宋 煜，李海濤，邵 敏，周鶴峰

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū) 生物工程教研室，廣東 珠海 519000；2.遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū) 生物化學(xué)教研室，廣東 珠海 519000)

二硫鍵即-S-S-(Disulfide bond,Dsb)，由多肽鏈上不同位點(diǎn)的兩分子巰基(-SH)氧化形成，可分為鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵[1]。在生理?xiàng)l件下，蛋白質(zhì)的二硫鍵經(jīng)蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶催化作用斷裂形成兩個(gè)巰基，其功能發(fā)生變化[2]。在真核生物中，二硫鍵通常是在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)而非原生質(zhì)形成[3]。二硫鍵能夠被還原劑裂解是其最重要的一個(gè)特性。能夠?qū)⒍蜴I裂解的還原劑較多，其中硫醇如β-硫基乙醇或二硫蘇糖醇(Dithiothreitol，DTT)較為常用。在體內(nèi)和人工條件下，蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶 (Protein disulfide isomerase，PDI)能夠催化巰基與二硫鍵之間的轉(zhuǎn)化，具有分子伴侶功能[4]。二硫鍵與巰基兩種基團(tuán)之間的相互轉(zhuǎn)化主要由巰基-二硫鍵氧化還原酶作為反應(yīng)的催化劑[5],是一類硫醇氧化還原酶，作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的一種駐留蛋白[6]，它催化新生多肽中二硫鍵的形成和異構(gòu)化，這一過程對于正確的蛋白質(zhì)折疊和維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[7-8]。蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶a3(PDIA3)，又被稱作ERp57，分子量為58 KDa，具有PDI酶活性，可通過促進(jìn)蛋白底物中二硫鍵的形成來調(diào)節(jié)新合成蛋白質(zhì)的折疊[9]。

近年來，PDI因其參與多種生理和病理過程而成為治療多種疾病和癌癥的新靶點(diǎn)[10-11]，例如，最近的研究表明PDI家族在調(diào)節(jié)血栓形成中起重要作用，促進(jìn)血小板聚集和血栓形成[12]。鑒于PDI在血栓形成中扮演的重要角色，調(diào)節(jié)PDI活性可以作為治療血栓的潛在藥物靶點(diǎn)。抑制血小板的聚集和纖維蛋白的生成可通過抑制PDI活性來實(shí)現(xiàn)[13-14]。PDIA3是PDI家族的主要成員之一，與PDI具有高度同源性[15]。由于PDIA3可以調(diào)節(jié)多種刺激物誘導(dǎo)的血小板聚集和血栓形成，因而可研究PDIA3抑制劑來抑制血栓形成[16]。

由于PDIA3具有斷裂二硫鍵使其還原為巰基的能力，而牛胰島素分子的A鏈與B鏈之間通過兩對二硫鍵連結(jié)[17]，本實(shí)驗(yàn)采用牛胰島素渾濁法測定PDIA3的活性。在還原劑DTT存在條件下，PDIA3將牛胰島素A鏈和B鏈之間的二硫鍵還原為巰基。A、B鏈之間的二硫鍵還原并斷裂后，A、B鏈發(fā)生錯(cuò)誤折疊，B鏈形成沉淀物，通過測定吸光度即可知其還原活性。

虛擬篩選(Virtual screening，VS)是以藥物設(shè)計(jì)理論為基礎(chǔ)，借助計(jì)算機(jī)技術(shù)和專業(yè)應(yīng)用軟件，從大量化合物中篩選出一些有前途的化合物，進(jìn)行評估實(shí)驗(yàn)活性的方法[18]。虛擬篩選作為計(jì)算機(jī)輔助藥物研究設(shè)計(jì)中的一項(xiàng)實(shí)用化技術(shù)，在當(dāng)代的創(chuàng)新藥物研發(fā)中發(fā)揮著重要作用[19-20]。因此，本研究擬提取人總RNA，利用mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以此為模板克隆PDIA3基因的編碼區(qū)序列，進(jìn)而誘導(dǎo)表達(dá)并純化出PDIA3，從Specs商業(yè)化合物庫中以PDIA3為靶點(diǎn)篩選小分子抑制劑，并對篩選到的化合物進(jìn)行抑酶活性測定，為PDI蛋白抑制劑的篩選和抗血栓藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 pET28a(+)來自Addgene質(zhì)粒庫，Escherichia coli(E.coli) DH5α，E.coliBL21(DE3)，HEK293細(xì)胞均來自生物工程教研室貯存。T4 DNA連接酶，Taq DNA聚合酶，BamH I核酸內(nèi)切酶和NotI核酸內(nèi)切酶均購自New England Biolabs公司；DL2000 DNA Marker和Protein SDS-PAGE loading buffer，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RR055A購自Takara生物公司；彩虹245廣譜蛋白Marker，DTT，牛胰島素，BCA試劑盒和SDS-PAGE 凝膠試劑盒購自Solarbio公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，考馬斯亮藍(lán)R-250及DNA上樣緩沖液購自寶生物工程(大連)有限公司。

PCR儀，全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)及高電流型電泳電源購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；全波段酶標(biāo)儀購自美國ThermoScientific公司；核酸、蛋白電泳儀購自北京六一生物科技有限公司；低溫超聲破碎儀購自上海蘭儀實(shí)業(yè)有限公司；鎳離子柱-FPLC(1 mL)購自Takara生物公司；超凈工作臺，電熱恒溫培養(yǎng)箱，恒溫?fù)u床和電熱恒溫水浴鍋購自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；低溫冷凍離心機(jī)購自德國Eppendorf公司；掌上離心機(jī)購自Solarbio公司。

1.2 方法

1.2.1 HEK293細(xì)胞總RNA的提取 將含HEK293細(xì)胞的培養(yǎng)皿置于冰上，用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次，加入1 mL Trizol裂解液裂解細(xì)胞，將溶液移至1.5 mL Ep管，室溫靜置5 min。然后加入0.2 mL氯仿渦旋15 s，室溫靜置2 min后，4 ℃、12 000 g離心15 min。取上清加入0.5 mL異丙醇，渦旋混合，室溫培養(yǎng)5 min。4 ℃、10 000 rpm離心10 min，去除上清，加1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，4 ℃、14 000 r/min離心5 min，棄上清，待沉淀的RNA在室溫環(huán)境下自然干燥后，加50 μL DEPC水溶解RNA沉淀。然后取樣10 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，剩余樣品-20 ℃保存用于逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA基因。

1.2.2 pET28a-PDIA3載體構(gòu)建及鑒定 基于GenBank中PDIA3的基因序列，使用Vector-NTI軟件設(shè)計(jì)引物，由廣州艾基生物科技有限公司完成引物的合成。RT-PCR法擴(kuò)增目的基因PDIA3的編碼區(qū)序列，用限制性內(nèi)切酶BamH I和NotI進(jìn)行酶切，得到具有互補(bǔ)粘性末端的目的基因和載體，通過T4 DNA連接酶的催化作用進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)入E.coliDH5α中，涂布在具有卡那霉素(Kana)抗性的固體LB培養(yǎng)基上。挑取陽性單克隆菌落在具有Kana抗性的液體LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒送公司測序，經(jīng)測序確定重組質(zhì)粒pET28a-PDIA3構(gòu)建成功后，轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)中，得到含有重組質(zhì)粒pET28a-PDIA3的工程菌。

1.2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 重組蛋白PDIA3采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和純化[21]。將含重組質(zhì)粒pET28a-PDIA3的工程菌置于含Kana 100 μg/mL的5 mL LB培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)至OD600nm約為0.5(37 ℃，220 r/min)，取出1.5 mL至Ep管作為誘導(dǎo)前樣品，然后用IPTG(1.0 mmol/L)分別誘導(dǎo)2 h(取出1.3 mL)、4 h(取出1 mL)、6 h(取出1 mL)，同時(shí)將空載體pET28a于同樣條件下培養(yǎng)6 h后取出1 mL作為對照。每次取樣后，4 ℃、12 000 r/min離心1 min，棄上清，100 μL 1×PBS洗滌菌體一次，100 μL 1×PBS懸浮，再加等體積2× Protein SDS-PAGE loading buffer混勻，立即煮沸(100 ℃、1 min)，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.2.4 工程菌的擴(kuò)大培養(yǎng) 將活化后的種子液按10%比例接入200 mL Kana LB液體培養(yǎng)基(剩余種子液取出1 mL作為陰性對照)，振搖培養(yǎng)至OD600nm約為0.5(37 ℃，220 r/min)，加入IPTG(1.0 mmol/L)誘導(dǎo)4 h(取出1 mL作為陽性對照)，收集菌體，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，棄上清，加入30 mL 1×PBS洗滌菌體一次，再4 ℃、4 000 r/min離心10 min，棄上清，加20 mL Binding buffer懸浮菌體，用于超聲破碎。

1.2.5 超聲破碎 超聲波破碎上述懸浮菌體(工作2 s，間隔2 s，功率40%，20 min)，破碎后的菌體4 ℃、10 000 r/min離心30 min。離心后上清用于純化，沉淀用作對照。

1.2.6 鎳柱親和層析純化 裝柱：吸300 μL混勻的50% NI-NTA至1 mL層析柱中，待完全沉淀后，加入2 mL去離子水洗滌一次(流速：重力作用)；鎳柱平衡：加入2 mL Binding buffer進(jìn)行平衡；蛋白上樣：將樣品重復(fù)上柱(5次)；洗脫：①雜蛋白用5 mL含20 mM咪唑的Washing buffer洗脫；②目的蛋白用0.5 mL 含250 mM咪唑的Elution buffer洗脫。

1.2.7 PDIA3蛋白的生物學(xué)活性測定 比活力是在特定條件下，每毫克蛋白質(zhì)或RNA所具有的酶活力單位數(shù)[22]。純化的重組蛋白PDIA3用牛胰島素渾濁法測定其生物學(xué)活性[23]。在96孔板中，對照組每孔加入10 μL緩沖液，實(shí)驗(yàn)組每孔加入10 μL 0.04 mg/mL PDIA3[24]，然后每孔分別加入50 μL 1 mg/mL胰島素、10 μL 1.5 mM DTT，終體系為70 μL，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)復(fù)孔。用酶標(biāo)儀分別于0、20、40 min 630 nm處測定混合體系的OD值。PDIA3蛋白酶比活力單位采用Ibbetson[25]定義。

1.2.8 PDIA3小分子抑制劑的篩選與體外抑酶活性測定 從PDB數(shù)據(jù)庫中下載PDIA3的X-射線3D結(jié)構(gòu)(PDBID：3F8U)，去除PDIA3結(jié)構(gòu)中多余的水分子，加入氫離子，將蛋白結(jié)構(gòu)能量最小化，選擇PDIA3第二活性位點(diǎn)(C406-G407-H408-C409)作為分子對接中的活性位點(diǎn)，選擇Specs商業(yè)化合物庫通過MOE軟件處理進(jìn)行分子對接，計(jì)算 PDIA3與小分子化合物之間的結(jié)合能，進(jìn)行篩選。

對篩選到的化合物進(jìn)行體外抑酶活性測定。在 96 孔板中，對照組每孔加入10 μL 0.04 mg/mL PDIA3和10 μL緩沖液，實(shí)驗(yàn)組每孔加入10 μL 0.04 mg/mL PDIA3和10 μL不同濃度的待測化合物，待測化合物濃度分別為1、3、10、30和100 μM，然后每孔分別加入50 μL1 mg/mL胰島素、10 μL 1.5 mM DTT，終體系為80 μL，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)復(fù)孔。25℃孵育84 min用酶標(biāo)儀630 nm處測定混合體系的OD值。抑制PDIA3酶活性的計(jì)算公式為[26]：酶活性抑制率(%)=[1-(OD[化合物+PDIA3+DTT]-OD[DTT])/(OD[PDIA3+DTT]-OD[DTT])]×100%。

2 結(jié)果

2.1 HEK293細(xì)胞總RNA的提取 Trizol法提取HEK293細(xì)胞的總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。圖1顯示，兩條泳道均為RNA樣品，28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA 3條帶自上而下分布，其中28S rRNA條帶的亮度約為18S rRNA條帶的兩倍，5S rRNA條帶相對模糊，表明RNA提取較完整。

圖1 RNA瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果

2.2 pET28a-PDIA3載體構(gòu)建及鑒定 廣州艾基生物科技有限公司完成引物的合成，上游引物5’-TTCGGGATCCTCCGACGTGCTAGAACTCACG-3’，下游引物5’-AGAATGCGGCCGCATTAGAGATCCTCCTGTGCCTTCTTC-5’，其中，劃線部分分別為BamH I和Not I的識別序列。為了構(gòu)建pET28a-PDIA3重組質(zhì)粒，利用RT-PCR擴(kuò)增獲得了PDIA3的cDNA，其大小與理論值1518 bp相符(見圖2)，通過酶切、連接、轉(zhuǎn)化等獲得克隆菌株。對獲得的克隆菌株進(jìn)行質(zhì)粒提取，并利用菌落進(jìn)行PCR鑒定，如圖3所示，7個(gè)菌落均擴(kuò)增出與理論值相符的條帶。隨機(jī)挑取3個(gè)菌落進(jìn)行測序，測序結(jié)果顯示插入的PDIA3基因序列與目的基因序列完全一致，表明PDIA3基因已成功克隆到原核表達(dá)載體pET28a(+)中。

圖2 RT-PCR擴(kuò)增目的基因瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果

圖3 菌落PCR鑒定目的基因瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 成功構(gòu)建重組質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)化BL21，挑選單克隆菌株，在含有Kana的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600nm約為0.5時(shí)，取出1.5 mL菌液，然后用IPTG(1.0 mmol/L)分別誘導(dǎo)2、4、6 h。為了作對照，同時(shí)將空載體于相同條件下培養(yǎng)6 h。對空載體、誘導(dǎo)前以及誘導(dǎo)2、4、6 h樣品依次進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，圖4的SDS-PAGE結(jié)果顯示，誘導(dǎo)前與誘導(dǎo)后相比，大腸桿菌總蛋白在誘導(dǎo)后于48 KDa到63 KDa之間出現(xiàn)了新的條帶，其分子量大小約為58 KDa，與預(yù)期的目的蛋白PDIA3(505個(gè)氨基酸)基本吻合。

圖4 重組蛋白PDIA3誘導(dǎo)表達(dá)后SDS-PAGE鑒定結(jié)果

2.4 重組蛋白的純化 將經(jīng)IPTG(1.0 mmol/L)誘導(dǎo)表達(dá)的菌體進(jìn)行超聲破碎，4 ℃、10 000 r/min離心30 min分別得到上清和沉淀。上清作為蛋白樣品用于純化，沉淀用作對照。由于目的蛋白含有his標(biāo)簽，可以通過Ni-NTA樹脂親和層析純化。填充好鎳柱后，上清液上柱，重復(fù)5次，先用5 mL 洗滌緩沖液去除雜蛋白，然后用0.5 mL 洗脫緩沖液將目的蛋白洗脫下來。對超聲前后的菌體、純化超聲后上清、超聲后沉淀依次進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，圖5中SDS-PAGE結(jié)果顯示，目的蛋白經(jīng)純化后的幾乎不含雜蛋白，濃度相對較高。

圖5 目的蛋白PDIA3純化后SDS-PAGE鑒定結(jié)果

2.5 PDIA3蛋白的生物學(xué)活性測定 用牛胰島素檢測純化蛋白PDIA3的生物學(xué)活性。從測定結(jié)果(見圖6)中可以明顯看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，實(shí)驗(yàn)組在630 nm處的OD值逐漸增加，表明純化的PDIA3蛋白具有催化牛胰島素中二硫鍵斷裂還原成巰基的能力，BCA測定標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.00125x+0.119，R2=0.999，根據(jù)OD562nm計(jì)算得到PDIA3的比活力為4.17 U/mg， PDIA3蛋白活性較好[27]。

圖6 PDIA3的生物學(xué)活性測定

2.6 虛擬篩選及體外抑酶活性測定結(jié)果 以PDIA3為靶點(diǎn)蛋白，用MOE軟件將 PDIA3與庫中化合物進(jìn)行分子對接，從中篩選到2個(gè)對PDIA3活性有抑制作用的小分子化合物，并對篩選到的化合物用胰島素比濁法進(jìn)行PDIA3抑酶活性進(jìn)行測定，圖7中實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示化合物去甲氧基姜黃素(Demethoxycurcumin)和 41974954對PDIA3活性有抑制作用，隨著化合物濃度上升，其對PDIA3活性的抑制效果越好?；衔锶ゼ籽趸S素和41974954對PDIA3活性的半數(shù)有效抑制濃度IC50分別為(6.37±0.34、129.8±26.50)μmol/L。

A:去甲氧基姜黃素、41974954的結(jié)構(gòu)；B:兩種化合物對PDZA3活性的抑制結(jié)果比較。

3 討論

PDI是參與蛋白質(zhì)折疊的關(guān)鍵酶，其不僅調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中肽鏈的折疊，還與體內(nèi)的血栓形成有關(guān)，是治療血栓的潛在藥物靶標(biāo)[28-29]。鑒于PDI在體內(nèi)血小板聚集和血栓形成中扮演的重要角色，測定PDI還原酶活性，篩選PDI抑制劑，已成為一種全新的抗血栓治療策略[30]。

本研究基于PDIA3基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建、表達(dá)純化，測定PDIA3還原酶活性，以PDIA3為靶點(diǎn)，運(yùn)用MOE軟件對Specs商業(yè)化合物庫進(jìn)行虛擬篩選。其中，測定的PDI還原酶活性為4.17 U/mg，測定結(jié)果與張婷婷制備的重組PDI比活力測定結(jié)果4.3 U/mg相差不大[31]，但與盧臨萍[32]制備的共表達(dá)菌株P(guān)DI比活力測定結(jié)果107.2 U/mg相差較大?？勺鳛樵搶?shí)驗(yàn)進(jìn)一步完善的方向。

虛擬篩選的優(yōu)點(diǎn)在于技術(shù)發(fā)展成熟、篩選量大且篩選成本相對低廉[33]，廣泛應(yīng)用于基因工程與藥物研發(fā)領(lǐng)域[34-35]。常用的化合物庫有Specs商業(yè)化合物庫、劍橋晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫和世界藥物索引(World drug index，WDI)等[36]，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用Specs商業(yè)化合物庫對PDIA3小分子抑制劑進(jìn)行篩選，通過虛擬篩選得到去甲氧基姜黃素和 41974954，對PDIA3活性有一定抑制作用，且化合物濃度與PDIA3活性抑制效果成正比，篩選結(jié)果與鄒佳使用的Specs商業(yè)化合物庫篩選結(jié)果相符[37]，進(jìn)一步表明此方法可以運(yùn)用在大型化合物庫中進(jìn)行篩選。近年來，國內(nèi)外在一些重要疾病的藥物靶標(biāo)篩選已有成功使用虛擬篩選的案例[38-39]。本研究成功篩選到蛋白PDIA3的小分子抑制劑去甲氧基姜黃素和 41974954，進(jìn)一步證實(shí)PDI可作為抗血栓藥物的篩選靶點(diǎn)，為PDI作為抗血栓治療的潛在藥物靶標(biāo)的進(jìn)一步發(fā)展提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。

本實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR技術(shù)成功構(gòu)建pET28a-PDIA3重組質(zhì)粒，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，超聲破碎后通過鎳柱親和層析分離純化，得到58 kDa的目的重組蛋白PDIA3，用牛胰島素渾濁法測定其活性，以PDIA3為靶點(diǎn)，從商業(yè)化的化合物庫中虛擬篩選小分子抑制劑，胰島素比濁法進(jìn)行抑酶活性測定。結(jié)果表明，純化后的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶a3(PDIA3)具有催化二硫鍵還原成巰基的能力，PDIA3的比活力為4.17U/mg，篩選到PDIA3小分子抑制劑化合物去甲氧基姜黃素和 41974954，且抑制效果與自身濃度成正比。