周 琴 董 軍 蔣永海 王偉倩 鄧俊杰

1 紹興市中醫(yī)院 浙江 紹興 312000

2 紹興市食品藥品檢驗研究院 浙江 紹興 312071

前胡為傘形科植物白花前胡（Peucedanum praeruptorum Dunn）的干燥根。功能降氣化痰，散風(fēng)清熱，用于痰熱喘滿，咯痰黃稠，風(fēng)熱咳嗽痰多[1]。為了解決中藥材農(nóng)藥殘留問題，2020版《中華人民共和國藥典》2341農(nóng)藥殘留測定法中新增了第五法，對中藥藥材及飲片（植物類）中禁用農(nóng)藥多殘留做了相關(guān)要求[1]。依據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)，本研究采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）對浙江臨安、浙江淳安、安徽安國、四川廣元、貴州畢節(jié)5個產(chǎn)地前胡中的農(nóng)藥殘留進行測定，并分析檢測結(jié)果。

1 儀器與試藥

1.1 儀器：Agilent 8890B-7000D氣相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，Agilent1260-6470高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，超純水儀（美國Millipore公司），百萬分之一電子天平（梅特勒-托列多儀器上海有限公司），Auto EVA 80高通量全自動平行濃縮儀（?？萍瘓F）、移液槍、容量瓶、渦旋混合儀、三號篩、離心機。

1.2 試藥：藥材來源：前胡樣品分別來源于浙江臨安、浙江淳安、安徽安國、四川廣元和貴州畢節(jié)，經(jīng)紹興市食品藥品檢驗研究院蔣永海主任中藥師鑒定為傘形科植物白花前胡的根，標(biāo)本存放于原藥材標(biāo)本室。試劑：甲酸（CNW V6300090）、甲酸銨（CNW Q7400014）、乙腈（RCI LABSCAN 18 03 0034）、超純水：電阻率18.2MΩ.cm（美國Millipore公司）；禁用農(nóng)藥混合對照品溶液（安譜：D6850065）及相關(guān)化學(xué)品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；HLB固相萃取柱；內(nèi)標(biāo)溶液：磷酸三苯酯（安譜：G172525）。

2 方法

2.1 GC-MS/MS色譜條件：具體如下。

2.1.1 GC色譜條件：用（50%苯基）-甲基聚硅氧烷為固定液的彈性石英毛細管柱Agilent VF-17MS（柱長為30m，柱內(nèi)徑為0.25mm，膜厚度為0.25μm）。進樣口溫度280℃，不分流進樣。載氣為高純氦氣（He）。進樣口為恒壓模式，柱前壓力為146kPa。程序升溫：初始溫度80℃，保持1min，以20℃/min升至200℃，再以每分鐘2℃的速率升溫至230℃，最后以每分鐘25℃的速率升溫至320℃，保持3min。

2.1.2 GC質(zhì)譜條件：以三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測；離子源為電子轟擊源（EI），離子源溫度250℃。碰撞氣為高純氦氣。質(zhì)譜傳輸接口溫度320℃。質(zhì)譜監(jiān)測模式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），各化合物監(jiān)測離子對、碰撞電壓（CE）等。見表1。為提高檢測靈敏度，可根據(jù)保留時間分段監(jiān)測各農(nóng)藥。

表1 GC-MS/MS測定農(nóng)藥的方法學(xué)考察結(jié)果

2.2 LC-MS/MS色譜條件：具體如下。

2.2.1 色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑Poroshell 120 EC-C18（柱長10cm，內(nèi)徑為 2.1mm，粒徑為2.6μm）；以0.1%甲酸溶液（含5mmol/L甲酸銨）為流動相A，以乙腈-0.1%甲酸溶液（含5mmol/L甲酸銨）（95：5）為流動相B，按下表2進行梯度洗脫；流速為每分鐘0.3mL，柱溫為40℃。

表2 流動相梯度

2.2.2 質(zhì)譜條件：以三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測；離子源為電噴霧（ESI）離子源，正離子掃描模式。監(jiān)測模式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），各化合物參考監(jiān)測離子對、碰撞電壓（CE）見表3。為提高檢測靈敏度，可根據(jù)保留時間分段監(jiān)測各農(nóng)藥。

表3 LC-MS/MS測定農(nóng)藥的方法學(xué)考察結(jié)果

2.3 對照溶液的制備：具體如下。

2.3.1 混合對照品溶液的制備：精密量取禁用農(nóng)藥混合對照品溶液（已標(biāo)示各相關(guān)農(nóng)藥品種的濃度）1mL，置20mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，再精密量取2mL，置20mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.2 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析用內(nèi)標(biāo)溶液的制備：取磷酸三苯酯對照品適量，精密稱定，加乙腈溶解并制成每毫升含l.0mg的溶液，再取1.0mL加乙腈→100.0mL，即得。

2.3.3 空白基質(zhì)溶液的制備：取空白基質(zhì)樣品，同供試品溶液的制備方法處理制成空白基質(zhì)溶液。

2.3.4 基質(zhì)混合對照溶液的制備：分別精密量取空白基質(zhì)溶液1.0mL（6份），置Auto EVA 80高通量全自動平行濃縮儀上，40℃水浴濃縮至約0.6mL，分別加入混合對照品溶液 10μL、20μL、50μL、100μL、150μL、200μL，加乙腈稀釋至1mL，渦旋混勻，即得。

2.4 供試品溶液的制備：具體如下。

2.4.1 提?。喝」┰嚻贩勰ㄟ^三號篩）5g，精密稱定，加氯化鈉1g，立即搖散，再加入乙腈50mL，勻漿處理2min（轉(zhuǎn)速不低于每分鐘12000轉(zhuǎn)），離心（每分鐘4000轉(zhuǎn)），分取上清液，沉淀再加乙腈50mL，勻漿處理1min，離心，合并兩次提取的上清液，減壓濃縮至3～5mL，放冷，用乙腈稀釋至10.0mL，搖勻，即得。

2.4.2 凈化：量取直接提取法制備的供試品溶液3～5mL，通過親水親油平衡材料（HLB SPE）固相萃取柱（200mg，6mL）凈化，收集全部凈化液，混勻，即得。

2.5 測定：①氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法：分別精密吸取上述的基質(zhì)混合對照溶液和供試品溶液各1mL，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液0.3mL，混勻，濾過，取續(xù)濾液。分別精密吸取上述兩種溶液各1μL，注入氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，按內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算，即得。②高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法：分別精密吸取上述的基質(zhì)混合對照溶液和供試品溶液各1mL，精密加入水0.3mL，混勻，濾過，取續(xù)濾液。分別精密吸取上述兩種溶液各1μL，注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，按外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算，即得。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察：具體如下。

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測限：取不同濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（8～200ng/mL）進行測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，各農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品在各自線性范圍內(nèi)與測定值線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.99，取信噪比（S/N）約為3，計算檢測限（LOD）,結(jié)果見表1及表3。

3.1.2 加樣回收試驗：取空白樣品粉末5g，加入混合對照品溶液，按“2.3.4”項下方法制備供試品溶液并測定，結(jié)果低、中、高濃度（0.02、0.04、0.1mg/kg）的平均回收率在70.56%～138.99%，RSD在0.2%～6.3%，見表1及表3。

3.1.3 精密度試驗：取20ng/mL基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進樣6次，計算精密度，結(jié)果RSD在0.2%～9.2%，見表1及表3。

3.2 樣品中殘留農(nóng)藥測定：對5批前胡進行檢測，計算農(nóng)藥殘留量。結(jié)果5批樣品中有檢出部分農(nóng)藥測得值均在檢測限附近，判定結(jié)果為均未檢出禁用農(nóng)藥。

4 討論

4.1 基質(zhì)效應(yīng)：基質(zhì)指的是樣品中除分析物以外的組分，由于基質(zhì)效應(yīng)的存在，基質(zhì)常常對分析物的分析過程中產(chǎn)生顯著干擾，影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，前胡提取液所得的化學(xué)成分復(fù)雜，試驗發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)農(nóng)藥液相色譜質(zhì)譜基質(zhì)抑制效應(yīng)明顯，氣相色譜質(zhì)譜基質(zhì)增強效應(yīng)明顯，前胡基質(zhì)效應(yīng)不可忽視。試驗中，除了標(biāo)準(zhǔn)曲線采用前胡農(nóng)藥空白基質(zhì)配制混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液外，對提取液進行凈化處理也有助于減少基質(zhì)效應(yīng)。農(nóng)藥殘留檢測的常用凈化方式有直接提取法、QuEChERS法、SPE法、磺化法等。課題組以回收率為指標(biāo)，考察了不同凈化處理對農(nóng)藥的影響，其中直接提取法大多禁用農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)大，好多禁用農(nóng)藥離子對檢測不到，但沒干擾的禁用農(nóng)藥回收率普遍較高；QuEChERS法禁用農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)明顯小，但沒干擾的禁用農(nóng)藥回收率也會偏低；SPE法禁用農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)更小，禁用農(nóng)藥回收率普遍會達到標(biāo)準(zhǔn)要求；最終選用HLB柱凈化效果最佳[2-4]。

4.2 小結(jié)：隨著中藥的廣泛應(yīng)用，中藥材的質(zhì)量安全性是影響中藥產(chǎn)品質(zhì)量和藥效的關(guān)鍵因素,同時也嚴(yán)重制約著中藥的現(xiàn)代化和國際化發(fā)展。在中藥材種植過程中農(nóng)藥的使用對防治病蟲害,提高中藥材產(chǎn)量和保證中藥產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益起到了積極的促進作用,但是農(nóng)藥的長期使用和濫用不僅造成嚴(yán)重的環(huán)境污染,帶有農(nóng)藥殘留的中藥材進入人體后,使得中藥材本身的藥效降低,同時農(nóng)藥本身嚴(yán)重?fù)p害著人體健康[5,6]。

依據(jù)2020版中國藥典2341第五法，對五個不同產(chǎn)地的前胡進行研究，確保方法的行之有效，對中藥禁用農(nóng)藥殘留的質(zhì)量保障提供有力的研究依據(jù)，同時對不同產(chǎn)地及不同基質(zhì)的中藥項目提供了有力的支持。