鄭 姣，羅新輝，穆 歌，謝素貞，趙歡歡

(廣東省婦幼保健院 眼科，廣東 廣州 511400)

補充氧氣治療(氧療)常用于重癥監(jiān)護室新生兒，促進無法獨立進行呼吸的高危早產(chǎn)兒生存[1]。氧療的一個主要后果是發(fā)生支氣管肺發(fā)育不良(Bronchopulmonary dysplasia，BPD)的慢性肺部疾病，影響約50%出生體重<1 000 g的新生兒。BPD特征為肺泡簡化和擴大，是繼發(fā)性分隔中斷和血管組織異常的結(jié)果。成年后，肺部并發(fā)癥通常會惡化，發(fā)展為慢性阻塞性肺疾病[2-3]。另外，在一部分早產(chǎn)兒中，補充氧療還可導致早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(Retinopathy of prematurity，ROP)，而ROP也是導致長期視力障礙和失明的主要原因。據(jù)報道，暴露于高氧會破壞正常的視網(wǎng)膜血管發(fā)育[4]。多個小組的獨立研究報告了在接受氧氣補充的早產(chǎn)新生兒中出現(xiàn)ROP和BPD的共病表現(xiàn)[5]。盡管這兩種疾病具有相似的起始因素并且通常是共病的，但它們同時進行研究的報道較少[6-7]。阿魏酸鈉(Sodium ferulate，SF)是一種阿魏酸的鈉鹽，是當歸和川芎的有效成分。據(jù)報道，口服阿魏酸或阿魏酸乙酯可有效減輕碘酸鈉誘導的視網(wǎng)膜變性小鼠的視網(wǎng)膜損傷[8]。且SF已被證實可顯著改善矽肺小鼠肺損傷和纖維化[9]。于是，預測SF具備治療ROP的潛力。

ROP的實驗模型常被稱為氧誘導視網(wǎng)膜病變(Oxygen-induced retinopathy，OIR)模型，因其概括了在人類嬰兒中看到的雙相病理特征，故而廣泛用于新生兒視網(wǎng)膜疾病研究[7]。因此，本研究采用不同濃度的SF作用于OIR小鼠模型，研究SF對小鼠視網(wǎng)膜以及肺損傷的影響，以期為SF治療ROP提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SF(99%，TG-S10006)獲自上海拓光生物；FITC-葡聚糖(53379)獲自美國Sigma；HE染色液(SH-0421)獲自北京凱詩源；OCT冰凍切片包埋劑(4583)獲自美國SAKURA；TUNEL凋亡檢測試劑盒(JK-R5419)獲自上海晶抗生物工程；一抗HIF-1α(ab228649)、VEGF(ab32152)、TLR4(ab218987)、MyD88(ab219413)、NF-κB p65(ab207297)、TBP(ab171974)和β-actin(ab8226)均購自英國Abcam；ECL發(fā)光液(PE0010)獲自北京solarbio。

1.2 小鼠分組及治療 144只SPF C57BL/6新生小鼠(7 d齡，體重15～20 g)購自北京Vital River動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2021-0006。將小鼠隨機分為6組：Control組、OIR組、SF5組、SF10組、SF20組和SF40組，每組24只。

Control組(生理鹽水)、OIR組(生理鹽水)、SF5組(SF 5 mg/kg/d)、SF10組(SF 10 mg/kg/d)、SF20組(SF 20 mg/kg/d)和SF40組(SF 40 mg/kg/d)小鼠暴露于(75±2)%的氧氣中5 d，然后恢復正常氧氣環(huán)境[10]。各組小鼠均在標準動物房飼養(yǎng)，環(huán)境相對安靜，自由飲水和攝取食物，保持室內(nèi)溫度(25±2)℃。之后，小鼠分別腹腔注射生理鹽水、SF 5、10、20、40 mg/kg/d，連續(xù)注射2周。

1.3 眼部實驗

1.3.1 血管閉塞面積分析 腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉各組小鼠6只，通過向左心室灌注FITC-葡聚糖，然后安樂死后摘除眼睛(用800 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射)，并在4℃下用4%多聚甲醛固定12 h。分離出視網(wǎng)膜，平裝在涂有甘油/明膠的載玻片上，用IX71熒光顯微鏡(日本Olympus)觀察并拍照。Image-Pro軟件對視網(wǎng)膜非灌注區(qū)域進行量化統(tǒng)計。

1.3.2 脈絡膜厚度測量 取出小鼠眼球，4 ℃ 4%多聚甲醛溶液固定24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋后通過SM2010R石蠟切片機(德國Leica)切成4 μm厚切片。進行HE染色后使用顯微鏡在眼球的整個圓周上拍攝橫截面。使用Image-J軟件從脈絡膜頂部(鞏膜/脈絡邊界)到底部(粉紅色玻璃體層)以5 μm的間隔在每張圖像中繪制60條垂直于脈絡膜的最短直線。確定每只眼睛的每個切片的平均直徑(μm)以獲得脈絡膜厚度。

1.3.3 TUNEL染色 小鼠視網(wǎng)膜組織用多聚甲醛(37 ℃，4%)固定8 min，解剖視杯，置于4%多聚甲醛溶液中30 min。然后，取出視杯并在梯度的蔗糖溶液(10%、20%、30%)中脫水。脫水完成后，將視杯置于OCT包埋劑中(無氣泡)，然后輕輕放入液氮中直至OCT固化。之后，用CM1950冷凍切片機(德國Leica)對視杯進行切片。取7 μm視神經(jīng)周圍的視網(wǎng)膜并粘附在載玻片上。將載玻片干燥30 min后，浸入含0.1% Triton X-100的0.1%檸檬酸鈉溶液中5 min。之后添加TUNEL溶液在37℃孵育1 h。洗滌和干燥后，用DAPI密封，最后通過IX71熒光顯微鏡(日本Olympus)觀察并捕獲圖像。

1.3.4 免疫組化染色 將石蠟切片置于二甲苯中15 min，用梯度乙醇脫蠟至水化。并用EDTA進行抗原修復。將切片置入3% H2O2中孵育25 min。使用5%牛血清白蛋白對視網(wǎng)膜切片封閉20 min。然后與一抗HIF-1α和VEGF在37℃共同孵育1 h。添加相應的二抗，孵育50 min。隨后使用DAB溶液直至完全染色，并用蘇木精復染后使用顯微鏡觀察，通過Imag J軟件計算積分光密度(Integrated optical density，IOD)的比值。

1.4 肺部實驗

1.4.1 肺組織干濕(wet/dry，W/D)比值測定 通過脊椎脫臼法處死小鼠，收集肺組織并分離左肺。用濾紙簡單處理后測量左肺的濕重。然后將左肺在60℃下干燥48 h，測量左肺的干重。計算W/D比值。

1.4.2 HE染色及病理觀察 采集的部分右肺直接用4%中性甲醛固定48 h，常規(guī)脫水、透明、包埋。將用石蠟包埋的組織切成5 μm厚的切片。切片用HE染色后，通過光學顯微鏡觀察肺組織的病理形態(tài)，并對肺組織損傷程度進行評分[11]。

1.4.3 Western blot 將部分右肺組織在RIPA緩沖液中勻漿并裂解，獲取蛋白質(zhì)。將蛋白質(zhì)電泳分離后移至PVDF膜上。添加5%脫脂牛奶封閉1.5 h。并與以下一抗HIF-1α、VEGF、TLR4、MyD88、NF-κB p65、TBP和β-actin孵育過夜。第2天使用二抗在室溫下放置1 h。通過ECL溶液可視化免疫反應條帶，并用Image J軟件進行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 SF對OIR小鼠視網(wǎng)膜新生血管(retinalneo-vascularization，RNV)的影響 圖1A、B結(jié)果顯示，Control組視網(wǎng)膜血管從視盤呈放射狀均勻分布。視網(wǎng)膜分為深淺兩層，兩層血管通過螺旋血管相互連接。OIR組視網(wǎng)膜內(nèi)可見大量血管增生和廣泛閉塞，存在大量無灌注區(qū)。SF5、SF10、SF20、SF40組可以觀察到視網(wǎng)膜血管從視盤呈放射狀分布；視網(wǎng)膜血管通過螺旋血管相互連接，深部血管呈多角網(wǎng)狀，淺部血管可見多條放射狀分支(見圖1C、D)。與Control組比較，OIR組視網(wǎng)膜閉塞面積增大，眼部脈絡膜厚度變薄(P<0.05)；與OIR組比較，SF5、SF10、SF20、SF40組視網(wǎng)膜閉塞面積減少，眼部脈絡膜厚度增厚，且具有劑量依賴性(P<0.05)。

A：用FITC-葡聚糖免疫標記的代表性視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)(×40)；B：HE染色下的脈絡膜代表性圖片(×40)；C：血管閉塞占視網(wǎng)膜總面積統(tǒng)計結(jié)果；D：眼部脈絡膜厚度統(tǒng)計結(jié)果。a:與Control組比較，P<0.05；b：與OIR組比較，P<0.05；c：與SF5組比較，P<0.05；d：與SF10組比較，P<0.05；e：與SF20組比較，P<0.05。

2.2 SF對OIR新生小鼠視網(wǎng)膜細胞凋亡的影響 圖2結(jié)果所示，與Control組比較，OIR組視網(wǎng)膜組織TUNEL陽性細胞數(shù)明顯增加(P<0.05)；與OIR組比較，SF5、SF10、SF20、SF40組視網(wǎng)膜組織TUNEL陽性細胞數(shù)顯著減少(P<0.05)；此外，TUNEL陽性細胞數(shù)且隨著SF濃度的增加而逐漸減少，具有濃度依賴性(P<0.05)。

A：TUNEL檢測細胞凋亡(×200)；B：TUNEL陽性細胞率統(tǒng)計結(jié)果；a：與Control組比較，P<0.05；b：與OIR組比較，P<0.05；c：與SF5組比較，P<0.05；d：與SF10組比較，P<0.05；e：與SF20組比較，P<0.05。

2.3 SF對OIR小鼠視網(wǎng)膜組織中HIF-1α和VEGF表達的影響 圖3結(jié)果顯示，與Control組相比，OIR組小鼠視網(wǎng)膜組織中HIF-1α和VEGF陽性表達明顯上調(diào)(P<0.05)。與OIR組相比，SF5、SF10、SF20、SF40組小鼠視網(wǎng)膜組織中HIF-1α和VEGF陽性表達明顯降低(P<0.05)；且HIF-1α和VEGF陽性表達隨著SF濃度的增加而逐漸降低，具有劑量依賴性(P<0.05)。

A：免疫組化分析HIF-1α和VEGF表達(×200)；B：HIF-1α和VEGF的IOD比值統(tǒng)計結(jié)果。a：與Control組比較，b：P<0.05；與OIR組比較，P<0.05；c：與SF5組比較，P<0.05；d：與SF10組比較，P<0.05；e：與SF20組比較，P<0.05。

2.4 SF對OIR小鼠肺組織損傷的影響 圖4A結(jié)果顯示，與Control組相比，OIR組小鼠肺組織W/D比值顯著增加(P<0.05)；與OIR組相比，SF5、SF10、SF20、SF40組小鼠肺組織W/D比值顯著降低(P<0.05)。此外，通過HE染色對肺組織的病理形態(tài)進行觀察，結(jié)果顯示(圖4B、C)Control組肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡清晰，無出血、水腫和炎性細胞浸潤；OIR組出現(xiàn)典型的組織病理學變化，如肺泡出血，肺泡間隔增寬水腫，大量炎性細胞浸潤；SF5、SF10、SF20、SF40組有效改善了肺組織的結(jié)構(gòu)，并減少了炎性細胞浸潤。具體表現(xiàn)為OIR組肺組織損傷評分明顯高于Control組(P<0.05)，而與OIR組相比，SF5、SF10、SF20、SF40組肺組織損傷評分均降低(P<0.05)；且肺組織損傷評分隨著SF濃度的增加而呈現(xiàn)劑量依賴性降低(P<0.05)。

A：小鼠肺組織W/D比值統(tǒng)計結(jié)果；B：肺組織損傷評分統(tǒng)計結(jié)果；C:HE染色分析小鼠肺組織病理形態(tài)(×200)。a：與Control組比較，P<0.05；b：與OIR組比較，P<0.05；c：與SF5組比較，P<0.05；d：與SF10組比較，P<0.05；e：與SF20組比較，P<0.05。

2.5 SF對OIR小鼠肺組織中血管生成以及TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響 圖5結(jié)果顯示，與Control組相比，OIR組小鼠肺組織中HIF-1α、VEGF、TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白水平上調(diào)(P<0.05)；與OIR組相比，SF5、SF10、SF20、SF40組小鼠肺組織中HIF-1α、VEGF、TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白水平均明顯下調(diào)(P<0.05)；此外，以上蛋白表達隨著SF濃度的增加而逐漸降低，呈現(xiàn)濃度依賴性(P<0.05)。

A：Western blot檢測HIF-1α、VEGF、TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白水平；B：HIF-1α、VEGF、TLR4、MyD88和NF-κB p65相對蛋白水平統(tǒng)計結(jié)果。a：與Control組比較，P<0.05；b：與OIR組比較，P<0.05；c：與SF5組比較，P<0.05；d：與SF10組比較，P<0.05；e：與SF20組比較，P<0.05。

3 討論

在這項研究中，發(fā)現(xiàn)生命早期氧療會引發(fā)病理，分別反映在新生小鼠的眼睛的ROP和BPD。不僅如此，本文還發(fā)現(xiàn)，與ROP發(fā)病機制相關的因素，如血管生成，在氧療的新生小鼠中也出現(xiàn)了的失調(diào)。以上這些表明氧療后的小鼠存在眼睛和肺組織的雙重損傷，為使用這種雙重疾病模型來尋找有效的治療途徑提供了機會。

ROP是兒童失明的首位原因，早期發(fā)現(xiàn)并及時治療可有效減少視力障礙[4]。研究顯示，ROP的典型發(fā)病機制包括兩個不同的階段：血管閉塞期，由于氧氣水平高于子宮內(nèi)的氧氣水平，在出生后立即開始；血管增生期，其標志是VEGF的過度產(chǎn)生，特別是視網(wǎng)膜缺氧的情況下。視網(wǎng)膜中低水平的抗氧化劑引發(fā)氧介導的脂質(zhì)過氧化，并釋放出活性一氧化氮；這反過來又會導致視網(wǎng)膜循環(huán)和血管完整性受損，從而導致血管增生。了解ROP的兩個階段對于確定適當?shù)闹委煵呗赃M而改善早產(chǎn)兒的視力至關重要[12]。據(jù)報道，視網(wǎng)膜的脈絡膜層在急性氧暴露后極易受到ROP長期退化的影響，這主要是由潛在的氧化應激造成的。研究顯示，在ROP退化的兒童中，脈絡膜厚度減少與視力差有關，這表明ROP是視力持久影響的一個重要因素[13]。已知，HIF-1α是VEGF的轉(zhuǎn)錄活化因子。一般認為HIF-1α和VEGF增加，導致內(nèi)皮細胞凋亡和遷移，進而產(chǎn)生RNV[14]。本研究結(jié)果顯示，OIR模型新生小鼠視網(wǎng)膜組織中存在大量血管增生和廣泛閉塞，細胞凋亡率也顯著升高；此外，HIF-1α和VEGF表達均增高。說明OIR模型構(gòu)建成功。而在SF干預治療后以上癥狀均得到很好的改善，且隨著SF濃度的升高，其改善效果越好。以上數(shù)據(jù)表明SF可能通過降低HIF-1α、VEGF表達和細胞凋亡率改善OIR小鼠血管生成，進而保護OIR小鼠免受視力損傷。

在肺發(fā)育的最終肺泡化階段，也就是在實驗模型中受影響的階段，肺泡氣壁變薄與微血管成熟一起發(fā)生。高氧引起的新生兒肺中主要結(jié)構(gòu)異常是肺泡間隔壁增厚，這與肺泡毛細血管發(fā)育中斷有關，是人類BPD的一個關鍵特征[15]。在人BPD組織樣本中，觀察到肺組織結(jié)構(gòu)異常與VEGF表達降低有關。這一發(fā)現(xiàn)有力地證明VEGF的變化有助于BPD中觀察肺血管的損傷情況[16]。事實上，肺泡化過程是錯綜復雜的，其中諸如VEGF等眾多因素對于原始肺泡小泡向功能性呼吸肺泡的轉(zhuǎn)變至關重要[17]。在視網(wǎng)膜發(fā)育中，VEGF可以說是介導血管生成的最關鍵因素，并且對氧張力的波動高度敏感。氧濃度的變化導致VEGF失調(diào)，引發(fā)與ROP相關的中央和外圍區(qū)域的病理重塑[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，OIR模型小鼠肺組織出現(xiàn)明顯病理和炎癥損傷，且HIF-1α和VEGF表達升高；使用SF治療后，這種現(xiàn)象得到很好的改善，且其改善效果隨著SF濃度的升高而越來越好，表明SF可呈劑量依賴性改善OIR小鼠肺損傷和血管生成。另外，TLR在宿主防御系統(tǒng)中充當重要的模式識別受體，識別由非感染性刺激釋放的損傷相關分子模式[19]。TLR4通過MyD88依賴性途徑激活下游級聯(lián)炎癥信號。其中，NF-κB轉(zhuǎn)錄因子是一種典型的促炎信號因子，長期以來一直被認為是TLR4/MyD88的下游轉(zhuǎn)導因子[20]。本研究結(jié)果顯示，OIR模型小鼠中TLR4/NF-κB通路被激活。而使用SF治療后，TLR4/NF-κB通路被明顯抑制，表明SF可能通過抑制TLR4/NF-κB通路減輕炎癥，保護OIR小鼠免受肺損傷。

本研究成功開發(fā)同時存在ROP和BPD模型，并且證實了SF可通過抑制視網(wǎng)膜細胞凋亡、修復ROP中受損的視網(wǎng)膜血管和改善肺損傷，而有效地改善這兩類新生兒疾病，此過程可能與抑制TLR4/NF-κB通路激活有關。ROP和BPD中血管失調(diào)以及炎癥損傷的相似性表明，這兩種疾病在機制上是相關的，針對共同疾病途徑的治療策略可以能同時治療這兩種疾病。然而，本研究并未對SF影響ROP的作用機制進行深入探究；此外，其他的早產(chǎn)并發(fā)癥：如壞死性小腸結(jié)腸炎、腦室內(nèi)出血等是否與ROP和BPD具有相同的作用機制[21]。后續(xù)仍需更好的探究以為SF早期應用于臨床治療提供幫助。