陳選民 周偉偉 譚芳芳 賓玉玲 胡光勝

作者單位：421001 湖南衡陽，南華大學附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科

胃癌是高度惡性的消化系統(tǒng)腫瘤，根據(jù)2018 年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，胃癌的病死率已位居惡性腫瘤第二位，全球每年因胃癌死亡的人數(shù)超過78 萬名［1］。我國是胃癌高發(fā)國家，盡管診療技術不斷進步，分子靶向藥物也被不斷開發(fā)及應用，但胃癌患者的5 年生存率仍然很低［2］。因此，揭示胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋找新的潛在治療靶點，對提高胃癌患者的生存率具有十分重要的臨床意義。

生物信息學在醫(yī)學研究中科學高效，該方法采用大數(shù)據(jù)高速算法，減少小樣本帶來的誤差，使結果更加科學合理，也為腫瘤的研究提供了新的方向。本研究前期對基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）中胃癌mRNA高通量數(shù)據(jù)GSE54129、GSE79973 及GSE56807 進行生物信息學分析（包括126 例胃癌組織及36 例癌旁組織），共篩查出118 個差異表達mRNA，進一步通過基因聚類分析（gene ontology，GO）、基因信號通路分析（Kyto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway，KEGG pathway）及蛋白間相關性分析（protein and protein interaction，PPI），篩選處可能調(diào)控胃癌發(fā)生發(fā)展的葡糖醛酸轉移酶2家族B15（glucuronsyltransferase family 2 member B15，UGT2B15）［3］。

UGT2B15 是UGT2 家族成員，主要在肝臟或肝外組織中表達，在雄激素葡萄苷酸化中具有重要作用［4］。有研究表明，UGT2B15 的基因多態(tài)性導致個體對藥物或激素代謝存在差異［5］。前列腺癌中UGT2B15 高表達可導致去勢術后患者化療耐藥［6］；乳腺癌中UGT2B15 表達增高能減弱莫西芬的化療效果，導致乳腺癌患者獲得性耐藥［4］。但UGT2B15在胃癌中的研究報道比較少見，本研究前期分析人類癌癥基因組圖譜計劃（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫，結果表明UGT2B15 在胃癌患者體內(nèi)高表達，且其表達與胃癌患者的臨床分期及預后密切相關。本研究旨在分析UGT2B15 在胃癌組織中的表達及其對胃癌細胞的作用，從而為胃癌的分子治療尋求新的分子標記物，現(xiàn)將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 資料收集 收集2015 年1 月—2019 年12 月在本院就診并行胃癌根治術的胃癌患者的226 份臨床標本（包括腫瘤組織和癌旁組織標本），其中136 份制成石蠟切片，另外90 份制作冰凍組織提取RNA。所有手術標本均在離體30 min 內(nèi)收集，且術后經(jīng)病理科確診為胃癌。本研究符合醫(yī)學倫理學標準，并經(jīng)本院倫理審查（審批號：2018110102008），所有患者均知情同意。

1.2 儀器與試劑 熒光倒置相差顯微鏡購自中國北京博瑞斯科技有限公司，免疫組化試劑盒購自武漢谷歌生物科技有限公司，UGT2B15（ab89274）和FOXA1（ab170933）以及β-actin（ab179467）單克隆抗體均購自美國abcom 公司；實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescent quantitative PCR，qRTPCR）試劑盒、反轉錄試劑盒及CCK-8 試劑盒均購自上海翊圣生物科技有限公司；TRizol 試劑購自美國賽默飛世爾科技有限公司；siRNA 及PCR 引物由武漢賽維爾生物公司設計合成，序列見表1。

表1 qRT-PCR 引物及siRNA 序列

1.3 免疫組化檢測 將所收集的病理組織制成石蠟切片后經(jīng)60 ℃烤片溶蠟，二甲苯及梯度乙醇脫蠟脫水后置于95 ℃水浴鍋中靜置20 min，用3%過氧化氫（H2O2）溶液浸泡孵育，去除內(nèi)源性抗原，并在4 ℃冰箱加一抗孵育過夜。使用磷酸鹽緩沖液清洗3 次，每次約5 min，然后孵育二抗1～2 h 后，DAB顯色。蘇木素溶液復染并利用1%乙醇反藍，封片后干燥。由3 名有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師分別閱片后進行評分。

1.4 qRT-PCR 及siRNA 轉染 采用TRizol 法提取組織或細胞中RNA，經(jīng)儀器測定RNA 濃度及純度無誤后，利用DNA 去除和反轉錄步驟制備cDNA。采用qRT-PCR 檢測相對表達量，進行PCR 反應。反應條件為：95 ℃預變性5 min，1 個循環(huán)；95 ℃變性10 s，60 ℃退火，延伸30 s，30 個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，1 個循環(huán)。取對數(shù)期生長的AGS 和MGC-803 胃癌細胞接種到6 孔細胞培養(yǎng)板，加入無抗菌藥物培基培育12～24 h，待細胞融合度為約50%時進行轉染，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后進行轉染效率檢測和后續(xù)實驗。

1.5 細胞增殖、凋亡及侵襲能力檢測 利用胰酶消化并制備細胞懸液，在細胞計數(shù)板中計數(shù)后，將細胞接種于96 孔板，每孔接種約2 000 個細胞，每5 個副孔設置為一組。檢測各組細胞5 d 的生長情況，使用酶標儀檢測450 nm 處吸光度值（A），以各組胃癌細胞的A值表示細胞增殖水平。FITC/PI 雙染法收集處理轉染后的細胞，并利用流式細胞術檢測細胞凋亡；將各組細胞轉染后接種至Transwell 小室，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，清洗小室后以結晶紫染色并于顯微鏡下觀察各小室穿過的細胞，計算細胞數(shù)量以測定各組細胞的侵襲能力。

1.6 Western blotting 檢測 利用RAPA 裂解液將細胞在冰上裂解約30 min 后，高速離心，收集上清蛋白液，變性后低溫保存，上樣80 V 恒壓電泳，恒流轉膜后孵育抗體，并利用顯影液顯影后觀察蛋白條帶。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 25.0 軟件分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以百分比表示，采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織中UGT2B15 的表達 免疫組化結果顯示，UGT2B15 在胃癌組織中呈深黃色或褐色，而在癌旁正常腺體組織中，UGT2B15 呈淡黃色或無染色，表明UGT2B15 在癌組織中表達明顯高于癌旁組織。qRT-PCR 檢測結果也顯示UGT2B15 的mRNA在癌組織中表達水平明顯高于癌旁組織。見圖1。2.2 UGT2B15 表達與胃癌患者臨床病理及預后的關系 UGT2B15 在胃癌中的表達與腫瘤浸潤深度、脈管侵犯和TNM 分期密切相關（均P＜0.05），而與患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、淋巴結轉移、神經(jīng)侵犯以及遠處轉移無關。見表2。Kaplan-Meier 生存分析顯示，UGT2B15 高表達患者的特定疾病生存率（disease-specific survival，DSS）和總生存率（overall survival，OS）均明顯低于低表達患者（DSS：Log Rank＝8.425，P＝0.004；OS：Log Rank＝9.776，P＝0.009）。

圖1 免疫組化檢測UGT2B15 在胃癌組織（1A）及癌旁正常腺體組織（1B）中的表達

表2 UGT2B15 表達與胃癌臨床病理因素的關系

2.3 siRNA 干擾胃癌細胞UGT2B15 表達抑制胃癌細胞增殖、侵襲并促進凋亡 UGT2B15 在AGS 和MGC-803 細胞中的表達水平明顯高于胃黏膜上皮細胞GES1，因此利用siRNA 熒光標記UGT2B15 后干擾AGS 和MGC-803 中UGT2B15 的表達。采用CCK-8 法檢測轉染后的各組細胞增殖能力，結果顯示，抑制組的AGS 和MGC-803 細胞增殖能力均明顯低于對照組（AGS：0.67±0.25 比1.75±0.43，MGC-803：0.82±0.33 比1.86±0.47，均P＜0.05）。FITC/PI 雙染實驗和Teanswell 實驗結果顯示，抑制組的細胞凋亡率明顯高于對照組〔（17.2±6.4）%比（8.7±3.4）%，P＜0.05〕，A值明顯低于對照組（AGS：472.0±36.5 比700.3±82.2，MGC-803：487.2±18.2比638.5±21.3，均P＜0.05）。見圖2。

2.4 siRNA 抑制UGT2B15 表達并下調(diào)FOXA1 表達 生物信息學分析表明，F(xiàn)OXA1 在胃癌中表達升高，且與UGT2B15 的表達密切相關，為進一步明確二者關系，采用免疫組化方法檢測FOXA1 在胃癌中的表達，結果顯示FOXA1 在癌組織中的表達明顯高于癌旁組織；Western blotting 及qRT-PCR 結果也顯示siRNA 抑制胃癌細胞UGT2B15 后可明顯降低FOXA1 的蛋白及RNA 表達（蛋白表達：0.091±0.0182 比0.045±0.0124，RNA 表達：AGS：1.000±0.000 比0.582±0.124，MGC-803：1.000±0.000 比0.724±0.157，均P＜0.05）。見圖3～4。

圖 2 抑制UGT2B15 的表達可明顯促進細胞凋亡并降低胃癌細胞侵襲能力

圖3 Western blotting 檢測siRNA 抑制UGT2B15 后FOXA1 的蛋白表達水平

圖4 qRT-PCR 檢測siRNA 抑制UGT2B15 后FOXA1 的RNA 表達水平

3 討論

胃癌是危害社會公共健康的難題，雖然診療技術的不斷完善使胃癌診治方法有了較大進展，但由于其侵襲轉移能力強，且早期癥狀不明顯，胃癌治療仍然十分困難［7］。隨著精準醫(yī)學的不斷發(fā)展，從基因層面尋找治療靶點一直是胃癌研究的熱點和重點，因此尋找有效的分子標志物十分迫切。近年來，隨著第三代基因測序及生物信息學的飛速發(fā)展，越來越多的研究者將兩者結合，分析和篩選出大量參與胃癌調(diào)控的分子標志物，也從各層面進一步揭示了胃癌的發(fā)展規(guī)律，為臨床治療提供新思路［8-9］。

本課題組前期通過對GEO 數(shù)據(jù)集中GSE54129、GSE79973、GSE56807 納入126 例胃癌組織及36 例癌旁組織的差異表達基因進行分析，篩查出它們共有118 個差異表達mRNA，并利用基因聚類分析、基因信號通路分析和蛋白間相關性分析等方法最終篩選發(fā)現(xiàn)UGT2B15 可能是參與胃癌發(fā)生發(fā)展的關鍵分子。目前對UGT2B15 的研究主要集中在其對藥物代謝的影響以及在腫瘤耐藥等方面的作用［10-11］。但本研究后續(xù)實驗表明，在136 例胃癌組織中檢測UGT2B15 的蛋白表達，同時采用qRT-PCR 方法檢測另外90 例胃癌及癌旁組織中UGT2B15 的RNA表達水平，其表達明顯高于癌旁組織。因此推測UGT2B15 可能是參與胃癌發(fā)生的重要分子。另外，通過分析其在胃癌中的表達及其與臨床病理的關系，結果表明UGT2B15 在胃癌組織中的陽性表達與腫瘤浸潤深度、脈管浸潤及TNM 分期密切相關。TNM 分期以及脈管侵犯都是胃癌不良預后的獨立危險因素［12］。通過對136 例患者進行追蹤隨訪，進一步發(fā)現(xiàn)UGT2B15 陽性表達組患者的總體病死率和疾病特定死亡率明顯高于UGT2B15 陰性表達組患者，因此推動UGT2B15 可能成為胃癌不良預后的分子標志物。另外，由于UGT2B15 與胃癌腫瘤侵犯深度密切相關，提示UGT2B15 可能參與胃癌腫瘤浸潤發(fā)展，因此利用siRNA 抑制UGT2B15 在胃癌細胞系AGS 和MGC-803 中的表達后，檢測其對胃癌細胞增殖、凋亡和侵襲的影響，結果表明與對照組比較，UGT2B15-siRNA 組細胞的增殖能力和侵襲能力明顯下降，且細胞凋亡率上升，也進一步證實UGT2B15 對調(diào)控胃癌發(fā)展具有重要意義。為進一步研究UGT2B15 促進胃癌發(fā)展的分子作用機制，結合前期生物信息學研究，結果表明UGT2B15在胃癌中的表達與FOXA1 存在明顯關系，F(xiàn)OXA1是Hippo-YAP 信號通路骨架蛋白，并調(diào)控其信號活性。有研究證實，腫瘤細胞通過高表達FOXA1活化Hippo-YAP 信號通路促進腫瘤發(fā)生發(fā)展及耐藥［13-14］。在胃癌、卵巢癌及乳腺癌患者中已經(jīng)證實，F(xiàn)OXA1 活化Hippo-YAP 信號通路并上調(diào)YAP 表達，促進腫瘤細胞增殖及遷移［15-16］。YAP1 蛋白進入細胞核為Hippo 信號通路的關鍵事件。在YAP1 進入細胞核后，特異性與轉錄增強相關結構域（transcriptional enhanced associate domain，TEAD）等蛋白結合，共同發(fā)揮轉錄增強子作用，促進DNA 的轉錄，從而影響腫瘤增殖及發(fā)展［17］。本研究也進一步通過Western blotting 和qRT-PCR 等實驗證明，在胃癌細胞中抑制UGT2B15 的表達可明顯降低FOXA1 的蛋白和RNA 表達水平，因此推測，UGT2B15 可能通過調(diào)控FOXA1 表達活化Hippo-YAP 信號通路，從而促進胃癌細胞增殖，但更深層的分子機制及調(diào)控方式還有待進一步研究。

綜上所述，UGT2B15 在胃癌組織中表達水平升高，且與腫瘤浸潤深度、脈管侵犯、TNM 分期以及不良預后密切相關；UGT2B15 可能參與胃癌細胞增殖、侵襲以及凋亡；抑制胃癌細胞中UGT2B15 的表達后可降低FOXA1 的表達。因此UGT2B15 有望成為胃癌診療的有效分子標志物。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突