.47%；α螺 旋 各 占22.05%、27.33%、21.65%、21.91%、31.63%、31.05%、28.98%、29.33%；延伸主鏈各占16.15%、13.21%、21.65%、21.91%、13.25%、11.97%、14.20%、16.20%。由此可見，OmpA蛋白的無規(guī)則卷曲占比較大，更易形成細胞表位。在OmpA蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測中，同屬內(nèi)各菌株間OmpA三級結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)高度一致性，各屬細菌OmpA與數(shù)據(jù)庫中OmpA三級結(jié)構(gòu)模型的一致性分別 為99.38%、86.38%、93.50%、96.56%、77.66%、88.73%、89.60%、71.30%。

2.4 OmpA同源性分析結(jié)果

8株E.coli的OmpA同源性為96.8%~100%，3株肺炎克雷伯氏菌OmpA同源性為96.1%~98.3%，3株牛源沙門氏菌OmpA同源性為99.4%~99.7%，3株福氏志賀氏菌OmpA同源性為100%，3株粘質(zhì)沙雷氏菌OmpA同源性為99.7%，3株陰溝腸桿菌OmpA同源性為97.2%~99.4%，3株弗氏檸檬酸菌OmpA同源性為100%，3株奇異變形桿菌OmpA同源性為99.4%~100%。

各屬間細菌OmpA氨基酸序列同源性為99.7%~69.3%。E.coli與福氏志賀氏菌、沙門氏菌高度同源，分別為97.2%和94.1%，而致腹瀉E.coliJS160801與福 氏 志 賀 氏 菌CMCC（B）51572、AIL34962.1、QLG52127.1的同源性比其他E.coli株更高，均為99.1%。E.coli與其它各屬細菌OmpA氨基酸序列同源性詳見表3。

表3 各屬間細菌OmpA氨基酸序列同源性Table 3 Amino acid sequence homology of OmpA from bacteria of different genus

將29株細菌OmpA氨基酸序列進行對比分析顯示，氨基酸變異的區(qū)域主要集中在40~55 aa、84~93 aa、126~134 aa、143~153 aa、165~176 aa、192~205 aa、237~249 aa、266~275 aa、292~304 aa、313~320 aa十個區(qū)域，其中前3個和第5個氨基酸突變區(qū)域分別位于膜外4個Loop上；第4個和后5個氨基酸突變區(qū)域位于跨膜區(qū)域上。不同菌株的4個Loop區(qū)域存在著大量氨基酸變異，第1個Loop（Loop1）和第3個Loop（Loop3）區(qū)域比其他區(qū)域變異多，而各Loop兩端附近的跨膜區(qū)域往往高度保守。結(jié)果詳見圖3。

圖3 OmpA氨基酸序列對比分析Fig.3 Amino acid sequence alignment of OmpA from strains

2.5 OmpA的CD4+T細胞表位和線性B細胞表位預(yù)測結(jié)果

根據(jù)預(yù)測結(jié)果分析，各細菌OmpA表位預(yù)測的重疊部分存在共同表位的可能性大。由此得出，各屬細菌OmpA上存在1個共同的CD4+T細胞優(yōu)勢表位，表位的具體位置和氨基酸序列詳見表4。表位由9個氨基酸組成且高度保守，表位氨基酸序列中僅6個別菌存在第3位的I突變?yōu)閂、第9位的A突變?yōu)镾。

各屬細菌存在OmpA上存在6個共同的線性B細胞優(yōu)勢表位，表位1、2、3和4位于膜外的Loop1、Loop2、Loop3和Loop4上，表位5和6位于跨膜區(qū)域上，且各表位都存在著不同程度的變異，結(jié)果詳見表 5和表6。

表4 OmpA的CD4+T細胞表位預(yù)測結(jié)果Table 4 Prediction results of CD4+T cell epitopes in OmpA

表5 OmpA的線性B細胞表位預(yù)測結(jié)果Table 5 Prediction results of linear B cell epitopes in OmpA

表6 OmpA的線性B細胞表位預(yù)測結(jié)果Table 6 Prediction results of linear B cell epitopes in OmpA

3 討論

研究根據(jù)相關(guān)報道，選擇了引起奶牛乳房炎的腸桿菌科8個菌屬的29株細菌OmpA進行了生物信息學(xué)分析。為了使分析數(shù)據(jù)具有代表性和說服力，每個菌屬至少選取3株細菌的OmpA序列進行比較和分析。

通過對各菌株OmpA的理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)二三級結(jié)構(gòu)、氨基酸同源性、CD4+T細胞表位以及線性B細胞表位等初步分析表明，蛋白理化性質(zhì)穩(wěn)定，屬于親水性蛋白，具有良好抗原性；屬內(nèi)菌株OmpA氨基酸序列高度同源，屬間菌株OmpA同源性在99.7%~69.3%之間；各菌屬菌株都存在1個保守的共同CD4+T細胞表位，6個不同程度變異的共同線性B細胞表位。

在抗原誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答過程中，抗原提成細胞通過提呈CD4+T細胞表位來刺激CD4+T細胞活化，并分化成各種輔助性T細胞，進而發(fā)揮調(diào)節(jié)B細胞產(chǎn)生保護性抗體、促使CD8+T細胞活化和增強吞噬細胞功能等作用[18]。因此，對OmpA的共同CD4+T細胞表位進行預(yù)測分析，在各菌OmpA分子上存在1個共同CD4+T細胞表位，由9個氨基酸組成，但存在兩個氨基酸變異，即I突變?yōu)閂和A突變?yōu)镾。I和V兩種氨基酸均為支鏈、非極性氨基酸，pH均為5.5~6.5，但I比V多出一個-CH2-，由此分析它們之間的變異可能不會影響表位的性質(zhì)和功能。A與S兩種氨基酸均為3碳氨基酸，A的pH5.5~7.0，非極性氨基酸；S的pH5.5~6.5，但S帶-OH，為不帶電荷的極性氨基酸，實驗室在研究CD4+T細胞表位時，曾將S突變?yōu)锳，表位的性質(zhì)和功能沒有明顯變化，僅表現(xiàn)出誘導(dǎo)CD4+T細胞產(chǎn)生的IL-17水平略有降低[19]?？梢钥闯觯珻D4+T細胞表位保守性良好，各屬細菌間可能會誘導(dǎo)CD4+T細胞交叉免疫應(yīng)答，且與交叉免疫保護作用密切相關(guān)[20]。

B細胞表位是抗原分子中被B細胞受體和抗體特異性識別并結(jié)合的部位。對OmpA的線性B細胞表位預(yù)測分析顯示，OmpA上存在6個線性B細胞表位，從OmpA氨基端到羧基端依次稱其為表位1、2、3、4、5和6，其中前4個表位分別位于OmpA的Loop1、Loop2、Loop3和Loop4上，表位5和6則位于跨膜的區(qū)域上。伍娜娜等[21]對OmpA生物信息學(xué)分析后，預(yù)測存在4個線性B細胞表位，與預(yù)測的表位1、2、3、6一致。進一步比較不同種屬細菌的B細胞表位看出，表位5和6的氨基酸序列保守性最高，多個菌屬細菌間表位序列存在2個以下的氨基酸變異，推測多能產(chǎn)生抗體交叉反應(yīng)；表位2和4在多個菌屬細菌間存在2~3個氨基酸變異，而表位1和3在多個菌屬細菌間存在3個以上的氨基酸變異，變異較多的可能會影響抗體反應(yīng)性。因此推測，在B細胞表位氨基酸變異少的菌屬細菌間，如E.coli與志賀氏菌、沙門氏菌、克雷伯氏菌間可能會發(fā)生抗體交叉反應(yīng)。呼銳[14]研究證實，用E.coli OmpA免疫小鼠后，小鼠可一定程度抵抗志賀氏菌和克雷伯氏菌攻擊，說明它們存在著交叉免疫保護作用，進一步講很可能存在抗體交叉反應(yīng)。當(dāng)然，各表位誘導(dǎo)抗體交叉反應(yīng)、提供交叉免疫保護的確切結(jié)論尚需要進一步的直接試驗證據(jù)。

上述各菌屬細菌的OmpA同源性較高，免疫原性良好，且存在保守的共同CD4+T細胞表位和能夠誘導(dǎo)抗體交叉反應(yīng)的B細胞表位，為研究開發(fā)OmpA作為預(yù)防由腸桿菌科不同細菌引起的奶牛大腸桿菌性乳房炎候選疫苗帶來信心，也為建立相關(guān)的血清學(xué)檢測方法提供參考。因此，研究具有重要的實際意義和應(yīng)用價值。