陳建新，張春來，張海楠，呂晉慧

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山西 晉中 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 晉中 030801)

萬壽菊(TageteserectaL.)為菊科一年生草本植物，具有重要的醫(yī)藥價(jià)值和觀賞價(jià)值，根據(jù)使用功能可分為觀賞萬壽菊和色素萬壽菊。其中，色素萬壽菊花富含葉黃素，可用于制造食品飼料添加劑、化妝品[1-2]，色素萬壽菊也被用于治療心血管、腎臟等疾病[3]。觀賞萬壽菊在提供觀賞的同時(shí)還能富集重金屬[4]。

我國用于生產(chǎn)色素的萬壽菊種植面積超過20 000 hm2，占全世界的85%以上，然而這遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場需求。主要原因是色素萬壽菊單位面積產(chǎn)量低、色素含量低、抗逆性差，因此亟需進(jìn)行色素萬壽菊育種研究。萬壽菊原產(chǎn)墨西哥，我國缺少性狀優(yōu)良的種質(zhì)資源，阻礙了傳統(tǒng)雜交育種的研究進(jìn)展。秋水仙素誘導(dǎo)多倍體育種周期短、效果好，已在農(nóng)作物、花卉、中藥材等多種植物中獲得成功[5,7]。多倍體植株多表現(xiàn)出抗逆性強(qiáng)，代謝物質(zhì)含量高，營養(yǎng)價(jià)值高等特性[8-9]。目前萬壽菊育種主要集中在雜交育種方面，多倍體育種相關(guān)報(bào)道較少。本研究通過秋水仙素誘導(dǎo)染色體加倍，為萬壽菊育種創(chuàng)制和研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

萬壽菊種子為赤峰賽諾園藝有限公司生產(chǎn)的萬壽菊F1(SN 201)。秋水仙素、番紅、固綠等主要試劑均從索萊寶公司購買。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1萬壽菊多倍體誘導(dǎo)

萬壽菊子葉期(苗齡10 d)采用秋水仙素滴液法處理莖尖，秋水仙素濃度為0.25%、0.20%、0.15%、0.10%、0.05%，蒸餾水處理(0%)為對照，共6個(gè)處理，每處理100盆。每天18：00時(shí)處理1次，連續(xù)處理2 d，滴液處理后用透明塑料杯扣苗，防止蒸發(fā)，第3天18:00時(shí)用蒸餾水洗凈。

秋水仙素處理結(jié)束2個(gè)星期后統(tǒng)計(jì)死亡率，完全失去綠色的植株記為死亡株。秋水仙素處理結(jié)束2個(gè)月后統(tǒng)計(jì)變異植株，單株80%以上的葉片有葉色變化、葉片增厚、葉片彎曲、葉片增大、葉緣變化現(xiàn)象則判定為形態(tài)變異株，統(tǒng)計(jì)形態(tài)變異率[10]。

死亡率(%)=(死亡植株數(shù)/處理植株數(shù))×100%；

形態(tài)變異率(%)=(形態(tài)變異植株數(shù)/處理植株數(shù))×100%。

1.2.2多倍體鑒定

取疑似多倍體植株中上部葉片，用濕濾紙包裹，放入自封袋，存于冰盒寄送北京金迪未來生物科技有限公司進(jìn)行流式細(xì)胞儀(德國Partec公司，Partec CyFlow Space)檢測。參照李懋學(xué)和張方[11]的壓片法對流式細(xì)胞儀鑒定的多倍體植株進(jìn)行染色體鑒定。

1.2.3多倍體植株特性

用卷尺測量冠幅、株高，游標(biāo)卡尺(得力集團(tuán)有限公司，DL 91150)測量地徑，葉面積測量儀(山東方科儀器有限公司，YMJ-G)測量葉面積、葉長、葉寬。

撕膠帶法制片[12]，在Olympus CX 31-32 C 02光學(xué)顯微鏡下統(tǒng)計(jì)單個(gè)視野內(nèi)氣孔數(shù)量，保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)目，每個(gè)類型隨機(jī)觀察30個(gè)視野，計(jì)算平均值。使用明美顯微數(shù)碼測量分析系統(tǒng)(廣州市明美光電技術(shù)有限公司，V 1.5.2)拍照，測量保衛(wèi)細(xì)胞長度和寬度，采用石蠟切片法觀察葉片橫截面變化[13]。

緊實(shí)度=柵欄組織厚度/葉片厚度；

疏松度=海綿組織厚度/葉片厚度。

參考符芳寧[14]的方法測定比葉鮮重、比葉干重、葉片含水率(LWC)。光合色素采用丙酮法測定[15]，可溶性糖(SS)采用蒽酮比色法，可溶性蛋白(SPC)測定采用考馬斯亮藍(lán)-G 250法，丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸法[16]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行方差分析，采用Duncan法進(jìn)行多重比較，極顯著水平為0.01，標(biāo)注大寫字母，顯著水平為0.05，標(biāo)注小寫字母，用Microsoft Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理計(jì)算，Sigma Plot軟件繪圖，所得結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 萬壽菊多倍體誘導(dǎo)

2.1.1秋水仙素對萬壽菊生長的影響

隨秋水仙素濃度增加萬壽菊株高和冠幅呈降低趨勢。秋水仙素處理下株高和冠幅極顯著小于對照(p<0.01)，0.05%與0.10%處理下萬壽菊株高與冠幅極顯著高于0.25%、0.20%、0.15%處理，0.05%與0.10%處理之間株高、冠幅無顯著差異，0.25%、0.20%和0.15%處理之間株高、冠幅無顯著差異(圖1)。秋水仙素抑制萬壽菊生長，對照的生長速度大于秋水仙素處理下的生長速度(圖1)。對照植株每周的株高增長量大于3.72 cm，秋水仙素處理下植株每周的株高生長量小于0.49 cm；28 d內(nèi)對照植株的株高生長量為24.91 cm，秋水仙素處理下株高總生長量小于0.91 cm。

2.1.2秋水仙素對萬壽菊的誘導(dǎo)效果

隨秋水仙素濃度增加，死亡率呈升高趨勢(表1)。秋水仙素處理下萬壽菊死亡率顯著高于對照，其中0.25%處理死亡率最高，為56.00%，0.10%處理死亡率最低，為18.50%。各處理間死亡率差異顯著。

圖1 秋水仙素對萬壽菊生長的影響Fig.1 Effect of colchicine on the growth of Tagetes erecta L.

表1 秋水仙素對萬壽菊的誘導(dǎo)效果Table 1 Induction effect of colchicine on Tagetes erecta L.

秋水仙素處理下萬壽菊形態(tài)變異率顯著增加，其中0.10%處理下形態(tài)變異率最高，顯著高于其他處理，0.25%處理下形態(tài)變異率顯著低于其他秋水仙素處理。

2.1.3秋水仙素對葉片形態(tài)的影響

秋水仙素對萬壽菊葉片變異有明顯影響，其中0.05%處理下有葉片增大、葉片增厚、葉色變深、鋸齒變細(xì)、裂片寬度增加5種變異類型，其他秋水仙素處理下變異類型均為4種，0.10%處理下葉片變異類型為葉片增大、葉片增厚、葉色變深和葉面皺縮，0.15%、0.20%和0.25%處理下葉片變異類型為葉片增大、葉片增厚、葉色變深和鋸齒變化(圖2)。

各秋水仙素處理下均是葉片增大變異率最高，且隨秋水仙素濃度增加葉片增大變異率呈先增加后降低趨勢，葉片增大變異率依次為0.10%>0.15%>0.05%>0.20%>0.25%，0.10%處理下變異率為68.29%，0.25%處理下變異率為18.42%。葉片增厚在0.05%處理下變異率最高，為14.81%，其次是0.25%處理，為13.04%，其余處理下變異率不足10%。鋸齒變異類型在0.15%處理下變異率最高，為13.33%，0.10%處理下沒有明顯變異，其余處理下變異率不足10%。裂片寬度增加變異類型僅出現(xiàn)在0.05%處理，葉面皺縮變異類型僅出現(xiàn)在0.10%處理(表2)。

表2 秋水仙素對葉片形態(tài)的影響Table 2 Effects of colchicine on leaf morphology

2.2 萬壽菊倍性鑒定

2.2.1流式細(xì)胞儀鑒定

在盛花期對疑似多倍體進(jìn)行流式細(xì)胞儀鑒定，從葉片細(xì)胞DNA含量分布圖可以(圖3)看出，對照的熒光強(qiáng)度在200處出現(xiàn)1個(gè)峰值，而其他處理在400處出現(xiàn)1個(gè)熒光強(qiáng)度峰值的植株確定為四倍體，在200、400處出現(xiàn)2個(gè)熒光強(qiáng)度峰值的變異植株為嵌合體。對萬壽菊基因組大小進(jìn)行檢測，二倍體和四倍體基因組大小分別為823.57 M、1 576.73 M，四倍體基因組大小是二倍體的1.92倍。

2.2.2染色體鑒定

對流式細(xì)胞儀鑒定出的四倍體植株進(jìn)行染色體鑒定，二倍體根尖細(xì)胞內(nèi)染色體數(shù)目2 n=2 x=24，四倍體植株細(xì)胞體積增大，染色體數(shù)目2 n=4 x=48(圖4)。

注：1為對照；2為鋸齒變異；3為葉片增大葉色變深；4為葉片增厚；5為裂片寬度增加；6為葉面皺縮。圖2 變異植株葉片特征Fig.2 Leaf characteristics of variation plants

注：1為對照；2為四倍體；3為嵌合體圖3 流式細(xì)胞儀檢測DNA含量分析Fig.3 Analysis of DNA content detected by flow cytometry

2.3 多倍體特性分析

2.3.1形態(tài)特征

萬壽菊四倍體與二倍體在形態(tài)特征上有顯著差異(p<0.05)。四倍體株高、冠幅、節(jié)間分別比二倍體低21.45%、41.12%、19.60%。萬壽菊葉片和花有一定的觀賞價(jià)值，四倍體葉面積、葉片長度、葉片寬度分別是二倍體的1.90倍、1.56倍、1.43倍，腺點(diǎn)密度比二倍體降低48.42%。四倍體的舌狀花瓣長度與寬度分別增加20.61%、9.42%，花梗長度縮短45.81%，提高了花的觀賞性(圖5)。四倍體的地徑和葉型指數(shù)與對照無顯著差異(表3)。

2.3.2細(xì)胞學(xué)特性

萬壽菊四倍體與二倍體在氣孔密度、保衛(wèi)細(xì)胞長度、保衛(wèi)細(xì)胞寬度、保衛(wèi)細(xì)胞長寬比、保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)量方面有顯著差異(p<0.05)。四倍體植株氣孔密度降低57.53%，保衛(wèi)細(xì)胞長度、保衛(wèi)細(xì)胞寬度、保衛(wèi)細(xì)胞長寬比、保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)量分別是對照的2.06倍、1.80倍、1.12倍、1.42倍(表4，圖6)。

2.3.3葉片解剖結(jié)構(gòu)分析

萬壽菊葉片為典型的異面葉，近軸面為柵欄組織，遠(yuǎn)軸面為海綿組織，葉片結(jié)構(gòu)由外向內(nèi)包括表皮、葉肉、葉脈(圖7)。萬壽菊四倍體與二倍體在葉片厚度及各結(jié)構(gòu)組織厚度上有極顯著差異(p<0.01)。四倍體萬壽菊葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、上下表皮細(xì)胞厚度分別是二倍體的1.72倍、1.68倍、1.92倍、1.63倍、1.60倍，說明葉片厚度增加主要是由柵欄組織、海綿組織、上下表皮細(xì)胞等部位厚度增加引起。四倍體萬壽菊的柵海比顯著降低12.71%，疏松度極顯著提高10.81%。四倍體萬壽菊的緊實(shí)度與對照差異不顯著(表5)。

注：1為二倍體(2 n=2 x=24)；2為四倍體(2 n=4 x=48)。圖4 萬壽菊染色體數(shù)目Fig.4 Numbers of Tagete erecta L. chromosomes

注：1為四倍體；2為二倍體。圖5 萬壽菊花Fig.5 Flower of Tagetes erecta L.

注：1為二倍體；2為四倍體。放大倍數(shù)為20×40倍。圖6 萬壽菊葉片氣孔Fig.6 Stomata on Tagetes erecta L. leaves

注：1為四倍體；2為二倍體。放大倍數(shù)為20×10倍。圖7 萬壽菊葉片橫切Fig.7 Tagetes erecta L. leaves cross cut

表3 四倍體葉片與花的形態(tài)特征Table 3 Morphological characteristics of tetraploid leaves and flowers

表4 四倍體葉片氣孔觀察Table 4 Stomata observation of tetraploid leaves and flowers

表5 四倍體葉片解剖結(jié)構(gòu)Table 5 Anatomical structure of tetraploid leaves

2.3.4四倍體生理生化測定

萬壽菊四倍體與二倍體在葉片鮮重和干重方面差異極顯著(p<0.01)。四倍體萬壽菊葉片鮮重增加36.18%，干重增加21.95%，葉片含水率與二倍體無顯著差異(表6)。

表6 四倍體葉片含水率Table 6 Water content in tetraploid leaves

萬壽菊染色體加倍后葉片中的葉綠素含量和類胡蘿卜素含量極顯著降低(p<0.01)。四倍體萬壽菊葉片中葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素總含量和類胡蘿卜素含量分別比二倍體降低46.51%、42.00%、45.28%、51.92%。葉綠素a/b值大于3，屬于典型的陽性植物，萬壽菊二倍體與四倍體的葉綠素a/b值分別為4.28、3.92，四倍體葉綠素a/b值極顯著降低(表7)。

四倍體萬壽菊的可溶性糖、丙二醛及可溶性蛋白含量與對照相比無顯著變化(p>0.05)(表7)。

表7 四倍體葉片中物質(zhì)含量Table 7 Substance content in tetraploid leaves

3 討論與結(jié)論

多倍體誘變是基因組突變，可產(chǎn)生更大變異表型[17]。張靜靜[18]用秋水仙素誘導(dǎo)鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)時(shí)，除葉片增厚、葉色加深外，還出現(xiàn)了植株矮化、叢生，葉片變脆、易折斷等變異類型。萬壽菊用秋水仙素處理后出現(xiàn)葉片增大、葉片增厚、花增大，同時(shí)還有葉色變異、鋸齒變異、株高降低等表型，經(jīng)鑒定，多倍體誘導(dǎo)后并不是所有性狀均呈增大趨勢。

秋水仙素的誘導(dǎo)效果與處理濃度、作用時(shí)間、環(huán)境溫度和植物材料等因素有很大關(guān)系[19]。童俊[20]用0.50%～0.80%的秋水仙素處理紫薇48 h，形態(tài)變異率較高，周玉麗[21]用0.20%秋水仙素處理連翹72 h形態(tài)變異率較高，本試驗(yàn)用0.10%～0.15%的秋水仙素處理萬壽菊48 h形態(tài)變異率較高，不同植物間秋水仙素的使用濃度和時(shí)間差異較大，可能是不同植物的抗性不同，也可能是環(huán)境影響較大。

萬壽菊在0.25%秋水仙素處理下形態(tài)變異率低于50%，死亡率高于50%，死亡率較高形態(tài)變異率較低；0.05%處理下植株死亡率低于30%，形態(tài)變異率大于60%，死亡率較低，沒有出現(xiàn)加倍植株。如何平衡濃度與變異率之間的關(guān)系是誘導(dǎo)的關(guān)鍵，0.10%與0.15%兩個(gè)處理下形態(tài)變異率較高，為秋水仙素誘導(dǎo)萬壽菊的最佳使用濃度。

秋水仙素處理后萬壽菊生長發(fā)育受到不同程度抑制，一部分幼苗雖然成活但是停止生長，一部分幼苗死亡，可能是有絲分裂異常，打破了幼苗體內(nèi)生理代謝平衡。秋水仙素處理下萬壽菊生長過程中出現(xiàn)萎蔫情況，與高靜[22]的研究結(jié)果類似，這可能是秋水仙素對植物存在毒害作用。

萬壽菊染色體加倍后株高和冠幅降低，地徑增粗，在一定程度上增強(qiáng)了植株抗性。萬壽菊花瓣的長度與寬度增加，提高了觀賞價(jià)值；腺點(diǎn)密度降低，在一定程度上減少異味散發(fā)，從而提高園林使用價(jià)值，減少工作人員操作的不適性。

不同植物多倍體的性狀變化趨勢存在差異，四倍體萬壽菊株高降低、葉片增大增厚；四倍體云錦杜鵑(RhododendronfortuneiLindl.)葉片減小、變圓[23]，四倍體穗花牡荊(Vitexagnus-castusLinn.)株高增加、葉片增大[24]。Van Laere K等[25]認(rèn)為，不同品種間多倍體的性狀變化趨勢也不一致，彎穗苞葉芋(SpathiphyllumwallisiiRegel.)誘變植株中，四倍體MS 8花柄縮短，6 341和6 526這2個(gè)品種花柄長度增加。

多倍體植株一般代謝旺盛，細(xì)胞內(nèi)代謝物質(zhì)含量高，萬壽菊四倍體與二倍體在丙二醛、可溶性糖和可溶性蛋白含量方面差異不顯著，可能是萬壽菊沒有處在脅迫條件下，相關(guān)基因未表達(dá)。四倍體萬壽菊的葉片比葉干重與比葉鮮重顯著增加，但是葉片含水率沒有增加，說明萬壽菊加倍后某些物質(zhì)可能發(fā)生變化。

葉片特征變化反映植物適應(yīng)能力強(qiáng)弱。多倍體植株葉片增大，受光面積增加；柵欄組織厚度增加，有利于葉綠體排列方向改變；海綿組織厚度增加，可減少光量子的透射損失，同時(shí)促進(jìn)葉片內(nèi)部氣體交換速率，提高葉片光能利用率[26]。四倍體萬壽菊柵海比顯著降低，對高溫的抗逆性增強(qiáng)；葉片上表皮細(xì)胞增厚，對葉綠體光合結(jié)構(gòu)保護(hù)性增強(qiáng)[27]，此外四倍體萬壽菊葉片中葉綠素a/b值降低，耐陰性增加，可與其他高大植物間作，減緩萬壽菊連作障礙。