柳小寧，包奇軍，潘永東，張華瑜，牛小霞，趙 鋒

(甘肅省農(nóng)科院經(jīng)濟作物與啤酒原料研究所，蘭州 730070)

大麥?zhǔn)鞘澜缟纤拇蠛坦阮愖魑镏?，具有生育期短、抗病和耐?耐旱、耐鹽堿、耐貧瘠)等特點，對氣候環(huán)境適應(yīng)性較廣[1]，在啤酒釀造，食用，飼用及工業(yè)方面具有廣泛的用途。近年來，國內(nèi)產(chǎn)業(yè)對區(qū)域性特色大麥優(yōu)質(zhì)資源的需求不斷增加，雖然育種工作者不斷進行資源引進，但受環(huán)境條件的影響，引進結(jié)果難以滿足。隨著產(chǎn)業(yè)發(fā)展，地方功能性大麥種質(zhì)資源急需補充。甘啤系列大麥在廣適性、抗病性、品質(zhì)及產(chǎn)量方面在國內(nèi)處于領(lǐng)先地位，但在滿足特色大麥優(yōu)質(zhì)資源的需求方面依然存在差距，因此增加甘啤系列大麥品種的種質(zhì)資源對發(fā)展當(dāng)?shù)禺a(chǎn)業(yè)(啤酒、養(yǎng)殖、食用等)有重要的意義。甲基磺酸乙酯(EMS)是一種穩(wěn)定、高效的化學(xué)誘變劑，誘變效率高、操作簡便，其誘變后獲得的突變體，具有后代遺傳穩(wěn)定等多重優(yōu)點[2-6]，在作物育種研究中已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。高維錫等[7]研究了EMS誘變劑量和處理時間對沙棗幼苗成活率的影響趨勢；霍雅馨等[8]研究了EMS誘變技術(shù)對箭舌豌豆的影響；許燕等[9]研究了EMS誘變花生珍珠紅1號創(chuàng)制優(yōu)良新種質(zhì)等。目前，前人已經(jīng)在擬南芥[10]、水稻[11-12]等模式作物中構(gòu)建了飽和的突變體庫，并利用突變體材料，克隆了大量的功能基因[13-14]，在利用EMS技術(shù)助力大麥突變體庫的構(gòu)建、種植資源庫及功能基因組學(xué)的研究方面，前人也開展了一定的工作。張曉勤等[15]通過EMS誘變當(dāng)?shù)貎?yōu)良品種，篩選出了理想的后代突變體。秦丹丹等[16]在鄂大麥934的EMS突變體庫中篩選出了大麥黃綠葉色突變體。吳博[17]研究指出，不同作物種子對EMS的敏感程度不同，因此要獲得EMS誘變產(chǎn)生的后代突變體，首先要選出不同作物種子萌發(fā)產(chǎn)生突變的誘變條件。種子萌發(fā)期是植物生活史中從種子到幼苗的關(guān)鍵過渡階段，直接影響植株出苗及生長發(fā)育情況[18]。針對不同作物，EMS誘變對種子萌發(fā)期和苗期的影響報道也有不少，但是有關(guān)EMS誘變甘肅地方大麥品種對萌發(fā)期的影響的報道比較少。

本研究利用不同濃度的EMS和不同誘變時間對當(dāng)?shù)刂髟云【拼篼溒贩N甘啤8號誘變后進行萌發(fā)試驗，初步篩選出種子在不同誘變時間下的半致死濃度，并對誘變后的種子播種，記錄田間苗期性狀，通過對種子萌發(fā)期指標(biāo)及苗期性狀分析，確定誘變甘啤8號大麥種子的半致死條件[19]。比較啤酒大麥種子經(jīng)EMS誘變后，大田苗期的表型性狀，選出EMS對甘啤8號種子誘變可以產(chǎn)生突變體的最佳條件，為甘啤大麥突變體庫的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

啤酒大麥種子甘啤8號，由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物與啤酒原料研究所選育。

誘變試劑EMS，由Sigma公司生產(chǎn)，純度為99.99%，用0.2 mol/L，pH值7.0磷酸緩沖液按體積(質(zhì)量)比進行不同濃度配置。

0.2 mol/L,pH 7.0的緩沖液：

儲備液A：0.2 mol/L Na2HPO4溶液(53.65 g Na2HPO4·7 H2O或71.7 g Na2HPO4·12 H2O配成1 000 mL)。

儲備液B：0.2 mol/L NaH2PO4溶液(27.8 g NaH2PO4·H2O配成1 000 mL)。

以A液61 mL加B液39 mL配置成0.2 mol/L，pH值7.0的緩沖液。

0.1 mol/L Na2S2O3用作EMS誘變失活劑。

1.2 試驗設(shè)置

參照李顏方等[20]的設(shè)計，設(shè)置濃度(0.2%,0.3%,0.4%,0.6%,0.8%,1.0%,1.2%)和時間(8 h,12 h,16 h)兩種處理，共21個組合，以不加EMS誘變劑為ck。選出經(jīng)過誘變以后萌發(fā)指標(biāo)達到理論結(jié)果的誘變濃度及誘變時間組合；田間苗期性狀觀察試驗，用萌發(fā)試驗中優(yōu)選的誘變條件，按照進程對甘啤8號種子提前進行誘變，保證在播種前8 h誘變結(jié)束。在同一水肥均勻的地塊，以人工開溝撒播的方式播種，每一個處理重復(fù)10行，不同處理之間加播2行ck。行長1.5 m，寬0.15 m，行距0.25 m，每行播種100粒，3月15日隨大田試驗一起播種，管理同大田。

1.3 試驗方法

挑取適量干凈、均勻成熟的大麥種子按照不同試驗設(shè)置放入三角瓶，浸種處理，待種子開始萌動時，瀝干水分，進行誘變處理。處理溫度控制在20 ℃。三角瓶置于通風(fēng)櫥的搖床(50 r/min)上進行誘變處理。

沖洗和風(fēng)干：誘變完成后，回收所有誘變組合的EMS廢液，立即用0.1 mol/L Na2S2O3洗滌3次，使EMS失活，將三角瓶中的種子倒入貼有處理標(biāo)記的網(wǎng)袋中，流水沖洗1 h，濾紙吸干多余水分，然后放置于通風(fēng)櫥中風(fēng)干備用。為保證處理效果相同，每批處理的種子數(shù)量、EMS水溶液體積、處理溫度都相同。

萌發(fā)培養(yǎng)：每一個誘變組合均設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)50粒。次日開始記錄每個組合的萌發(fā)時間，每天記錄種子的萌發(fā)數(shù)，以芽長到麥粒長度的一半，或者根長度達到整個麥粒長度時視為萌發(fā)。每天10:00—11:00時統(tǒng)計萌發(fā)種子數(shù)量，種子萌發(fā)到第7天，在每個重復(fù)中隨機抽取10株種苗，小心剪下根和芽，測量根長和芽長，并稱量根和芽的鮮重。

定期觀察各生育期形態(tài)性狀，記錄出苗率。

1.4 萌發(fā)指標(biāo)統(tǒng)計方法

發(fā)芽勢，發(fā)芽率以每天的實際數(shù)值為準(zhǔn)，刻度尺測量芽長、根長，分析天平稱量芽重和根重，結(jié)果為實際測量值。田間出苗情況以實際出苗數(shù)值為準(zhǔn)。

相對發(fā)芽率(%)=(每天萌發(fā)數(shù)量/供試種子萌發(fā)數(shù)量)×100%；

發(fā)芽勢(%)=(第3天萌發(fā)種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%；

發(fā)芽率(%)=(第5天萌發(fā)種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%；

萌發(fā)指數(shù)=∑Gt/Dt，Gt為t時間內(nèi)的萌發(fā)數(shù),Dt為相應(yīng)的萌發(fā)天數(shù)；

芽長=第7天萌發(fā)種子芽長之和(芽基部到芽尖的長度)/萌發(fā)的種子個數(shù)；

根長=第7天萌發(fā)種子根長之和(根基部到根尖的長度)/萌發(fā)的種子個數(shù)；

芽重=第7天萌發(fā)種子的芽重之和/萌發(fā)的種子個數(shù)；

根重=第7天萌發(fā)種子的根長之和/萌發(fā)的種子個數(shù)；

田間出苗率(%)=(出苗總數(shù)/供試種子數(shù))×100%

將觀測記錄的數(shù)據(jù)用Excel軟件進行統(tǒng)計分析，SPSS分析軟件進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 EMS誘變對甘啤8號種子萌發(fā)過程的影響

由圖1、圖2、圖3可以看出，不同時間不同濃度組合誘變后，種子的萌發(fā)趨勢均表現(xiàn)為逐漸增加到一定時間停止萌發(fā)。相同誘變濃度下每天的相對發(fā)芽率因誘變時間不同而有差異。除了8 h誘變條件下，誘變濃度0.3%和0.4%的相對發(fā)芽率基本同步外，其他誘變濃度之間每天的相對發(fā)芽率差異較大。

圖1 8 h誘變處理下不同濃度EMS處理的相對萌發(fā)率Fig.1 The relative germination rate of different concentrations of EMS treatment under 8 hours mutagenesis

圖2 12 h誘變處理下不同濃度EMS處理的相對萌發(fā)率Fig.2 The relative germination rate of different concentrations of EMS treatment under 12 hours mutagenesis

圖3 16 h誘變處理下不同濃度EMS處理的相對萌發(fā)率Fig.3 The relative germination rate of different concentrations of EMS treatment under 16 hours mutagenesis

表1 EMS誘變8 h對萌發(fā)指標(biāo)的影響Table 1 Effects of EMS mutagenesis for 8 hours on germination indicators

從誘變時間對相對發(fā)芽率的影響看，不同濃度間8 h誘變相對發(fā)芽率均比12 h誘變和16 h誘變處理高。0.2%濃度下，8 h、12 h、16 h誘變第5天的相對發(fā)芽率分別是88%、68%、84%。誘變16 h的單日相對發(fā)芽率比誘變12 h的高15%～20%；0.3%濃度下，8 h、12 h、16 h等3個誘變時間第5天的相對發(fā)芽率分別是84%、62%、64%，16 h誘變處理比12 h誘變處理的相對發(fā)芽率高1%～7%；0.4%濃度下，8 h、12 h、16 h等3個誘變時間第5天的相對發(fā)芽率分別是84%、44%、59%。第3天開始，16 h和12 h誘變相比，單日相對發(fā)芽率高13%～17%；0.6%濃度下，8 h誘變第1天開始萌發(fā)，發(fā)芽率達到3%，12 h誘變第2天開始萌發(fā)，發(fā)芽率為1%，16 h誘變第3天開始萌發(fā)，發(fā)芽率為10%。3個誘變時間第5天的相對發(fā)芽率分別是71%、35%、39%；0.8%濃度下，8 h誘變開始萌發(fā)時間在第2天，發(fā)芽率為6%，12 h和16 h誘變均為第4天，發(fā)芽率分別為5%和1%。第5天相對發(fā)芽率分別為55%、14%、1%；誘變濃度1.0%和1.2%時，第5天的相對發(fā)芽率均未達到40%?？梢?，甘啤8號種子的誘變濃度應(yīng)該小于1.0%。

2.2 EMS誘變8 h對甘啤8號種子萌發(fā)指標(biāo)的影響

表1顯示，8 h誘變條件下，發(fā)芽勢隨著濃度的升高逐漸降低，誘變濃度0.2%、0.3%、0.4%和ck之間差異不顯著(p>0.05)，ck、0.4%、0.6%和0.8%之間差異顯著(p<0.05)。誘變濃度為1.2%時，發(fā)芽勢為0；發(fā)芽率隨著濃度的增加逐漸降低。誘變濃度0.2%、0.3%、0.4%之間差異不顯著，其余誘變濃度之間差異顯著(p<0.05)，誘變濃度0.8%時的發(fā)芽率達53%；根長隨著濃度的增加逐漸降低。ck和0.2%之間、0.3%和0.4%之間及0.8%、0.1%、1.2%之間差異不顯著，根長在誘變濃度0.4%、0.6%、0.8%之間差異顯著(p<0.05)；從誘變濃度對芽長的影響看，ck、0.2%、0.3%、0.4%之間差異不顯著，0.4%、0.6%、0.8%之間差異顯著(p<0.05)，相同濃度芽長比根長長1.03～2.78 cm，而且隨濃度的增加，芽長和根長之差呈先后降的趨勢，誘變濃度在0.6%時差值最大，為2.78 cm；誘變濃度對根重的影響不顯著，ck的根重最高；芽重在ck、0.2%、0.3%、0.4%之間差異不顯著，其余各濃度之間差異顯著；隨濃度的升高，萌發(fā)指數(shù)不斷降低，不同濃度處理之間差異顯著，誘變濃度0.6%時，萌發(fā)指數(shù)為54.58%，0.8%時萌發(fā)指數(shù)為26.31%，說明EMS誘變8 h,濃度0.8%即可對甘啤8號種子產(chǎn)生毒性。

2.3 EMS誘變12 h對甘啤8號種子萌發(fā)指標(biāo)的影響

誘變12 h(表2)，隨濃度增加發(fā)芽勢逐漸降低，誘變濃度大于0.8%，發(fā)芽勢為0，ck、0.2%、0.4%、0.6%之間差異顯著(p<0.05)；發(fā)芽率和發(fā)芽勢相比，誘變濃度0.2%時萌發(fā)整齊，誘變濃度達到1.2%時，萌發(fā)受到抑制。從顯著性看，ck、0.2%、0.4%、0.8%、1.0%之間差異顯著(p<0.05)，0.2%和0.3%之間及0.4%和0.6%之間差異不顯著；根長和芽長相比，除了ck，其余各濃度芽長均比根長長，差值在0.54～3.33 cm之間，0.4%誘變濃度下，芽長和根長的差值最大，為3.33 cm；根重只有ck、0.2%、0.3%之間差異顯著，其余各濃度差異不顯著，ck的根重最高；芽重隨濃度增加逐漸降低。芽重在ck和0.2%之間，0.3%和0.4%之間差異不顯著，其余濃度之間差異顯著(p<0.05)。誘變濃度0.2%時，芽重最高，為0.08 g，比ck高0.01 g；隨濃度的升高，萌發(fā)指數(shù)不斷降低，不同的濃度之間差異顯著。誘變濃度0.3%時，萌發(fā)指數(shù)為49.28%，0.4%時萌發(fā)指數(shù)為32.17%，說明EMS誘變12 h,濃度0.3%即可對甘啤8號種子產(chǎn)生毒性。

表2 EMS誘變12 h對萌發(fā)指標(biāo)的影響Table 2 Effects of EMS mutagenesis for 12 hours on germination indicators

表3 EMS誘變16 h對萌發(fā)指標(biāo)的影響Table 3 Effects of EMS mutagenesis for 16 hours on germination indicators

表4 EMS誘變對苗期的影響Table 4 Effects of EMS mutagenesis on the seedling stage

2.4 EMS誘變16 h對甘啤8號種子萌發(fā)指標(biāo)的影響

誘變16 h(表3)條件下，誘變濃度0.2%、0.3%、0.4%的發(fā)芽勢比同濃度下12 h誘變高16.00%、8.00%、17.33%，誘變濃度大于0.8%發(fā)芽勢為零；隨誘變濃度增加，發(fā)芽率逐漸降低，濃度達到1.0%，萌發(fā)受到抑制。0.3%和0.4%之間差異不顯著，其余各濃度差異顯著(p<0.05)，0.2%、0.3%、0.4%、0.6%誘變濃度下，發(fā)芽率比同濃度下誘變12 h高16.00%、3.00%、15.33%、4.00%，誘變濃度大于0.8%時，完全抑制了甘啤8號大麥種子的萌發(fā)。誘變濃度0.4%時，大麥種子的發(fā)芽率可達到57%；根長隨濃度的增加逐漸減低，誘變濃度低于0.8%時差異顯著(p<0.05)；芽長隨濃度變化的趨勢和根長相同，誘變濃度大于1.0%時，EMS完全抑制了甘啤8號種子的生長。從誘變濃度對芽長和根長的影響看，相同的誘變濃度下，芽長大于根長；根重在各誘變濃度下差異不顯著，最高值為ck；隨濃度增加芽重階段式降低，0.8%濃度開始芽重為零。0.2%和0.3%之間、0.4%和0.6%之間差異不顯著，ck、0.3%、0.4%、0.8%之間差異顯著(p<0.05)；萌發(fā)指數(shù)隨誘變濃度的升高不斷降低，不同的濃度之間差異顯著(p<0.05)。誘變濃度0.3%時，萌發(fā)指數(shù)為49.85%，0.4%時萌發(fā)指數(shù)為37.27%，說明EMS 16 h誘變,濃度0.3%即是對甘啤8號種子產(chǎn)生毒性的臨界值。

2.5 EMS誘變對田間出苗率的影響

通過室內(nèi)的EMS誘變甘啤8號種子對萌發(fā)指標(biāo)影響，篩選出0.8%+8 h，0.4%+12 h，0.4%+16 h作為田間誘變播種試驗的組合。從田間的出苗率看(表4)，0.8%+8 h組合出苗率達到38%，0.4%+12 h組合出苗率達到66%，0.4%+16 h組合出苗率達到60%；從田間性狀看(圖4、圖5)，除了0.4%+16 h組合出現(xiàn)葉窄，黃條葉，單穗長，花芒的性狀，其他兩個處理組合與ck相比均沒有出現(xiàn)明顯的不同性狀。

圖4 白條葉Fig.4 Ious leaves

圖5 花芒Fig.5 Ear

3 討 論

3.1 EMS誘變對種子萌發(fā)期的影響

EMS誘變甘啤8號種子的結(jié)果表明，誘變濃度小于0.4%時，8 h、12 h、16 h三個誘變時間段的相對萌發(fā)率能達到40%以上，隨著誘變濃度增大和誘變時間的延長，種子萌發(fā)受到抑制。說明誘變劑濃度越高，對誘變物的抑制作用越大，致使其萌發(fā)率降低，這和杜園園等[21]的研究結(jié)果一致。誘變12 h和16 h相比，誘變濃度小于0.6%，相應(yīng)濃度下發(fā)芽率呈增加趨勢，誘變濃度大于0.6%時，發(fā)芽率呈降低趨勢，可見低濃度的EMS激發(fā)種子的萌發(fā)，高濃度抑制種子的萌發(fā)，這和劉威等[22]、盧銀等[23]的研究結(jié)果一致。

在種子萌發(fā)指標(biāo)評價中，發(fā)芽勢可以較好地反映種子發(fā)芽速度和發(fā)芽整齊度[24]。研究表明，誘變劑低濃度時，誘變時間不同，濃度間發(fā)芽率和發(fā)芽勢差異均不顯著。誘變濃度大于0.4%時，不同誘變時間對甘啤8號種子的萌發(fā)影響顯著。8 h誘變，誘變濃度大于0.4%，種子的發(fā)芽率與其他濃度處理差異顯著，誘變濃度達到0.8%時，發(fā)芽率達到半致死值(53.33%)，各誘變濃度對甘啤8號種子的萌發(fā)均沒有完全被抑制；12 h誘變，0.3%和0.4%兩個誘變濃度下，發(fā)芽率均達到半致死值(42%)，濃度大于1.0%時，發(fā)芽率完全被抑制；16 h誘變，誘變濃度為0.4%時發(fā)芽率達到半致死值(57.33%)；大于0.8%，發(fā)芽完全被抑制。誘變育種研究中通常將萌發(fā)期發(fā)芽率達到半致死的相應(yīng)濃度(半致死濃度)作為最佳誘變條件[25-26]，以本試驗結(jié)果看，EMS誘變甘啤8號發(fā)芽率達到半致死濃度的組合為：8 h+0.8%、12 h+0.4%、16 h+0.4%為最佳的誘變條件。陳麗麗等[27]認為，萌發(fā)指數(shù)是可靠的萌發(fā)評價指標(biāo)，一般情況下，萌發(fā)指數(shù)大于50%可認為誘變劑對種子基本無毒性。EMS誘變對甘啤8號種子萌發(fā)指數(shù)影響結(jié)果表明，三個EMS誘變時間影響下，EMS對甘啤8號種子產(chǎn)生毒性閾值的誘變條件為0.8%誘變8 h；0.3%誘變12 h；0.3%誘變16 h。

不同誘變時間，誘變濃度對根長和芽長的影響顯著(p<0.05)，隨著濃度的增加，根長和芽長顯著降低，誘變濃度大于0.8%，根和芽的生長均受到抑制，隨著誘變濃度增加，抑制作用增強，和藏輝等[28]的研究一致。而根重和芽重相對于ck顯著降低，但是不同的誘變濃度之間根重和芽重的差異不顯著，和崔霞等[5]的研究結(jié)果一致。

3.2 EMS誘變對田間苗期性狀的影響

通過室內(nèi)EMS誘變甘啤8號種子對發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù)的影響，確定了甘啤8號種子的半致死濃度，并在田間進行了播種試驗，通過對大田苗期性狀的觀察分析，誘變8 h+0.8%組合，出苗率達到38%，只表現(xiàn)出有花芒，其他性狀均正常；誘變12 h+0.4%組合，出苗率達到66%，其田間性狀和8 h+0.8%組合相似；誘變16 h+0.4%組合，出苗率達到60%，田間突變性狀明顯，表現(xiàn)出葉變窄，黃條葉明顯，穗變長，花芒。

4 結(jié) 論

分析EMS誘變甘啤8號種子的影響結(jié)果，EMS可抑制甘啤8號種子的生長發(fā)育。誘變時間和誘變濃度均是影響甘啤8號種子的萌發(fā)因素，隨著誘變濃度的增大和誘變時間的延長，甘啤8號種子的發(fā)芽率和萌發(fā)指數(shù)逐漸降低。8 h誘變，試驗設(shè)置的濃度均沒有完全抑制甘啤8號種子的萌發(fā)，其半致死濃度為0.8%；12 h誘變，其半致死濃度為0.4%，設(shè)置濃度達到1.2%時，種子的萌發(fā)完全受到抑制；16 h誘變，其半致死濃度為0.4%，設(shè)置濃度達到0.8%時，甘啤8號種子的萌發(fā)完全受到抑制；根長和芽長逐漸降低，對EMS的響應(yīng)程度為芽長>根長，各誘變濃度間根重和芽重的差異不顯著。

從田間性狀看，16 h誘變，0.4% EMS可作為甘啤8號種子最佳誘變條件。