李 婧，何貴琴，褚瑩瑩，劉艷艷

(1. 安徽省公安廳物證鑒定中心，合肥 230061；2.蚌埠市公安司法鑒定中心，安徽 蚌埠 233000；3.安徽大禹儀器有限公司，合肥 230061)

乙蒜素（Ethylicin）是一種廣譜性殺菌劑，分子式為C4H10O2S2，分子量為154.251，CAS號(hào)為682-91-7。乙蒜素純品為微黃色或無(wú)色油狀液體，沸點(diǎn)為56 ℃，140 ℃易分解，在酸性溶液中穩(wěn)定，但在堿性條件下不穩(wěn)定，可溶于乙醚、氯仿、乙醇和苯等多種有機(jī)溶劑，有較強(qiáng)的腐蝕性，強(qiáng)揮發(fā)性，具有醋酸和大蒜臭味[1]。乙蒜素結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1，為我國(guó)首創(chuàng)農(nóng)藥新品種，價(jià)格低，按照我國(guó)農(nóng)藥毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，屬于中等毒性，國(guó)內(nèi)中毒致死案例少見(jiàn)[2-3]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)乙蒜素常用檢測(cè)方法為氣相色譜/氫火焰離子化檢測(cè)器（GC/FID）[4]，氣相色譜/電子捕獲檢測(cè)器（GC/ECD）[5]和高效液相色譜（HPLC） 法[6]，由于其在140℃時(shí)易分解，所以國(guó)內(nèi)乙蒜素的GC-MS法相關(guān)報(bào)道很少，且質(zhì)譜定性時(shí)均缺少乙蒜素的關(guān)鍵特征離子碎片154[7-8]。本文利用GC-MS法對(duì)乙蒜素進(jìn)行檢測(cè)研究，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)這方面檢驗(yàn)的空白，并對(duì)乙蒜素農(nóng)藥中毒案件中相關(guān)檢材進(jìn)行檢測(cè)，為案件偵查和定性提供技術(shù)支撐。

圖1 乙蒜素結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of ethylicin

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀GC-MS-QP 2010 plus（日本島津公司）。

乙蒜素標(biāo)準(zhǔn)品（98.4%，國(guó)家農(nóng)藥產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心）；二氯甲烷、氯仿、環(huán)己烷（均為分析純，汕頭市西隴化工廠有限公司）；乙醇（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；磷酸氫二鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；檸檬酸（分析純，煙臺(tái)市雙雙化工有限公司）。

1.2 分析條件

儀 器 條 件：RTX-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細(xì)柱；柱溫：初始溫度50 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升至160 ℃，保持3 min；載氣：高純He，流速：1 mL/min，分流比：2∶1；進(jìn)樣口溫度：140 ℃，傳輸線溫度：140 ℃，離子源溫度：200 ℃；電子轟擊離子源：70 eV，掃描方式：SCAN，質(zhì)量采集范圍：m/z45～200 amu，溶劑延遲：3 min。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確移取乙蒜素標(biāo)準(zhǔn)品適量，用乙醇配制成濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液，密封，置于冰箱中冷凍保存?zhèn)溆?，乙蒜素?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作液由儲(chǔ)備液配制得到。

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品前處理

取胃內(nèi)容物2.0 g，勻漿化，加入0.5 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液（pH=3.0），加入二氯甲烷6.0 mL，渦旋振蕩5 min，高速（8 000 r/min）離心10 min，提取有機(jī)相，重復(fù)提取一次，合并兩次提取的有機(jī)相于尖底試管中，氮?dú)獯抵两?，加?.1 mL乙醇定容，供GC-MS分析。

1.4.2 空白胃內(nèi)容物添加樣品前處理

取空白胃內(nèi)容物2.0 g（6份），分別添加一定量乙蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋振蕩混合后，按照1.4.1進(jìn)行操作。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

2.1.1 提取溶液的pH值的選擇

本文考察了pH分別為3.0、5.0和7.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液對(duì)乙蒜素的提取效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，pH為3.0和5.0時(shí)，目標(biāo)物的提取效果基本一樣，但明顯高于pH為7.0條件下的提取效果。這與乙蒜素的化學(xué)性質(zhì)有關(guān)，乙蒜素在酸性溶液中穩(wěn)定，但在堿性條件下不穩(wěn)定。后續(xù)實(shí)驗(yàn)采取的是在磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液（pH=3.0）體系下進(jìn)行提取。

2.1.2 液液提取溶劑的選擇

本文考察了二氯甲烷、三氯甲烷和環(huán)己烷四種溶劑作為提取溶劑的提取效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：二氯甲烷作為提取溶劑得到的乙蒜素的總離子圖中峰面積最大，提取效果是二氯甲烷＞三氯甲烷＞環(huán)己烷，二氯甲烷提取效果最好，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)都采用二氯甲烷作為提取溶劑進(jìn)行前處理。

2.2 GC-MS定性分析方法的優(yōu)化確立

2.2.1 儀器進(jìn)樣口、傳輸線溫度和離子源溫度的優(yōu)化

本文考察了濃度分別為0.005、0.05、0.5、5.0和50.0 μg/mL的乙蒜素標(biāo)準(zhǔn)工作液在不同進(jìn)樣口溫度、傳輸線溫度和離子源溫度條件下進(jìn)樣出峰情況，結(jié)果見(jiàn)表1。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出乙蒜素在表1序號(hào)1條件設(shè)置下，除0.005 μg/mL以外其余濃度乙蒜素均能檢出，能夠滿足實(shí)驗(yàn)的要求。因?yàn)橐宜馑卦?40 ℃易分解，所以儀器各部分溫度對(duì)乙蒜素檢測(cè)影響比較大，所以設(shè)置進(jìn)樣口溫度為140 ℃，傳輸線溫度為140 ℃，離子源溫度為200 ℃。

表1 乙蒜素在不同進(jìn)樣口溫度、傳輸線溫度和離子源溫度條件下進(jìn)樣出峰情況Table 1 Ethylicin determined under different temperatures at inlet, transmission line and ion source

2.2.2 升溫速率的選擇

本文考察了三種升溫速率對(duì)同一濃度下乙蒜素的分析效率和其他雜質(zhì)的分離效果：

1）初始溫度50 ℃，保持1 min，10 ℃/min，升至160 ℃，保持3 min。

2）初始溫度50 ℃，保持1 min，5 ℃/min，升至160 ℃，保持3 min。

3）初始溫度50 ℃，保持1 min，20 ℃/min，升至280 ℃，保持3 min。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在第一種程序升溫下對(duì)乙蒜素進(jìn)行分離定性檢測(cè)，乙蒜素的保留時(shí)間為9.730 min，乙蒜素出峰效果很好，而且和基質(zhì)有很好的分離度。濃度為5 μg/mL的乙蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液GC-MS分析的總離子流圖見(jiàn)圖2a。將5 μg/mL乙蒜素標(biāo)準(zhǔn)工作液根據(jù)優(yōu)化后的條件取樣1 μL進(jìn)行檢驗(yàn)分析，乙蒜素的保留時(shí)間為9.730 min，特征離子碎片為154、95、77、61。所得質(zhì)譜圖如圖2b。

圖2 濃度為5μg/mL的乙蒜素GC-MS分析總離子流圖（a）和質(zhì)譜圖（b）Fig.2 Total ion-current chromatogram and mass spectrogram (EI) from GC-MS (5μg/mL ethylicin)

2.3 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限、回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

在空白胃內(nèi)容物中依次加入適量乙蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液，使得乙蒜素濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0 μg/g，按照1.4.1步驟進(jìn)行操作，進(jìn)樣分析。乙蒜素出峰良好。以乙蒜素的峰面積（y）為縱坐標(biāo)，以乙蒜素標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度（x，μg/g）為橫坐標(biāo)作線性回歸。從表2可知，本方法對(duì)乙蒜素有良好的線性關(guān)系，采用在空白胃內(nèi)容物中添加目標(biāo)化合物的方法，依3倍信噪比確定檢出限。

表2 GC-MS分析乙蒜素的線性方程、R2和檢出限Table 2 The linear equation, correlation coeff icient and LOD

使用在空白胃內(nèi)容中添加乙蒜素的方法測(cè)定加標(biāo)回收率，評(píng)價(jià)方法的可靠性。添加乙蒜素0.5、5.0、20.0 μg/g 3個(gè)濃度，每個(gè)濃度分別取5份樣品進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，按照1.4.1方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 空白胃內(nèi)容物中乙蒜素的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 3 Recoveries and RSDs of ethylicin in the gastric contents (n=5)

3 案例應(yīng)用

筆者于2021年10月受理一件案件，一名女性頭部被其丈夫用石頭砸傷，接著喝乙蒜素農(nóng)藥未被及時(shí)搶救最終死亡。辦案單位送來(lái)了農(nóng)藥瓶、嘔吐物、胃內(nèi)容物和血液等相關(guān)檢材，筆者按照本方法對(duì)檢材進(jìn)行處理后，在農(nóng)藥瓶、胃內(nèi)容物和嘔吐物樣本中均檢出乙蒜素成分，但是在血中未檢出乙蒜素成分。配制乙蒜素系列濃度的空白血添加樣品進(jìn)樣分析，經(jīng)1.4.1步驟操作，按照1.2分析條件檢測(cè)，在所有添加乙蒜素的空白血樣品中均未檢測(cè)出乙蒜素成分。

國(guó)內(nèi)服用乙蒜素自殺的案例雖有報(bào)道，但均是醫(yī)生對(duì)乙蒜素中毒搶救與救治體會(huì)的相關(guān)報(bào)道，乙蒜素在人體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)和理化檢驗(yàn)在國(guó)內(nèi)外均無(wú)相關(guān)報(bào)道，可參考資料有限。經(jīng)查閱大量資料，F(xiàn)reema等[9]對(duì)大蒜素在血液、有機(jī)溶劑和模擬生物體液中的穩(wěn)定性研究一文中，發(fā)現(xiàn)大蒜素加入到血液中極不穩(wěn)定，立即損失83%，5 min后完全消失，這可能是大蒜素和血紅蛋白的二價(jià)鐵快速反應(yīng)引起的。由于乙蒜素與大蒜素結(jié)構(gòu)相似，是大蒜素的乙基同系物，由此推斷乙蒜素可能與血紅蛋白的二價(jià)鐵也會(huì)快速反應(yīng)消失，造成血中檢不出乙蒜素成分。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了胃內(nèi)容物中乙蒜素檢測(cè)的GC-MS方法，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)乙蒜素GC-MS檢測(cè)方法的空白。本方法簡(jiǎn)便快捷，干擾少，且回收率高，重現(xiàn)性好，靈敏度高，可滿足此類涉毒案件定性的需要，給類似案件的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)提供GC-MS方法參考。同時(shí)對(duì)血中乙蒜素以及空白血中添加乙蒜素做了大量實(shí)驗(yàn)研究，為血中乙蒜素的檢驗(yàn)鑒定工作提供經(jīng)驗(yàn)與參考，為刑事案件的定性提供有力支撐。