劉利華 張楠楠 戈寧寧 董海新

作者單位：272007 山東濟寧，濟寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科（劉利華、戈寧寧、董海新），呼吸與重癥醫(yī)學(xué)科（張楠楠）

近年來，我國布氏桿菌?。ú疾。┑陌l(fā)病率不斷上升，疫情形勢嚴(yán)峻［1-2］。布氏桿菌感染患者的臨床表現(xiàn)多樣，該菌可經(jīng)消化道、呼吸道、生殖器官以及皮膚損傷等多種途徑感染［1］。其中羊是主要傳染源，其次是牛和豬［3］。布病患者大多有病畜接觸史，可由飲食被污染的奶制品或未熟的牛、羊肉引起［4］。由于布氏桿菌培養(yǎng)的遲緩期較長，生長期較短，且布氏桿菌病的臨床表現(xiàn)多樣，由于臨床醫(yī)師對該病的認(rèn)識不足而容易造成誤診及漏診，導(dǎo)致臨床治療效果較差［5］，因此探索快速有效鑒定布氏桿菌的方法是重要的研究任務(wù)。有文獻(xiàn)報道，檢測布氏桿菌使用骨髓標(biāo)本優(yōu)于血標(biāo)本，但臨床抽取患者骨髓時細(xì)胞量過少，且給患者帶來痛苦，因此骨髓培養(yǎng)不宜作為篩查布氏桿菌的常規(guī)方法，臨床通常使用血液標(biāo)本篩查。本研究主要探討血培養(yǎng)布氏桿菌陽性患者的臨床診斷及感染特征，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 研究對象 收集本院2019 年1—12 月送檢的13 455 份血培養(yǎng)和骨髓培養(yǎng)標(biāo)本，患者平均年齡為（44.21±12.24）歲，分布科室為呼吸內(nèi)科、血液科、感染性疾病科、重癥醫(yī)學(xué)科、急診科、風(fēng)濕免疫科等。

1.2 儀器與試劑 Bact/Alert3 D全自動培養(yǎng)儀、全自動微生物鑒定儀及原裝配套血培養(yǎng)瓶均購自法國生物梅里埃公司。質(zhì)量控制（質(zhì)控）菌株為大腸埃希菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923。

1.3 樣本采集 疑似患者可只采集需氧瓶2 套，成人每瓶采集靜脈血8～10 mL 注入中和抗菌藥物的需氧瓶，經(jīng)儀器掃描識別后，直接放入培養(yǎng)儀自動檢測。

1.4 疑似布病患者血培養(yǎng)處理流程

1.4.1 陽性培養(yǎng)瓶的處理 將全自動血培養(yǎng)系統(tǒng)陽性報警的培養(yǎng)瓶采用平板劃線法轉(zhuǎn)種于血平板，置于35 ℃、5%～10% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～48 h 后觀察，對疑似布氏桿菌生長的菌落直接進(jìn)行涂片革蘭染色鏡檢，鏡下可見革蘭陰性（Gram negative，G-）短小球桿菌呈沙灘細(xì)沙樣排列。布氏桿菌為苛養(yǎng)菌，對所需營養(yǎng)要求高，轉(zhuǎn)接種血平板培養(yǎng)24 h 后肉眼可見劃線第一區(qū)有小片濕潤的薄菌苔?？焖倌蛎冈囼? min 內(nèi)可見尿素水解試驗結(jié)果為陽性，氧化酶試驗陽性，這時應(yīng)高度懷疑為是布氏桿菌，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，菌落呈微小針尖狀，96 h 后可見透明、濕潤、細(xì)小、無色、不溶于血的菌落生長。挑取單個菌落涂片染色，鏡檢為G-短小球狀菌，同時經(jīng)全自動微生物鑒定儀鑒定為馬耳他布魯菌，發(fā)出陽性報告同時上報疫情。但如果對儀器顯示陽性的培養(yǎng)瓶進(jìn)行涂片和革蘭染色鏡檢未見病原菌，需要觀察細(xì)菌生長曲線特點，如果遲緩期較長，生長期較短，生長期對應(yīng)的縱軸較短，穩(wěn)定期平緩，則高度懷疑布氏桿菌，繼續(xù)培養(yǎng)，隔日觀察，延長至1 個月未見生長的則判斷為陰性，發(fā)出陰性報告。

1.4.2 陰性培養(yǎng)瓶的處理 培養(yǎng)瓶經(jīng)儀器培養(yǎng)檢測5 d 顯示陰性者，進(jìn)行盲目轉(zhuǎn)種培養(yǎng)，轉(zhuǎn)種方法同陽性培養(yǎng)瓶。如果培養(yǎng)結(jié)果為無菌生長，同時涂片、革蘭染色鏡檢未找到病菌，繼續(xù)普通培養(yǎng)5 d，發(fā)出無細(xì)菌生長報告。但如果盲種和涂片均發(fā)現(xiàn)病原菌生長，則立即查看血培養(yǎng)細(xì)菌生長曲線，如果曲線遲緩期較長，生長期較短，生長期對應(yīng)的縱軸較短，穩(wěn)定期平緩，則推定為布氏桿菌，進(jìn)一步鑒定后發(fā)出陽性報告，同時上報疫情。

1.4.3 生化鑒定 血培養(yǎng)儀需氧瓶陽性報警，觀察細(xì)菌生長曲線特點為遲緩期較長，生長期較短，生長期對應(yīng)的縱軸較短，穩(wěn)定期平緩。尿素水解試驗5 min 內(nèi)出現(xiàn)陽性，可推定為布氏桿菌；氧化酶、觸酶、硝酸鹽試驗均為陽性，硫化氫、精氨酸和吲哚反應(yīng)試驗為陰性，涂片可見G-球桿菌、染色很弱。這是可初步報告臨床高度懷疑是布氏桿菌，并結(jié)合臨床體征及病史采取生物預(yù)防措施。同時上報當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制中心（Centers for Disease Control，CDC）實施最終確定試驗。

1.5 倫理學(xué) 本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)（審批號：2022C219），所有檢測均獲得過患者或家屬知情同意。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗；計算單項試驗和聯(lián)合檢測診斷真菌感染的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床主要表現(xiàn) 抽取85 例可疑布氏桿菌感染患者，臨床表現(xiàn)主要為發(fā)熱、多汗、頭痛、乏力以及關(guān)節(jié)疼痛等。見表1。

表1 85 例疑似布氏桿菌感染患者的臨床主要表現(xiàn)

2.2 不同培養(yǎng)方法標(biāo)本陽性報警時間比較 統(tǒng)計13 238 份血培養(yǎng)標(biāo)本和217 份骨髓培養(yǎng)標(biāo)本的陽性率及陽性例數(shù)報警時間，結(jié)果表明，全自動血培養(yǎng)儀檢出68 例血培養(yǎng)陽性標(biāo)本報警時間明顯長于骨髓培養(yǎng)標(biāo)本的陽性報警時間，骨髓培養(yǎng)檢測布氏桿菌的陽性率明顯高于血培養(yǎng)。見表2。

表2 不同培養(yǎng)方法標(biāo)本陽性率及陽性報警時間比較

2.3 不同培養(yǎng)方法陽性標(biāo)本分布 本研究中69 例馬耳他布氏桿菌感染菌患者由血培養(yǎng)檢出68 例，臨床確診病例68 例，骨髓培養(yǎng)檢出16 例，臨床確診16 例。1 例患者血培養(yǎng)和骨髓培養(yǎng)培養(yǎng)均為陰性，但根據(jù)發(fā)熱、關(guān)節(jié)疼痛、有牧場接觸史等臨床特征，同時結(jié)合其他輔助檢查，按照布病診療方案治療成功。本研究檢出布氏桿菌經(jīng)當(dāng)?shù)谻DC 血清學(xué)分型鑒定，均為羊布氏桿菌。見表3。

表3 血培養(yǎng)和骨髓培養(yǎng)標(biāo)本布氏桿菌陽性分布

2.4 感染科室分布 布氏桿菌檢出最多的科室為呼吸科、血液科、風(fēng)濕免疫科。見圖1。對相關(guān)科室的血培養(yǎng)結(jié)果要高度重視，對疑似布氏桿菌生長曲線的標(biāo)本要及時傳種，延長培養(yǎng)時間。本院低發(fā)科室兒科只檢出1 例布病患者。

圖1 85 例布氏桿菌感染患者的科室分布

3 討論

布病是由布氏桿菌引起的人畜共患急慢性傳染病，屬自然疫源性疾病之一，在我國主要流行于西北、東北、青藏高原地區(qū)及內(nèi)蒙古自治區(qū)［6］。布氏桿菌侵入人體后被吞噬細(xì)胞吞噬，但由于布氏桿菌具有莢膜，能有效抵抗吞噬細(xì)胞的吞噬作用，并在該細(xì)胞內(nèi)增殖，隨后進(jìn)入血液循環(huán)，導(dǎo)致患者反復(fù)出現(xiàn)菌血癥［7］。之后布氏桿菌再隨血流進(jìn)入患者脾臟、肝臟、骨髓細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)血液、淋巴管到達(dá)局部淋巴結(jié)，之后寄生其中。細(xì)菌在寄生細(xì)胞中繁殖到一定時期，又再次進(jìn)入血流，造成患者反復(fù)出現(xiàn)發(fā)熱、乏力等癥狀，因此該疾病也被稱為波浪熱［8-9］。反復(fù)發(fā)熱是布病的主要臨床特點，本研究抽取的85 例疑似布氏桿菌感染患者臨床表現(xiàn)多為長期反復(fù)發(fā)熱、多汗、乏力、關(guān)節(jié)疼痛、肝脾及淋巴結(jié)腫大，部分患者伴有肝脾變大、白細(xì)胞和血小板計數(shù)降低。

布氏桿菌為專性需氧菌，對營養(yǎng)和培養(yǎng)條件要求較高，因此在血培養(yǎng)平板上生長和代謝緩慢。如果技術(shù)人員經(jīng)驗不足，可能會出現(xiàn)將還未生長出的布氏桿菌視為陰性丟棄的情況，造成假陰性或假陽性結(jié)果。上述存在人為因素的情況在臨床中應(yīng)盡量避免，在最大程度上降低假陰性和假陽性結(jié)果的發(fā)生率。本研究中未出現(xiàn)假陽性病例，但由于方法學(xué)存在局限性，臨床工作中應(yīng)高度重視可造成假陽性結(jié)果的因素，如血培養(yǎng)瓶存放環(huán)境溫度超過28 ℃，血培養(yǎng)儀外界溫度過高，血培養(yǎng)儀電壓不穩(wěn)，厭氧菌存在等。血液病患者血細(xì)胞數(shù)量異常，血細(xì)胞本身的新陳代謝也會產(chǎn)生大量的CO2，如果采血量過多，或部分炎癥疾病患者體內(nèi)白細(xì)胞計數(shù)水平升高，都可能導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

由于布氏桿菌的生長緩慢，會造成出現(xiàn)假陰性結(jié)果的概率較高，本研究檢出1 例假陰性樣本，但根據(jù)患者發(fā)熱、關(guān)節(jié)疼痛、有牧場接觸史等臨床特征，同時結(jié)合其他輔助檢查，按照布病診療方案治療成功。造成假陰性結(jié)果的原因有以下幾點：① 血培養(yǎng)瓶存放于冰箱中，取出后立刻進(jìn)行培養(yǎng)，溫度過低，抑制布氏桿菌的生長；② 標(biāo)本采集量偏少，產(chǎn)生CO2的量不足以激發(fā)熒光系統(tǒng)，從而導(dǎo)致假陰性結(jié)果；③ 標(biāo)本采集時機不合適，未抓住菌血癥時期； ④ 血液標(biāo)本采集后，放于機外時間過長，布氏桿菌生長已達(dá)到衰老期； ⑤ 患者在使用抗菌藥物后不久。

布病患者臨床癥狀往往不典型，容易造成漏診或誤診［10］，特別是在疾病的急性期，易與傷寒、副傷寒、風(fēng)濕病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、流行性感冒以及其他病毒性呼吸道感染混淆。因此在患者長期發(fā)熱且對癥治療效果不佳的情況下，除常見外科疾病外，需考慮到細(xì)菌感染，如有牛羊接觸史的患者，注意罕見的人畜共患傳染病。另外，臨床治療效果不佳時，往往是由于布氏桿菌在網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)繁殖，單純使用一種藥物治療，藥效難以到達(dá)，因此療效不佳，且易復(fù)發(fā)［11］。布病亦是可防可治的，若治療及時，預(yù)后良好，大多可于3～6 個月內(nèi)康復(fù)，僅10%～13%的病例病程超過6 個月。未經(jīng)抗菌藥物治療的病死率為2%～3%［12］。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）推薦的首選治療方法為多西環(huán)素和利福平聯(lián)合用藥，6 周為1 個療程［11，13］，足量療程用藥，預(yù)后良好［14］。

另外，本研究統(tǒng)計結(jié)果顯示，骨髓標(biāo)本檢測布氏桿菌的陽性率明顯高于血標(biāo)本，骨髓培養(yǎng)陽性報警時間早于血培養(yǎng)，但臨床抽取患者的骨髓細(xì)胞量過少而且給患者帶來痛苦，因此骨髓培養(yǎng)不宜作為常規(guī)檢測方法篩查布氏桿菌，臨床通常使用血標(biāo)本篩查布氏桿菌，不能納入常規(guī)送檢，故采用血培養(yǎng)聯(lián)合生長曲線特點有助于快速推定布氏桿菌感染，布氏桿菌陽性標(biāo)本細(xì)菌生長遲緩期較長，生長期較短，生長期對應(yīng)的縱軸較短，穩(wěn)定期平緩，因此血培養(yǎng)聯(lián)合生長曲線對診斷布病有重要的臨床價值。

綜上所述，布病的診斷應(yīng)結(jié)合流行病學(xué)資料、臨床表現(xiàn)和特異性實驗室檢查確診［5，15］。臨床醫(yī)師和實驗室檢驗人員要加強血培養(yǎng)對布氏桿菌檢驗的重要性，做到及時診斷和治療。布氏桿菌的初步快速鑒定不僅對臨床診斷的價值大，而且對公眾健康和實驗室安全也有重大意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突