李艷 郭心靈 馬曉霞 靳福旭

作者單位：300308 天津，天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院空港醫(yī)院檢驗(yàn)科

2019 年12 月以來(lái)，由新型冠狀病毒（2019 novel coronavirus，2019-nCoV）引起的新型冠狀病毒肺炎（新冠肺炎）疫情在全球各地持續(xù)發(fā)生。2020 年1 月12日國(guó)際病毒分類委員會(huì)將該病毒命名為嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）［1］。有研究表明，2019-nCoV 在塑料和鋼表面可存活3 d［2-3］，收治新冠肺炎患者的醫(yī)院環(huán)境采樣存在2019-nCoV 污染，表明病毒可以通過(guò)物體表面間接傳播［4］。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）的建議，及時(shí)準(zhǔn)確地檢出鼻咽拭子樣本中2019-nCoV的RNA，是直接診斷新冠肺炎的首選方法，血清學(xué)檢測(cè)可作為疾病診斷以及流行病學(xué)研究的補(bǔ)充方法［5-8］。檢測(cè)出無(wú)癥狀感染者體內(nèi)的2019-nCoV，并追蹤他們的所有潛在的接觸者，被認(rèn)為是限制病毒進(jìn)一步傳播的關(guān)鍵［9］。2019-nCoV 的傳播可能發(fā)生在窗口期，潛伏期內(nèi)也可能傳播，在任何臨床癥狀出現(xiàn)前的一到兩周甚至更長(zhǎng)時(shí)間段內(nèi)均有可能傳播［9-10］。因此，無(wú)癥狀感染者和近期發(fā)病者的鑒定必須是基于病毒RNA 的直接鑒定［7-8］。然而，在新冠肺炎大流行和2019-nCoV 高突變的背景下，以及考慮到病毒核酸檢測(cè)試劑的潛在局限性，不能滿足及時(shí)檢測(cè)樣本中病毒RNA 的要求。在2019-nCoV核酸檢測(cè)過(guò)程中，由于RNA 降解導(dǎo)致的假陰性結(jié)果都可能影響臨床醫(yī)師對(duì)疾病的診斷。

對(duì)臨床實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)，標(biāo)準(zhǔn)化的樣本運(yùn)輸方式、樣本儲(chǔ)存時(shí)間和溫度要求是至關(guān)重要的，也是實(shí)驗(yàn)室分析前質(zhì)量控制（質(zhì)控）的重要組成部分。本研究收集10例新冠肺炎住院患者的20份鼻咽拭子樣本，將每份鼻咽拭子樣本進(jìn)行21 等分，其中1 份于當(dāng)日進(jìn)行檢測(cè)，另外于室溫（25 ℃）、4 ℃、-20 ℃、-80 ℃條件下分別存放5 等份樣本，并于存放的第1、2、3、7、14 天進(jìn)行2019-nCoV 核酸提取與擴(kuò)增，比較循環(huán)閾值（cycle threshold，CT 值），探討樣本保存時(shí)間和溫度對(duì)核酸檢測(cè)結(jié)果的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 樣本采集 采集10 例新冠肺炎住院患者（由于醫(yī)院性質(zhì)原因，非同一時(shí)期住院患者）鼻咽拭子，將樣本置于（4.0±0.3）mL 運(yùn)送培養(yǎng)基內(nèi)。采用實(shí)驗(yàn)當(dāng)日本院職工篩查標(biāo)本（＞40 份/d）作為陰性對(duì)照，同時(shí)采用3 份生物安全柜內(nèi)紫外線照射過(guò)的生理鹽水參與提取和擴(kuò)增的全過(guò)程。弱陽(yáng)性質(zhì)控采用第三方質(zhì)控品參與提取和擴(kuò)增全過(guò)程。

1.2 儀器與試劑 使用含有胍鹽成分的滅活樣本保存液（購(gòu)自天津?yàn)笕A科生物科技有限公司）保存拭子，2019-nCoV RNA 液體室內(nèi)質(zhì)控品S0 購(gòu)自廣州邦德盛生物科技有限公司，濃度為9.86×102個(gè)拷貝/mL，采用NSE-32 核酸提純儀（購(gòu)自西安天隆科技有限公司）進(jìn)行樣本核酸提取，擴(kuò)增使用的實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）2019-nCoV 核酸檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州達(dá)安基因股份有限公司，ABI 7500 擴(kuò)增儀購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）公司，實(shí)驗(yàn)所用耗材均為無(wú)酶耗材。

1.3 檢測(cè)方法 采集每位患者的兩份鼻咽拭子，分別混勻、靜置，在標(biāo)本采集后3 h 內(nèi)進(jìn)行20 等分。在標(biāo)本分裝完成之前，所有標(biāo)本除加樣、分裝外，均置于4 ℃保存待用。當(dāng)日檢測(cè)標(biāo)本從采樣到上機(jī)擴(kuò)增時(shí)間控制在2 h 內(nèi)，并以此CT 值作為參考。剩余標(biāo)本分為4 組：25 ℃（室溫）、4 ℃（冰箱）、-20 ℃（冷凍）、-80 ℃（低溫冷凍），每個(gè)溫度5 份；在第1、2、3、7、14 天后進(jìn)行核酸提取和擴(kuò)增，并記錄CT 值，與參考CT 值進(jìn)行比較。

使用自動(dòng)化核酸提取平臺(tái)NSE-32 核酸提純儀提取RNA，使用ABI 7500 擴(kuò)增儀進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，每次實(shí)驗(yàn)都由一個(gè)外部陽(yáng)性質(zhì)控品（廣州邦德盛生物科技有限公司）和3 個(gè)陰性來(lái)料質(zhì)控（incoming quality control，IQC）監(jiān)控，以當(dāng)日本院職工篩查標(biāo)本作為對(duì)照，上述質(zhì)控始終與患者樣本平行運(yùn)行。

1.4 倫理學(xué) 本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)本院倫理審批（審批號(hào)：IRB2022-WZ-02），所有檢測(cè)均獲得過(guò)患者或家屬的知情同意。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 根據(jù)變量分布，使用Wilcoxon 符號(hào)秩和檢驗(yàn)對(duì)當(dāng)日檢測(cè)CT 值和剩余等分標(biāo)本的檢測(cè)CT 值進(jìn)行比較。多次重復(fù)的方差分析用于評(píng)估溫度和時(shí)間對(duì)標(biāo)本檢測(cè)的影響。P＜0.05 被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 相同保存溫度不同保存時(shí)間2019-nCoV 核酸檢測(cè)結(jié)果 樣本在-20 ℃和-80 ℃儲(chǔ)存7 d、4 ℃保存48 h 后相對(duì)穩(wěn)定；樣本在-20 ℃和-80 ℃儲(chǔ)存7 d、4 ℃儲(chǔ)存48 h和室溫儲(chǔ)存24 h后核酸檢測(cè)CT值有明顯的上升趨勢(shì)。見(jiàn)圖1～2。

圖1 相同保存溫度不同保存時(shí)間樣本2019-nCoV核酸檢測(cè)N 基因CT 值比較

2.2 不同樣本在不同變量下2019-nCoV 核酸檢測(cè)CT 值的CV 值比較 對(duì)20 份樣本在不同變量下的2019-nCoV 核酸檢測(cè)結(jié)果CT 值的CV 值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，在忽略保存時(shí)間的條件下，樣本保存在25 ℃（室溫）下保存時(shí)，ORF-1ab 和N 基因CT 值的CV 偏大；樣本保存在-80 ℃條件下，樣本的ORF-1ab 和N 基因CT 值的CV 偏小。在不同溫度下，ORF-1ab基因在保存第7 天時(shí)CV 均＞5%；N 基因在保存第7 天時(shí)25 ℃、4 ℃和-20 ℃出現(xiàn)CV 值＞5%。見(jiàn)表1。在忽略保存溫度的條件下，樣本保存時(shí)間為7 d 時(shí)標(biāo)本的ORF-1ab 基因和N 基因CT 值的CV 偏大，樣本保存時(shí)間為14 d 時(shí)，20 份標(biāo)本中有6 份標(biāo)本ORF-1ab 基因CT 值的CV＞5%，7 份標(biāo)本N 基因CT值的CV＞5%。見(jiàn)表2。

表2 保存不同時(shí)間2019-nCoV 核酸檢測(cè)ORF-1ab 和N 基因CT 值的CV 值

圖2 相同保存溫度不同保存時(shí)間樣本2019-nCoV核酸檢測(cè)ORF-1ab 基因CT 值比較

表1 不同保存溫度下2019-nCoV 核酸ORF-1ab和N 基因CT 值的CV 值

3 討論

本研究表明，在分析2019-nCoV 核酸兩個(gè)靶基因的CT 值時(shí)，鼻咽拭子樣本的儲(chǔ)存溫度及儲(chǔ)存時(shí)間等條件可被視為2019-nCoV 核酸檢測(cè)分析中潛在的分析前誤差因素。

有研究表明，在現(xiàn)有的出院標(biāo)準(zhǔn)下，仍有部分患者是2019-nCoV 攜帶者，目前疫情已進(jìn)入常態(tài)化階段，及時(shí)進(jìn)行重點(diǎn)人群核酸檢測(cè)和隨訪，對(duì)預(yù)防疫情反彈至關(guān)重要［11］。在疫情常態(tài)化防控階段，核酸檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要，而檢驗(yàn)前的標(biāo)本質(zhì)控是保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的重要一環(huán)。對(duì)疑似新冠肺炎患者的鼻咽拭子進(jìn)行RT-PCR 可以準(zhǔn)確診斷新冠肺炎［10，12］。RT-PCR 基于指數(shù)擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)，CT 值與樣本中的病毒載量密切相關(guān)［12］。RT-PCR 結(jié)果還與以下因素相關(guān)：① 樣本采集質(zhì)量；② 樣本采集到檢測(cè)的時(shí)間；③ 樣本保存以及運(yùn)輸溫度；④ 樣本保存緩沖液；⑤ 提取核酸過(guò)程（包括提取試劑、儀器、加樣量以及人員操作）；⑥ RT-PCR 擴(kuò)增試劑的前期處理、RNA 加樣、擴(kuò)增過(guò)程以及不同人員對(duì)結(jié)果的解釋等。在以上因素中，任何步驟產(chǎn)生誤差都有可能影響檢測(cè)結(jié)果，從而影響臨床診斷。為降低標(biāo)本采集誤差對(duì)研究結(jié)果的影響，本研究選擇同一患者的鼻咽拭子兩份標(biāo)本充分混勻再進(jìn)行等分，盡量減少變量以外的因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。從采集樣本到將樣本運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)可能需要較長(zhǎng)的時(shí)間間隔，特別是病毒大面積隱匿傳播，需要進(jìn)行重點(diǎn)人群核酸篩查時(shí)。在上述情況下，要控制樣本的運(yùn)輸溫度與運(yùn)送時(shí)間，將對(duì)核酸檢測(cè)結(jié)果的影響降到最小。本研究結(jié)果表明，樣本在-20 ℃和-80 ℃條件儲(chǔ)存的前7 d 內(nèi)和在4 ℃條件保存的48 h 內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定；樣本在-20 ℃和-80 ℃條件儲(chǔ)存7 d、4 ℃條件儲(chǔ)存48 h 和室溫儲(chǔ)存24 h 后核酸檢測(cè)CT 值結(jié)果有明顯的上升趨勢(shì)。

本研究的局限性主要在于僅使用一種類型的采樣拭子、一種提取試劑和一種擴(kuò)增試劑，缺乏不同試劑間的比較，這可能對(duì)樣本的完整性和測(cè)試結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。

綜上所述，樣本儲(chǔ)存溫度和時(shí)間是2019-nCoV核酸檢測(cè)中潛在的分析前誤差，由于RNA 的不穩(wěn)定性，當(dāng)檢測(cè)延遲時(shí)，尤其是在處于較高的儲(chǔ)存溫度，經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)的儲(chǔ)存時(shí)間，且病毒載量較低的情況下，由于樣本的保存溫度和保存時(shí)間不恰當(dāng)可能會(huì)造成假陰性結(jié)果，從而影響臨床診斷。樣本采集后應(yīng)在低溫保存運(yùn)輸并盡快檢測(cè)，以減少因儲(chǔ)存溫度和時(shí)間導(dǎo)致的分析前誤差。本研究數(shù)據(jù)可能會(huì)為制定新冠肺炎分子診斷的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程提供依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突