李鈺華 黃杰 姬曉偉 費(fèi)嘉 于婷★ 黃以寧★

地中海貧血是珠蛋白基因缺陷導(dǎo)致的一種溶血性疾病，為全球分布最廣、攜帶/發(fā)病人群最多的一種常染色體單基因遺傳?。?］。在中國，地貧多發(fā)于廣東、海南等南部沿海地區(qū)［2］，以α型和β型最為常見，編碼ɑ-珠蛋白的HBA基因和編碼β-珠蛋白的HBB基因的突變和缺失是導(dǎo)致地中海貧血的直接原因。胚胎植入前單基因病檢測技術(shù)（Preimplantation Genetic Testing for Monogenic，PGT-M）通過檢測致病基因區(qū)域上下游一定范圍的遺傳學(xué)標(biāo)志物，結(jié)合家系成員之間的遺傳學(xué)關(guān)系及致病基因攜帶情況，構(gòu)建單體型以區(qū)分致病和正常胚胎，避免將攜帶致病基因的胚胎移植入母體。早期單體型構(gòu)建主要采用PCR 法擴(kuò)增與致病基因座連鎖的生物標(biāo)記物［3-4］，但通量低、靈活性差、易受等位基因脫扣（allele dropout，ADO）的影響［5-6］，位點(diǎn)附近如發(fā)生重組時(shí)易引起誤診。隨著高通量檢測技術(shù)［7-9］的發(fā)展，二代測序（Next generation sequencing，NGS）和基因芯片已逐步應(yīng)用于PGT-M。本研究擬對一種NGS 地貧panel 和全基因組SNP（single nucleotide polymorphism，SNP）芯片試劑的檢測性能進(jìn)行評價(jià)，為胚胎植入前地中海貧血檢測選擇適宜的方法提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 胚胎植入前地中海貧血診斷國家參考品

批號：360027-201901，由中國食品藥品檢定研究院研制并提供，包含4 個(gè)地中海貧血家系20 份樣本。參考品原料系以人全血建立的永生化細(xì)胞系和永生化細(xì)胞系提取的DNA，適用于對父本、母本、和（或）先證者以及胚胎檢測。

1.2 主要試劑

DNA 定量試劑（Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit，美國ThermoFisher 公司），核酸純化磁珠（AMPure XP 磁珠，北京中儀康衛(wèi)醫(yī)療器械有限公司），SNP 芯片試劑盒（Infinum Assay Kit，美國illumina公司），單核苷酸多態(tài)性微陣列芯片（Human CytoSNP-12v2.1，美國illumina 公司），單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒（Discover-sc?Single Cell WGA Kit，南京諾唯贊生物科技有限公司），多重靶向擴(kuò)增試劑盒［MultipSeq?Custom Panel，艾吉泰康生物科技（北京）有限公司］，測序反應(yīng)通用試劑盒（MiSeqTMDx Reagent Kit v3，美國illumina 公司）。

1.3 主要儀器

SNP 芯片掃描儀（型號：iScan，美國illumina 公司），Life ECO 基因擴(kuò)增儀（型號：TC-96/G/H（b）C，杭州博日公司），高通量測序儀（型號：Miseq，美國Illumina 公司）。

1.4 NGS panel 及全基因組芯片試劑盒位點(diǎn)分析

市售用于胚胎植入前地中海貧血基因檢測的試劑盒包括：基于NGS 方法的地貧panel、基于全基因組SNP 的芯片試劑盒。文獻(xiàn)中［5，6，8］進(jìn)行胚胎植入前單基因病遺傳學(xué)檢測的全基因組SNP 芯片主要來源于illumina 公司，其芯片產(chǎn)品包括：HumanCyto-12、ASA 芯片、GSA 芯片。分別對3 款芯片及NGS panel 的SNP 位點(diǎn)設(shè)計(jì)數(shù)量、最小等位基因頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，評估NGS panel 和全基因組SNP 芯片試劑盒的檢測性能。

1.5 試驗(yàn)方法

國家參考品中4 份模擬胚胎樣本（含3～5 個(gè)細(xì)胞）采用單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行多重置換擴(kuò)增，產(chǎn)物定量后與gDNA 樣本進(jìn)行后續(xù)檢測。按照SNP 芯片試劑盒說明書操作步驟，對參考品進(jìn)行處理和芯片雜交，芯片包被后通過iScan掃描儀掃描獲得數(shù)據(jù)。

同時(shí)樣本按照MultipSeq?Custom Panel 文庫構(gòu)建流程進(jìn)行文庫制備，文庫經(jīng)稀釋混合變性后，在Miseq 高通量測序儀上進(jìn)行測序。將iScan 和Miseq 下機(jī)數(shù)據(jù)上傳至嘉寶仁和公司PGX Cloud 云平臺(tái)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，選取HBA和HBB基因及上下游2 Mb 范圍構(gòu)建單體型，并統(tǒng)計(jì)有效位點(diǎn)數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 NGS地貧panel和全基因組SNP芯片位點(diǎn)評估

除HBA基因上游外，所有類型芯片在其它位置設(shè)計(jì)的SNP 位點(diǎn)數(shù)量均大于NGS panel。見表1。ASA 和GSA 所設(shè)計(jì)的位點(diǎn)最小等位基因頻率（Minor allele frequency，MAF）集中在0-0.1，與NGS 地中海貧血panel 及Cyto-12 芯片相比偏低。見圖1、圖2。

表1 目標(biāo)區(qū)域位點(diǎn)數(shù)量Table 1 Number of loci in target area

圖1 HBA 基因上下游位點(diǎn)MAF 值分布Figure 1 Distribution of MAF values of upstream and downstream loci of HBA gene

圖2 HBB 基因上下游位點(diǎn)MAF 值分布Figure 2 Distribution of MAF values of upstream and downstream loci of HBB gene

2.2 數(shù)據(jù)質(zhì)量

基因組DNA 樣本數(shù)據(jù)質(zhì)量良好，4 個(gè)模擬胚胎活檢樣本質(zhì)控參數(shù)的質(zhì)量偏低，尤其是30 X 覆蓋度（58.71%～88.50%）和SNP 檢出率（0.595 9～0.701 1）。見表2。

表2 數(shù)據(jù)質(zhì)量參數(shù)Table 2 Data quality parameters

2.3 HBA 有效位點(diǎn)結(jié)果

2 種方法在HBA基因上游2 Mb 范圍內(nèi)獲得2個(gè)以上有效位點(diǎn)，但均未在基因下游0～1 Mb 范圍內(nèi)檢測到有效位點(diǎn)。在HBA基因下游1～2 Mb 范圍內(nèi)，除4 號家系男方樣本兩種方法均未獲得有效位點(diǎn)外，NGS 地貧panel 在其它樣本上獲得的有效位點(diǎn)數(shù)總體多于SNP 芯片，在1 號家系中，NGS 地貧panel 檢測到了短串聯(lián)重復(fù)序列（Short tandem repeats，STR）位點(diǎn)。見表3。

表3 HBA 基因SNP 有效位點(diǎn)Table 3 SNP effective loci of HBA gene

2.4 HBB 有效位點(diǎn)結(jié)果

兩種方法均能在HBB基因上下游各2 Mb 范圍內(nèi)獲得2 個(gè)以上有效位點(diǎn)。見表4。

表4 HBB 基因SNP 有效位點(diǎn)Table 4 SNP effective loci of HBB gene

2.5 單體型構(gòu)建及家系分析

以1 號、4 號家系的NGS 和芯片數(shù)據(jù)構(gòu)建的HBA和HBB家系單體型結(jié)果見圖3、圖4。兩種方法構(gòu)建的胚胎單體型結(jié)果與國家參考品標(biāo)明的致病性位點(diǎn)遺傳關(guān)系一致，但由于SNP 芯片在1 號家系男方HBA基因下游無有效位點(diǎn)，因此不能排除胚胎在HBA基因下游區(qū)域的重組風(fēng)險(xiǎn)。見表5。

表5 單體型構(gòu)建結(jié)果一致性Table 5 Consistency of results for haplotype construction

圖3 1 號家系HBA 基因家系關(guān)系圖Figure 3 genealogical tree of HBA gene in family 1

圖4 4 號家系HBB 基因家系關(guān)系圖Figure 4 genealogical tree of HBB gene in family 4

備注：F0 表示男方風(fēng)險(xiǎn)染色體，F(xiàn)1 表示男方正常染色體，M0 表示女方風(fēng)險(xiǎn)染色體，M1 表示女方正常染色體，圖4 同。

3 討論

全基因組SNP 芯片和NGS 法均為高通量檢測技術(shù)，芯片法優(yōu)勢在于通用性和一體化，在進(jìn)行單基因病檢測的同時(shí)給出染色體非整倍體信息［10］，而胚胎植入前非整倍體篩查（Preimplanation Genetic Testing for aneuploidy，PGT-A）的加入與單獨(dú)的胚胎植入前單基因遺傳學(xué)檢測（preimplantation genetic testing for monogenic，PGT-M）周期相比妊娠率顯著增加（68.4% vs 45.4%）［11］。NGS 法從檢測成本考慮，全基因組測序的深度及分辨率不足以實(shí)現(xiàn)大多數(shù)單基因病的檢出［12］，需通過多重PCR 靶向擴(kuò)增，對目標(biāo)區(qū)域富集后檢測以達(dá)到較高測序深度，其缺點(diǎn)在于需針對每一種單基因病定制靶向富集引物，且無法同時(shí)給出PGT-A 檢測結(jié)果。但對于基因組的特殊區(qū)域（如端粒區(qū)），NGS 方法表現(xiàn)相對靈活，可根據(jù)實(shí)際情況添加或刪除檢測位點(diǎn)，因此在解決部分疑難病例上更有針對性。

本研究首先篩選了適用于進(jìn)行胚胎植入前地貧檢測的試劑盒，其中NGS panel 在千人基因組數(shù)據(jù)庫中篩選最小等位基因頻率大于等于0.1 的SNP 位點(diǎn)，去除含有多聚核苷酸及上下游100 bp范圍內(nèi)GC 含量大于70%的SNP 及STR 位點(diǎn)。針對SNP 芯片方法，分析了3 款芯片（ASA、GSA、Cyto-12）參數(shù)，前兩者位點(diǎn)數(shù)量較多，但位點(diǎn)MAF值偏低，且定位于全基因組關(guān)聯(lián)分析研究，大部分位點(diǎn)為低頻位點(diǎn)，不適合用于胚胎植入前單基因病遺傳學(xué)檢測；而Cyto-12 芯片位點(diǎn)MAF 值較其他芯片更高，應(yīng)用相對成熟，已有文獻(xiàn)報(bào)道廣泛應(yīng)用于胚胎植入前遺傳學(xué)檢測和產(chǎn)前診斷［13］。

地中海貧血國家參考品樣本來源清晰，突變位點(diǎn)均已確認(rèn)，故用于對NGS panel 和SNP 芯片試劑盒進(jìn)行評價(jià)。有效位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，HBA基因上游2 Mb 范圍內(nèi)，兩種方法均能獲得足夠的有效位點(diǎn)，但在基因內(nèi)部和下游2 Mb 范圍內(nèi)有效位點(diǎn)數(shù)量大幅減少，在HBB基因上下游2 Mb 范圍內(nèi)，NGS panel 和Cyto-12 芯片試劑盒均獲得足夠的有效位點(diǎn)。由于HBA基因下游靠近16 號染色體端粒，端粒區(qū)域多為高度重復(fù)區(qū)域，不利于探針和引物的設(shè)計(jì)。對于芯片來說，探針設(shè)計(jì)時(shí)為提高探針雜交成功率和準(zhǔn)確性，除需滿足類似于NGS panel 引物設(shè)計(jì)的條件外還需滿足其它條件：例如探針60 bp 范圍內(nèi)不能存在未測明的N 堿基，25 bp 內(nèi)不能存在其它SNP 位點(diǎn)等，這導(dǎo)致對于基因組特殊區(qū)域來說，芯片的多家系適用性降低。單體型構(gòu)建結(jié)果表明，針對HBA基因，芯片在1 號家系男方樣本的基因下游未獲得有效位點(diǎn)，因此不能排除基因該側(cè)在胚胎中的重組風(fēng)險(xiǎn)。而NGS panel 在該區(qū)域能夠獲得足夠的有效位點(diǎn)，且同時(shí)在1 號和3 號家系中檢測到了STR 位點(diǎn)，因此可給出胚胎致病性的明確判斷。STR 是PGT-M 檢測中常見的遺傳標(biāo)志物之一［14］，單個(gè)STR標(biāo)志物的信息含量相當(dāng)于3 個(gè)SNP［15］。采用SNP+STR 標(biāo)志物的方式能夠增加排除胚胎染色體重組的靈敏性，提高家系單體型分析的可靠性。

綜上所述，在地中海貧血國家參考品HBB基因家系分析中，采用NGS 地中海貧血panel 和全基因組SNP 芯片均可給出基因致病性判斷，但對于HBA基因，SNP 芯片在部分家系中由于有效位點(diǎn)不足無法排除胚胎重組。說明該芯片針對HBA基因胚胎植入前檢測存在一定風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)謹(jǐn)慎選擇，建議針對特殊區(qū)域采用NGS 法構(gòu)建單體型，提高臨床檢測效率。