滑艷敏，楊陽，2，孫偉娜，殷麗華，柯希望，穆娟微，左豫虎

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院/黑龍江省作物有害生物互作生物學(xué)及生態(tài)防控重點實驗室，國家雜糧工程技術(shù)研究中心，大慶 163319；2.四川省廣元市昭化區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局；3.黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院植物保護(hù)研究所）

小豆（Vigna argularis）是我國重要的雜糧作物，在全國各地均有種植，黑龍江省是我國小豆的主要產(chǎn)區(qū)[1]。據(jù)統(tǒng)計2018年黑龍江省小豆產(chǎn)量達(dá)11.90萬t，占全國小豆總產(chǎn)量的42.82%[2]。然而，由豇豆單胞銹菌（Uromyces vignae）引起的小豆銹病[3]，在我國各小豆種植區(qū)均有發(fā)生，對小豆的產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生了嚴(yán)重影響。挖掘小豆抗銹病基因，培育及合理利用抗性品種是小豆銹病可持續(xù)控制的關(guān)鍵。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物中重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物應(yīng)答生物、非生物脅迫中起到了重要的調(diào)控作用[4]。目前在高粱（Sorghum bicolor）[5]、向日葵（Helianthus annuus）[6]、甜瓜（Cucumis melo）[7]等眾多植物基因組中均鑒定到了WRKY家族基因。高度保守的WRKY結(jié)構(gòu)域是WRKY基因家族的典型結(jié)構(gòu)特征，WRKY結(jié)構(gòu)域長度約60個氨基酸殘基，包含位于N端的七肽域和位于C端的鋅指結(jié)構(gòu)，在WRKY轉(zhuǎn)錄因子中，鋅指結(jié)構(gòu)有C2H2（CX4-5CX22-23HXH）和C2HC（CX7CX23HXC）兩種類型[8]。根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)類型，WRKY家族可分為GroupⅠ、Ⅱ、Ⅲ等3個亞家族，其中GroupⅠ包含2個典型的WRKY結(jié)構(gòu)域，分別位于N-端和C-端；GroupⅡ和GroupⅢ通常僅有1個WRKY結(jié)構(gòu)域，二者的區(qū)別在于GroupⅡ的鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2型，而GroupⅢ為C2HC型。此外，根據(jù)進(jìn)化關(guān)系，GroupⅡ可進(jìn)一步分為Ⅱ-a、Ⅱ-b、Ⅱ-c、Ⅱ-d、Ⅱ-e等5個亞組[9]。

大量研究表明，WRKY可通過激活或抑制植物防衛(wèi)反應(yīng)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)植物對生物或非生物逆境的適應(yīng)性[10]。如在水稻中，過量表達(dá)WRKY家族GroupⅡ-a亞家族成員OsWRKY62.1可顯著抑制防衛(wèi)反應(yīng)基因的表達(dá)，從而減弱水稻對白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo）侵染的免疫反應(yīng)，OsWRKY62在水稻抗白葉枯病中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用[11]。然而，Vo K等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在水稻中過表達(dá)WRKY基因OsWRKY67可增強水稻的抗病能力，在水稻應(yīng)答白葉枯病菌和稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）侵染過程中發(fā)揮正調(diào)控作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在小麥中過量表達(dá)大麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子HvWRKY6和HvWRKY70均不同程度提高了小麥對條銹菌（Puccinia striiformis）和白粉菌（Blumeria gramnis）的抗性[13]。上述研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物抵抗生物脅迫過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

然而，有關(guān)小豆基因組中WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因的數(shù)量、結(jié)構(gòu)特點及其在小豆應(yīng)答銹菌侵染過程中的作用仍不十分明確。因此，為深入探索小豆WRKY轉(zhuǎn)錄因子在抗銹病中的功能，以小豆全基因組[14]為參考，利用生物信息學(xué)方法，分析了小豆基因組中WRKY轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)量及其序列特征，并比較分析了小豆WRKY與其他物種WRKY基因家族的進(jìn)化關(guān)系，以期從分子進(jìn)化的角度深入認(rèn)識小豆WRKY基因家族的特征及功能。在此基礎(chǔ)上，利用課題組前期獲得的抗病品種“QH1”接種后24 h和48 h的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，初步明確了小豆WRKY家族成員在小豆抗銹病過程中的表達(dá)模式，為深入解析小豆抗銹病的分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 小豆WRKY基因家族鑒定及染色體定位

小豆全基因組數(shù)據(jù)下載自NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）[15]。參考蘋果[16]和甜菜[17]WRKY基因家族鑒定的方法，鑒定小豆全部WRKY基因。以基因組注釋信息為依據(jù)，利用TBtools[18]對小豆WRKY基因染色體定位進(jìn)行可視化。

1.2 小豆WRKY基因家族序列特征及系統(tǒng)發(fā)育分析

利用DNAMAN8.0分析小豆WRKY基因的保守域及序列特征，參考Rushton等[8]和Eulgem等[9]的分類依據(jù)，對小豆WRKY基因家族成員進(jìn)行分類。并以擬南芥WRKY家族GroupⅡ亞家族成員的蛋白序列（序列下載自https：//www.arabidopsis.org/index.jsp）為參考，利用MEGA 7軟件，采用Neighbor-Joining（NJ）（Bootstrap=1 000）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，明確小豆WRKY GroupⅡ亞家族成員的分類。

1.3 小豆WRKY基因家族成員在小豆抗銹病過程中的表達(dá)分析

為初步了解WRKY轉(zhuǎn)錄因子在小豆抵抗銹菌侵染中的作用，從NCBI下載課題組前期獲得的高抗銹病品種“QH1”接種后24和48 h的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)下載自NCBI SRA數(shù)據(jù)庫（數(shù)據(jù)編號：SRP130843，鏈接：https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=SRP130843），用于分析小豆WRKY基因家族成員在小豆應(yīng)答銹菌侵染過程中的表達(dá)模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 小豆WRKY基因家族成員鑒定及染色體定位分析

小豆全基因組中共有90個WRKY轉(zhuǎn)錄因子，蛋白序列特征分析表明，90個WRKY轉(zhuǎn)錄因子有47個呈酸性，42個呈堿性，1個呈中性。分子量在16.0～65.3 kDa之間，氨基酸序列長度在139～600 aa之間，理論等電點在4.91～9.99之間。染色體定位結(jié)果顯示，90個成員中有18個定位未能組裝到染色體的Scanffold上，其余成員在小豆11條染色體（Chromosome，Chr）上均有分布，其中Chr3分布數(shù)量最多為12個，最少的為Chr8僅有1個（圖1）。

圖1 小豆WRKY基因家族染色體定位Fig.1 Chromosome distribution of WRKY gene in Vigna angularis

2.2 小豆WRKY序列特征分析及基因家族分類

利用DNAMAN軟件，對小豆WRKY基因家族成員的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對，依據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)量及鋅指結(jié)構(gòu)類型，小豆90個WRKY家族成員可分為GroupⅠ、Ⅱ、Ⅲ等3個亞家族。其中GroupⅠ有17個成員，GroupⅡ有61個成員，GroupⅢ有12個成員。對不同亞家族成員蛋白序列的特征分析發(fā)現(xiàn)，與保守的WRKY七肽域氨基酸序列[WRKYGQK]相比，小豆WRKY家族成員在七肽域的多個位點都存在不同類型的氨基酸取代或丟失（表1）。如GroupⅠ成員XP_017434665.1的C端七肽域發(fā)生了整體丟失（圖2，紅色方框），XP_017441624.1序列N端的WRKY七肽域第六位的谷氨酰胺（Q）被谷氨酸（WRKYGEK）取代。除七肽域存在氨基酸取代外，該亞家族成員的C端鋅指結(jié)構(gòu)存在一個氨基酸的插入，由CX4CX22HXH變?yōu)镃X4CX23HXH（圖2）；與GroupⅠ相似，GroupⅡ部分成員七肽域第二位點的精氨酸（R）被賴氨酸（WKKYGQK）取代，或第六位的谷氨酰胺（Q）被賴氨酸（WRKYGKK）取代。GroupⅡ個別成員C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)（CX4-5CX22-23HXH）序列中的半胱氨酸（C）和組氨酸（H）中間存在缺失（圖3，紅色方框），或在兩個組氨酸（H）中間存在1個單插入（圖3，紅色箭頭）等變異類型；而GroupⅢ亞家族成員的七肽域則沒有發(fā)生氨基酸取代，都為典型的WRKYGQK，但個別成員的C2HC型鋅指結(jié)構(gòu)（CX7CX23HXC）序列存在變異，如XP_017408549.1的鋅指結(jié)構(gòu)在兩個半胱氨酸（C）中間存在單個氨基酸的缺失（圖4，紅色方框）。

表1 小豆WRKY家族成員七肽域和鋅指結(jié)構(gòu)的氨基酸變異類型Table 1 Amino acid substitution types in heptapeptide domain and zinc finger structure of WRKY family members in Vigna angularis

圖2 小豆WRKY基因家族GroupⅠ亞家族成員氨基酸序列特征Fig.2 Characteristics of the amino acid sequences of Vigna angularis WRKY gene family GroupⅠsubfamily members

采用MEGA7軟件，利用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建小豆90個WRKY轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）顯示，GroupⅢ和GroupⅠ亞家族成員分別聚為一簇，而GroupⅡ亞家族成員則較為分散，研究表明，根據(jù)氨基酸數(shù)量的差異GroupⅡ又分可為多個亞類，為進(jìn)一步確定小豆WRKY基因家族GroupⅡ的分類，將已知類型的擬南芥WRKY GroupⅡ成員的氨基酸序列與小豆GroupⅡ成員共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖6），結(jié)果表明，小豆GroupⅡ的61個成員明顯被區(qū)分為Ⅱ-a（6個）、Ⅱ-b（16個）、Ⅱ-c（21個）、Ⅱ-d（7個）和Ⅱ-e（11個）5個亞類（圖6），其中GroupⅡ-a和GroupⅡ-b，GroupⅡ-d和GroupⅡ-e親緣系更近，GroupⅡ-c的不同成員在進(jìn)化樹中分布在3個不同的枝上。

圖3 小豆WRKY基因家族GroupⅡ亞家族成員氨基酸序列特征Fig.3 Characteristics of the amino acid sequences of Vigna angularis WRKY gene family GroupⅡsubfamily members

圖4 小豆WRKY基因家族GroupⅢ亞家族成員氨基酸序列特征Fig.4 Characteristics of the amino acid sequences of Vigna angularis WRKY gene family GroupⅢsubfamily members

圖5 小豆WRKY基因家族成員系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.5 Phylogenetic analysis of the WRKY gene family members of Vigna angularis

2.3 小豆WRKY成員應(yīng)答銹菌侵染的表達(dá)模式

為初步了解小豆WRKY基因家族在小豆抗銹病中的作用，利用1.3中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（SRP130843）對90個小豆WRKY家族成員的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，90個基因中有82個基因在不同程度表達(dá)，依據(jù)各基因RPKM（Reads Per Kilobase per Million mapped read）值對82個WRKY成員在抗病品種中應(yīng)答銹菌侵染的表達(dá)模式進(jìn)行聚類后發(fā)現(xiàn)，82表達(dá)的WRKY成員中，接菌后24 h上調(diào)表達(dá)的有16個（圖7-①）；接菌后24 h和48 h均上調(diào)表達(dá)的有18個（圖7-②）；接菌后24和48 h下調(diào)表達(dá)的有4個（圖7-③）；接種后48 h上調(diào)表達(dá)的成員29個（圖7-④）；其余15個成員的表達(dá)不受銹菌侵染的影響，但接種無菌水后48 h的表達(dá)水平高于接種無菌水后24 h（圖7-⑤），暗示這些成員可能在小豆生長過程中發(fā)揮重要作用。

3 結(jié)論與討論

研究基于小豆基因組數(shù)據(jù)，系統(tǒng)分析了小豆WRKY基因家族成員的數(shù)量、結(jié)構(gòu)特征及其應(yīng)答銹菌侵染的表達(dá)模式，明確了小豆基因組中共包含90個WRKY成員，依據(jù)結(jié)構(gòu)特征及進(jìn)化關(guān)系，小豆WRKY基因家族分化為GroupⅠ、Ⅱ和Ⅲ等3個亞家族，蛋白序列特征分析表明，小豆WRKY家族成員在保守的WRKY結(jié)構(gòu)域上存在多種變異，且七肽域上的氨基酸取代常發(fā)生于第6個氨基酸位點，而鋅指結(jié)構(gòu)的變異則以個別位點的氨基酸插入或缺失為主?；谵D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的表達(dá)模式分析表明，90個WRKY成員中有82個成員不同程度表達(dá)，其中63個成員的表達(dá)受病原菌侵染的影響，表明WRKY家族基因在小豆應(yīng)對銹菌侵染過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。

圖6 小豆WRKY家族GroupⅡ成員與擬南芥WRKY家族GroupⅡ成員的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.6 Phylogenetic analysis of Group II members of Vigna angularis WRKY family and GroupⅡmembers of WRKY family in Arabidopsis thaliana

WRKY轉(zhuǎn)錄因子作為植物中最大的基因家族之一[10]，已在多種植物的基因組中被鑒定。從成員數(shù)量看，在小豆基因組中共包含90個WRKY家族成員，與菜豆（Phaseolus vulgaris）的WRKY家族成員數(shù)量一致[19]，高于鷹嘴豆（Cicer arietinum）的70個[20]，但低于大豆（Glycine max）的188個[21]。家族成員眾多可能是WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物中調(diào)控發(fā)育過程及逆境適應(yīng)性的基礎(chǔ)。研究表明，WRKY基因家族存在明顯的家族分化現(xiàn)象，依據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和序列特征，WRKY基因家族常被分為GroupⅠ、Ⅱ、Ⅲ等3個亞家族，且GroupⅡ亞家族進(jìn)一步分化出了Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd和Ⅱe等5個亞組，如擬南芥[9]、大豆[21]等的GroupⅡ亞家族都存在類似的分化。研究同樣發(fā)現(xiàn)，小豆90個WRKY成員同樣分屬于GroupⅠ、Ⅱ、Ⅲ等3個亞家族，且GroupⅡ也存在類似的5個亞組的分化（圖6），暗示小豆WRKY家族成員與擬南芥、大豆等植物的WRKY家族存在類似的演化模式。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子的七肽域和鋅指結(jié)構(gòu)是該家族基因發(fā)揮功能的關(guān)鍵DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，大量研究表明，該DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的差異是WRKY基因家族在植物中功能多樣性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[10]。研究發(fā)現(xiàn)，小豆WRKY家族成員七肽域常在第6位氨基酸處發(fā)生取代，且最常見的取代類型為谷氨酰胺（Q）突變?yōu)楣劝彼幔‥）或賴氨酸（K），即WRKYGQK突變?yōu)閃RKYGEK或者WRKYGKK。與研究結(jié)果相似，玉米WRKY家族部分成員七肽域[WRKYGQK]第6位的谷氨酰胺[Q]被賴氨酸[K]取代[22]。除第6位氨基酸發(fā) 生取代外，小豆WRKY七肽域第2位的精氨酸（R）常被賴氨酸（K）取代。目前的研究發(fā)現(xiàn)，七肽域第2位發(fā)生變異的情形在少數(shù)WRKY成員中存在，除R被K取 代 外，也 存 在WIKY、WVKY、WKRY和WSKY等變異類型[14]。此外，小豆WRKY家族成員還出現(xiàn)了N-端七肽域缺失的情形，該類突變在其他物種中目前報道較少。綜上所述，小豆WRKY家族成員在關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域上變異的多樣性，預(yù)示其在小豆生長發(fā)育及逆境應(yīng)答中通過調(diào)控不同基因的表達(dá)以發(fā)揮作用。

WRKY作為在植物中調(diào)控免疫的重要轉(zhuǎn)錄因子家族，同時具備正向和負(fù)向調(diào)節(jié)植物免疫的功能[4]。如海島棉GbWRKY003、GbWRKY020、GbWRKY075等在黃萎病菌侵染后下調(diào)表達(dá)，而GbWRKY020的表達(dá)則受黃萎病菌的顯著誘導(dǎo)，通過正向或負(fù)向調(diào)控的作用參與棉花對黃萎病的抗性[23]。同樣在辣椒中，CaWRKY58受青枯病菌誘導(dǎo)后表達(dá)量下調(diào)[24]，但CaWRKY6和CaWRKY40則在抗青枯病菌中發(fā)揮正調(diào)控作用[25]。研究對小豆WRKY成員的表達(dá)分析同樣顯示，90個成員中的80個在小豆應(yīng)答銹菌侵染過程中不同水平表達(dá)，其中受銹菌侵染上調(diào)表達(dá)的成員34個，下調(diào)表達(dá)的有33個，表明小豆WRKY家族成員在小豆應(yīng)答銹菌侵染過程中同樣具備正向和負(fù)向調(diào)控抗病的可能，但WRKY家族基因是如何調(diào)控小豆對銹病抗性的仍需要進(jìn)一步的試驗驗證。

圖7 小豆WRKY基因家族成員應(yīng)答銹菌侵染的表達(dá)分析Fig.7 Expression analysis of Vigna angularis WRKY gene family members responding to rust infection