臧淦榮 向 文王 莉# 周 寧

1 長興縣中醫(yī)院 浙江 長興 313100

2 湖州市食品藥品檢驗研究院 浙江 湖州 313000

絞股藍為葫蘆科植物絞股藍Gynostemma pentaphyllum(Thunb)Makino的干燥地上部分，目前關于絞股藍化學成分的研究主要集中皂苷類成分，對其中的黃酮類成分的研究較少。對絞股藍總黃酮含量的測定目前主要有分光光度法、三波長-光譜法和高效液相色譜法。本實驗采用高效液相色譜法建立絞股藍黃酮類成分指紋圖譜，并進行相似度評價、聚類分析和主成分分析，旨在為絞股藍的質量評價和資源的充分利用提供科學依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器：高效液相色譜儀（美國Waters公司）；十萬分之一分析天平［XS205DU，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司］；KQ3200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料：乙腈為色譜純（德國Merck公司）；甲醇分析純（南京化學試劑股份有限公司）；磷酸色譜純（南京化學試劑股份有限公司）；對照品：蘆丁（11086-202012，91.6%）、槲皮素（100081-201610，99.1%）、山柰素（山柰酚）（11086-202013，93.2%）均購自中國食品藥品檢定研究院；安徽和浙江兩省23批絞股藍樣品來源信息見表1，經(jīng)湖州市食品藥品檢驗研究院陳敏主任中藥師鑒定，均為葫蘆科佛手瓜族絞股藍屬絞股藍亞屬絞股藍原變種G.pentaphyllum var.pentaphyllum的地上部分。

表1 23批絞股藍樣品來源信息

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備：取絞股藍樣品粉碎，過二號篩，精密稱取0.25g，置于150mL三角瓶中，精密加入80%乙醇25mL，密閉，稱重，加熱回流45min，冷卻，再稱重，用80%乙醇補足失重，搖勻，用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2 對照品溶液的制備：取蘆丁、槲皮素、山柰素對照品精密稱定，置25mL棕色量瓶中，加80%乙醇制成每毫升含蘆丁332.30μg，槲皮素88.07μg，山 柰 素42.11μg的混合溶液，即為混合對照品溶液。

2.3 色譜條件：色譜柱：Ultimate Plus C18（250×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.01%磷酸溶液（B）；梯度洗脫：0～8min，15%→20%A；8～30min，20%→35%A；30～35min，35%→40%A；35～40min，40%→70%A；40～45min，70%→100%A；45～50min，100%A；50～55min，100%→15%；檢測波長：368nm；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；進樣量：10μL。

2.4 方法學考察：分述如下。

2.4.1 精密度試驗：取絞股藍樣品S1，采用“2.1”項下的方法制備成供試品溶液，按“2.3”項下的色譜條件連續(xù)進樣分析6次，以3號蘆丁色譜峰為參照峰(S)，計算得到各共有峰的相對保留時間RSD均小于0.55%，相對峰面積RSD均小于1.95%；采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”進行處理，與對照指紋圖譜相似度均大于0.995，表明該儀器精密度良好。

2.4.2 重復性試驗：取絞股藍樣品S1，采用“2.1”項下的方法制備6份供試品溶液，按“2.3”項下的色譜條件進樣分析，以3號蘆丁色譜峰為參照峰(S)，計算得到各共有峰相對保留時間RSD均小于0.95%，相對峰面積RSD均小于2.75%；采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”進行處理，與對照指紋圖譜相似度均大于0.990，表明該方法重復性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗：取絞股藍樣品S1，采用“2.1”項下的方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24、36、48h進樣測定，以3號蘆丁色譜峰為參照峰(S)，計算得到各共有峰的相對保留時間RSD小于1.95%，相對峰面積RSD均小于3.75%；采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”進行處理，計算得到其與對照指紋圖譜相似度均大于0.992，表明供試品溶液在48h內穩(wěn)定性良好。

2.4.4 加樣回收率實驗：取已知含量的絞股藍藥材樣品S1（24.32mg/g），稱定6份樣品份0.25g，精密稱定，每份分別精密加入6mg的蘆丁對照品，采用“2.1”項下的方法制備供試品溶液，按“2.3”項下的色譜條件進樣分析計算，蘆丁的平均回收率為98.23%，RSD為0.86%，表明該方法回收率良好。

2.5 指紋圖譜的建立與評價：分述如下。

2.5.1 指紋圖譜的建立：取23批絞股藍樣品，采用“2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。將所有數(shù)據(jù)導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”，以樣品S1色譜圖為參照圖譜，設定時間窗寬度為0.2min，選擇平均數(shù)法生成對照圖譜，運用多點校正法對色譜峰進行匹配，生成疊加圖譜及對照圖譜。以S23樣品圖譜為參照進行指紋匹配，確定共有峰39個。通過對照品比對指認了3個色譜峰：蘆丁、槲皮素、山柰素。

2.5.2 相似度評價：將23批絞股藍樣品色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”，進行相似度評價，結果如表2所示。23批絞股藍樣品與對照圖譜的相似度為0.928～0.995，說明不同產(chǎn)地間絞股藍樣品的質量存在一定的差異。安徽產(chǎn)地的絞股藍樣品相似度的RSD為2.23%，浙江產(chǎn)地的絞股藍樣品相似度的RSD為1.35%，表明同一產(chǎn)地絞股藍樣品也存在差異，浙江產(chǎn)地絞股藍樣品比安徽產(chǎn)地相對穩(wěn)定。

表2 23批絞股藍樣品與生成對照圖譜相似度評價結果

2.5.3 聚類分析：將23批絞股藍樣品色譜圖數(shù)據(jù)導入SPSS 23.0軟件，采用組間連接法，以余弦距離法作為樣品間距離計算方法進行系統(tǒng)聚類分析，結果當判別距離為5時，23批絞股藍樣品被分為4大類：安徽滁州S22、安徽旌德S23、安徽宣城S18、安徽黃山S14、浙江磐安S12、安徽六安S13、安徽新杭S15、安徽郎溪S16、安徽定遠S21為一類，安徽蕪湖S17一類，浙江諸暨S05和浙江臨安S09為一類，其余11批樣品被聚為一類。從整體來看，這23批絞股藍的質量與產(chǎn)地相關性較小、組間距離較小，同一省份絞股藍也可分在不同的組，與相似度評價結果一致。

2.5.4 主成分分析：利用SPSS 23.0軟件對峰面積進 行標準化處理后，對23批絞股藍樣品指紋圖譜所得的共有峰中峰面積較大的39個共有峰進行主成分分析，計算相關矩陣的特征值及方差貢獻率，見表3和表4。提取了6個因子的累計方差貢獻率為93.93%，特征值均大于1，可代表絞股藍指紋圖譜39個共有峰的大部分信息，來計算主成分得分。對主成分載荷值進行計算，得出各主成分的線性模型：成分綜合總得分M=0.29×Z峰1+0.31×Z峰2+0.45×Z峰3（蘆丁）+0.25××Z峰4+0.47×Z峰5+0.23×Z峰6+0.64×Z峰7+0.46×Z峰8+0.49×Z峰9+0.58×Z峰10+0.49×Z峰11+0.31×Z峰12+0.73×Z峰13+0.16×Z峰14+0.30×Z峰15+0.77×Z峰16+0.37×Z峰17（槲皮素）+0.62×Z峰18+0.01×Z峰19+0.63×Z峰20+0.63×Z峰21（山柰素）+0.50×Z峰22+0.57×Z峰23+0.94×Z峰24+0.69×Z峰25+0.65×Z峰26+0.74×Z峰27+0.81×Z峰28+0.85×Z峰29+0.56×Z峰30-0.14×Z峰31+0.69×Z峰32+0.44×Z峰33+0.51×Z峰34+0.23×Z峰35+0.34×Z峰36+0.31×Z峰37+0.63×Z峰38-0.15×Z峰39，其中M代表綜合主成分，Z峰1→Z峰39分別對應39個色譜峰峰面積的標準化數(shù)據(jù)。綜合得分越高說明質量越好，絞股藍樣品綜合得分情況如表5所示，浙江省的麗水、樂清、龍游、臨安、磐安等地絞股藍的評分較高，浙江省的湖州、江山、安徽省的宣城、定遠等地絞股藍評分均較低。從整體來看，安徽產(chǎn)地絞股藍樣品的得分分布相對集中，絞股藍樣品質量相對一致；浙江產(chǎn)地的分布區(qū)間較大，絞股藍樣品質量變化較大。

表3 主成分特征值及累計方差百分比

表5 絞股藍樣品綜合得分表

以23批絞股藍樣品指紋圖譜的39個共有峰峰面積為變量，采用SIMCAD 13.0軟件進行偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）分析，結果標記出6個貢獻較大的成分，依次為17（槲皮素）、27、28、29、30、37、38號色譜峰，導致了絞股藍成分含量上的差異，因此在制定絞股藍的質量標準時，采用多指標成分進行質量控制。

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化：①檢測波長的選擇：絞股藍中黃酮類有蘆丁、山柰素（山奈酚）、商陸素、商陸苷、槲皮素、異鼠李素等。黃酮類成分的紫外吸收波段為300～400nm，通過二極管陣列檢測器DAD全波段比較分析發(fā)現(xiàn)368nm下絞股藍出峰較為豐富，各色譜峰響應值較高，基線較平，因此選擇368nm作為絞股藍高相液相指紋圖譜的檢測波長。②流動相：分別考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸溶液和乙腈-0.1%醋酸酸溶液4種流動相體系，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.05%磷酸溶液為流動相時，色譜圖基線較平穩(wěn)，峰分離度較好。再次分別考察乙腈-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液3種流動相體系，最終選擇乙腈-0.1%磷酸溶液為絞股藍高相液相指紋圖譜的流動相。

3.2 供試品溶液制備條件的優(yōu)化：以蘆丁、槲皮素、山柰素的提取率為指標，采用正交響應面法來確定絞股藍樣品的供試品溶液的制備方法。稱樣量：0.10g→25mL、0.20g→25mL、0.30g→25mL、0.50g→25mL；提取溶劑：甲醇、80%甲醇、50%甲醇、乙醇、80%乙醇、50%乙醇；提取方式：超聲處理15min、超聲處理30min、超聲處理60min、加熱回流15min、加熱回流30min、加熱回流60min。將試驗結果通過方差分析找出最優(yōu)組合為：稱取絞股藍樣品0.25g，精密加入80%乙醇25mL，加熱回流45min。

3.3 指紋圖譜相似度評價：葫蘆科絞股藍屬植物基源復雜、品類繁多，全球共有16種2變種，其中我國有14種2變種，是絞股藍屬植物中分布最廣變化最大的一個種，有3小葉、5～7小葉和9小葉的類型，產(chǎn)陜西南部和長江以南各省區(qū)。來自浙江和安徽兩省的23批絞股藍樣品與對照圖譜的相似度為0.928～0.995，說明不同產(chǎn)地間絞股藍樣品的質量存在差異。但是所收集絞股藍樣品涵蓋的地域范圍較廣數(shù)量有限，接下來研究中集中一定區(qū)域內的絞股藍并結合絞股藍皂苷類成分研究來用于絞股藍的質量評價。

3.4 聚類分析：根據(jù)23批絞股藍樣品色譜圖和含量測定結果可知，絞股藍黃酮類成分和含量差異較大，僅通過相似度的比較尚不能完全體現(xiàn)絞股藍品質的差異性，還進行聚類分析和主成分分析。同一省份絞股藍也可分在不同的組，浙江產(chǎn)的絞股藍分布在3個組中，安徽的也分布3個組其中有個產(chǎn)地單獨為一組（安徽蕪湖S17），與相似度評價結果一致。