沈 肖，廖良柱，旦增晉美，常思佳

（1.拉薩鐵路公安處, 拉薩 850000； 2.拉薩市公安局刑科所, 拉薩 850000）

拉薩地區(qū)位于青藏高原中部，平均海拔3 650 m，擁有“日光城”的美譽(yù)，該地氧氣稀薄，紫外線強(qiáng)烈，冬季嚴(yán)寒，夏季涼爽，具有青藏高原環(huán)境特征的典型代表性，也因此造就了法醫(yī)昆蟲(chóng)學(xué)獨(dú)特的應(yīng)用場(chǎng)景。線粒體DNA的COI序列已成熟應(yīng)用于法醫(yī)昆蟲(chóng)學(xué)種類鑒別[1-4]，其中COI-658bp的種類鑒別效果足以與COI全序列長(zhǎng)度相媲美[5]，成為了現(xiàn)今國(guó)內(nèi)外用于尸食性蠅類種類鑒別最為普遍的片段[6-8]。長(zhǎng)期以來(lái)拉薩乃至青藏高原法醫(yī)昆蟲(chóng)學(xué)的研究還處于起步階段，缺乏相關(guān)的法醫(yī)昆蟲(chóng)學(xué)案例報(bào)道[5,9]。本文通過(guò)在拉薩地區(qū)結(jié)合COI-658bp利用昆蟲(chóng)學(xué)證據(jù)對(duì)2例實(shí)際案件進(jìn)行死亡時(shí)間推斷，探究該地區(qū)法醫(yī)昆蟲(chóng)學(xué)的實(shí)際應(yīng)用。

1 案例資料

1.1 案例1

2020年7月某日，拉薩市城關(guān)區(qū)一出租屋內(nèi)發(fā)現(xiàn)一老年男性死者。該出租屋房門反鎖，門窗沒(méi)有發(fā)現(xiàn)暴力入侵的痕跡。死者俯臥在室內(nèi)的水泥地板上，尸體腐敗嚴(yán)重，顱面部部分骨骼外露，尸體絕大部分呈木乃伊化，雙側(cè)小腿背側(cè)可見(jiàn)細(xì)小腐敗水泡，尸體周圍可見(jiàn)大量黑色腐敗液體流出，尸體檢驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)機(jī)械性損傷痕跡。在現(xiàn)場(chǎng)發(fā)現(xiàn)大量的蠅類成蟲(chóng)及蛹，其中，蛹主要聚集在尸體周圍（圖1a），挪開(kāi)尸體，在地板上發(fā)現(xiàn)少量的三齡幼蟲(chóng)，現(xiàn)場(chǎng)發(fā)現(xiàn)少量的空蛹?xì)ぁ，F(xiàn)場(chǎng)走訪發(fā)現(xiàn)死者25 d前最后一次出現(xiàn)在鄰居視線。從現(xiàn)場(chǎng)采集空蛹?xì)と舾煞胖糜?5%乙醇保存并從附近氣象站收集相應(yīng)的氣溫?cái)?shù)據(jù)。

1.2 案例2

2020年7月某日，在一出租單元房?jī)?nèi)發(fā)現(xiàn)一男性尸體，門和窗被從里面反鎖，勘查人員未發(fā)現(xiàn)暴力入侵痕跡；尸體俯臥在一長(zhǎng)椅與辦公桌之間的地板上，尸體高度腐敗，右手末端骨骼外露，尸體絕大部分呈木乃伊化改變，并流出黑色腐敗液體（圖1b），尸體檢驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)機(jī)械性損傷痕跡。房間內(nèi)有少量蠅類成蟲(chóng)活動(dòng)，尸體上發(fā)現(xiàn)少量蠅類幼蟲(chóng)及蛹，現(xiàn)場(chǎng)大量蛹分布于房間內(nèi)墻角及隱蔽處（圖1b），現(xiàn)場(chǎng)未發(fā)現(xiàn)空蛹?xì)ぁＭㄟ^(guò)走訪調(diào)查，房東15 d前最后一次見(jiàn)過(guò)死者。從現(xiàn)場(chǎng)采集蛹若干置于95%乙醇中保存并從現(xiàn)場(chǎng)附近氣象站收集氣溫?cái)?shù)據(jù)。

圖1 現(xiàn)場(chǎng)情況（a：案例1現(xiàn)場(chǎng)尸體及尸體旁昆蟲(chóng)的情況；b：案例2現(xiàn)場(chǎng)尸體及房間內(nèi)蛹的分布情況）Fig.1 The scene of two cases (a: corpse and its nearby insects in case 1; b: corpse and scattered pupae in case 2)

2 檢驗(yàn)分析

2.1 案例1

結(jié)合現(xiàn)場(chǎng)走訪調(diào)查結(jié)果，從氣象站收集死者被發(fā)現(xiàn)之日至25 d前的日平均溫度為20.0 ℃?，F(xiàn)場(chǎng)收集的空蛹?xì)ぃ▓D2a）通過(guò)COI-658bp基因測(cè)序后得到基因測(cè)序結(jié)果圖（圖3a）及堿基序列，將堿基序列導(dǎo)入GenBank進(jìn)行比對(duì)鑒定，經(jīng)過(guò)比對(duì)鑒定為新陸原伏蠅Protophormia terraenovae（Robineau-Desvoidy,1830）。根據(jù)既有新陸原伏蠅P. terraenovae的等蟲(chóng)態(tài)線圖數(shù)據(jù)[10]，在20.0 ℃溫度條件下，新陸原伏蠅P.terraenovae從產(chǎn)卵到羽化需要約22 d。因此，綜合其他資料，推斷死者死亡時(shí)間范圍為22～25 d之間。

2.2 案例2

從現(xiàn)場(chǎng)附近的氣象站收集死者被發(fā)現(xiàn)之日至15 d前的日平均溫度為19.9℃。現(xiàn)場(chǎng)收集的蛹（圖2b）利用COI-658bp經(jīng)基因測(cè)序后得到基因測(cè)序結(jié)果圖（圖3b）及堿基序列，同樣將堿基序列導(dǎo)入GenBank中進(jìn)行比對(duì)，經(jīng)比對(duì)鑒定為絲光綠蠅Lucilia sericata(Meigen, 1826)。現(xiàn)場(chǎng)收集的蛹經(jīng)固定并剝開(kāi)蛹?xì)ず罂梢?jiàn)隱成蟲(chóng)的頭、胸、腹部明顯（圖2b），根據(jù)絲光綠蠅蛹的發(fā)育階段[11]，確定處于Ⅲ期。根據(jù)相關(guān)資料[10-11]，絲光綠蠅L. sericata在近似的溫度（20.0℃）下，從產(chǎn)卵到化蛹需要大約10 d，而其蛹在Ⅲ期階段生長(zhǎng)發(fā)育需要2.5～7.5 d。結(jié)合現(xiàn)場(chǎng)走訪資料，綜合推斷死者死亡時(shí)間范圍為12～15 d。

圖 2 現(xiàn)場(chǎng)收集的昆蟲(chóng)學(xué)證據(jù)（a：案例1中的空蛹?xì)?；b：案例2中的蛹（Ⅲ期））Fig.2 Entomological evidence collected at the scene (a: empty puparias collected in case 1; b: third-stage-living pupae collected in case 2)

圖3 COI-658bp基因測(cè)序結(jié)果圖（a：案例1新陸原伏蠅基因測(cè)序結(jié)果；b：案例2絲光綠蠅基因測(cè)序結(jié)果）Fig.3 Result of sequencing COI-658bp gene of (a: Protophormia terraenovae from case 1; b: Lucilia sericata in case 2)

3 討論

昆蟲(chóng)學(xué)證據(jù)在腐敗尸體的死亡時(shí)間推斷方面具有獨(dú)特的實(shí)踐價(jià)值[12-13]，本文兩個(gè)案例中尸體腐敗嚴(yán)重，運(yùn)用傳統(tǒng)尸體死后變化特征難以推斷出準(zhǔn)確的死亡時(shí)間，且現(xiàn)場(chǎng)尸體上均發(fā)現(xiàn)尸食性蠅類定殖，具有運(yùn)用法醫(yī)昆蟲(chóng)學(xué)進(jìn)行死亡時(shí)間推斷的基礎(chǔ)。目前，DNA分子技術(shù)已成熟應(yīng)用于尸食性蠅類種類鑒別方面，較傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征鑒別具有快速、高效、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，其中COI-658bp能精準(zhǔn)進(jìn)行尸食性蠅類種類鑒別[5,7-8]，且其數(shù)據(jù)庫(kù)資料齊全。因此，本文選用COI-658bp作為快速鑒別的片段，以期加快死亡時(shí)間推斷的速度。經(jīng)基因鑒定后的尸食性蠅類分別為新陸原伏蠅Protophormia terraenovae和絲光綠蠅Lucilia sericata，它們是拉薩地區(qū)夏季的優(yōu)勢(shì)種群[5]，相對(duì)于該地區(qū)其他尸食性蠅類，它們有更多的機(jī)會(huì)在尸體上侵襲、定殖。

由于蛹的羽化，導(dǎo)致尸食性蠅類成蟲(chóng)出現(xiàn)到空蛹?xì)颖静杉g的時(shí)間無(wú)法確定，因而利用尸食性蠅類生長(zhǎng)發(fā)育周期進(jìn)行死亡時(shí)間推斷的準(zhǔn)確性較弱[14]，這是目前法醫(yī)昆蟲(chóng)學(xué)應(yīng)用的一個(gè)現(xiàn)實(shí)問(wèn)題。但在案例1中，實(shí)際死亡時(shí)間與運(yùn)用法醫(yī)昆蟲(chóng)學(xué)推斷的死亡時(shí)間較為一致，得益于詳細(xì)的現(xiàn)場(chǎng)走訪調(diào)查鎖定了最長(zhǎng)死亡時(shí)間范圍。因此，在運(yùn)用法醫(yī)昆蟲(chóng)學(xué)進(jìn)行死亡時(shí)間推斷中結(jié)合現(xiàn)場(chǎng)走訪調(diào)查資料，能有效減少空蛹?xì)ぴ斐傻臅r(shí)間上的不確定性。另外利用空蛹?xì)ぶ械牡鞍踪|(zhì)、脂質(zhì)、碳?xì)浠衔镞M(jìn)行死亡時(shí)間推斷也不失為一種有效的方法[15-17]，但是在實(shí)際應(yīng)用前還需要開(kāi)展更多的研究。

案例2中的實(shí)際死亡時(shí)間在推斷的時(shí)間范圍內(nèi)，同樣得益于詳實(shí)的現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查。我們發(fā)現(xiàn)利用絲光綠蠅蛹的發(fā)育階段進(jìn)行死亡時(shí)間推斷的范圍較為寬泛，甚至超出了實(shí)際死亡時(shí)間，這無(wú)疑降低了利用絲光綠蠅蛹進(jìn)行死亡時(shí)間推斷的準(zhǔn)確性，原因在于既有資料根據(jù)絲光綠蠅蛹的形態(tài)學(xué)特征劃分了8個(gè)發(fā)育期，其中第Ⅲ期的發(fā)育時(shí)間最長(zhǎng)[11]，因此導(dǎo)致利用蛹形態(tài)學(xué)進(jìn)行推斷時(shí)出現(xiàn)時(shí)間范圍超過(guò)實(shí)際死亡時(shí)間的情況，如果能將蛹的發(fā)育階段根據(jù)形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行再度細(xì)化，劃分出更多的發(fā)育階段[18]，那么將進(jìn)一步提高利用蛹進(jìn)行死亡時(shí)間推斷的準(zhǔn)確性。尸食性蠅類的差異基因表達(dá)或許同樣可以有效地解決這一問(wèn)題[19-20]，但成熟的應(yīng)用還需要長(zhǎng)期的研究。同時(shí)，需要注意的是，絲光綠蠅L. sericata與銅綠蠅Lucilia cuprina（Wiedemann,1830）存在天然的種間雜交，DNA分子技術(shù)有時(shí)無(wú)法完全有效區(qū)分其雜交種[21]，在條件允許的情況下可以進(jìn)行蛹培養(yǎng)，采取成蟲(chóng)形態(tài)學(xué)與DNA分子技術(shù)結(jié)合鑒定的方法，以提高種類鑒定的準(zhǔn)確性。

此次死亡時(shí)間推斷得出的結(jié)果在最長(zhǎng)死亡時(shí)間范圍內(nèi)，具有較高的實(shí)踐價(jià)值，但也存在不足。其一，雖然通過(guò)現(xiàn)場(chǎng)走訪確定了最長(zhǎng)死亡時(shí)間范圍，但是案例中死者的具體死亡時(shí)間仍無(wú)法確定，因而也無(wú)法有效檢驗(yàn)此次死亡時(shí)間推斷的精確性。其二，因?yàn)榫珳?zhǔn)性得不到有效檢驗(yàn)，無(wú)法有效驗(yàn)證低海拔地區(qū)的尸食性蠅類發(fā)育數(shù)據(jù)在高原地區(qū)的實(shí)際應(yīng)用效果。其三，雖然案發(fā)地周邊的氣象站溫度數(shù)據(jù)能為案例提供參考[22-26]，但高原地區(qū)受光照影響，室內(nèi)外溫度存在一定差異，如對(duì)室內(nèi)外溫度差進(jìn)行校正，將會(huì)進(jìn)一步提高死亡時(shí)間推斷的準(zhǔn)確性。總的來(lái)說(shuō)，上述兩個(gè)案例是對(duì)前期研究[5]報(bào)道的拉薩地區(qū)利用三齡幼蟲(chóng)進(jìn)行死亡時(shí)間推斷的延伸，利用蛹和空蛹?xì)?lái)推斷死亡時(shí)間難度更大，進(jìn)一步填補(bǔ)了高原地區(qū)利用尸食性蠅類的蛹和空蛹?xì)みM(jìn)行死亡時(shí)間推斷的空白，同時(shí)也暴露出利用蛹、空蛹?xì)みM(jìn)行死亡時(shí)間推斷的短板以及亟需解決的問(wèn)題，這說(shuō)明還需要長(zhǎng)期進(jìn)行高原地區(qū)的法醫(yī)昆蟲(chóng)學(xué)研究來(lái)支撐實(shí)戰(zhàn)的應(yīng)用。