王小文，程曉菊，李廷超，田 敏，劉代順

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 急診科，貴州 遵義 563000；2.遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563000；3.遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 病理科，貴州 遵義 563000；4.遵義醫(yī)科大學(xué) 珠海校區(qū)，廣東 珠海 519041)

在我國(guó)，肺癌在惡性腫瘤中的發(fā)病率和死亡率均為第一位，發(fā)病率為81.6/1萬(wàn)，死亡率為71.5/1萬(wàn)，且呈現(xiàn)逐年增高的趨勢(shì)[1]。非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)以80%的高占比成為了肺癌的主要類型[2]。迄今，肺癌的主要治療策略有手術(shù)切除、放療、化療以及免疫治療[3-4]，盡管近年來(lái)其主要治療方式在不斷改進(jìn)，肺癌患者的5年生存率有所上升，但仍然僅為18%[5]。由于在腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中，存在分子信號(hào)通路的多樣性[2,6]，成為了目前癌癥治療的難點(diǎn)及瓶頸，因此，對(duì)肺癌演變過(guò)程中的核心樞紐分子的鑒定，以實(shí)施精準(zhǔn)分子靶向治療改善肺癌患者預(yù)后具有十分重要的臨床價(jià)值。

酪氨酸3單加氧酶/色氨酸5單加氧酶激活蛋白zeta(也稱YWHAZ或14-3-3ζ)，屬于14-3-3蛋白家族，位于人類8號(hào)染色體上，由YWHAZ miRNA編碼的一種蛋白質(zhì)，大小28～30 kDa，是腫瘤發(fā)展進(jìn)程中參與調(diào)控多條分子信號(hào)通路的核心蛋白[7]。研究表明，YWHAZ是許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的中樞蛋白，與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、粘附和自噬等相關(guān)蛋白相互作用[8]。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)的方法，首先在多種癌癥類型中檢測(cè)YWHAZ的表達(dá)水平，然后重點(diǎn)在非小細(xì)胞肺癌及其癌旁組織中檢測(cè)YWHAZ的表達(dá)水平。我們還分析了非小細(xì)胞肺癌中YWHAZ的表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)聯(lián)。本研究旨在提高YWHAZ在非小細(xì)胞肺癌的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估中的臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本 收集2018年1月至2020年8月遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院收治后經(jīng)手術(shù)切除的137例多種類型癌癥組織。其中非小細(xì)胞肺癌38例，均經(jīng)過(guò)病理學(xué)檢查確診為NSCLC。在38例非小細(xì)胞肺癌中，男18例，女20例；肺腺癌31例，肺鱗癌7例；年齡43～86歲，中位年齡59.5歲；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期19例，Ⅲ～Ⅳ期19例；有明確淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移17例，病理學(xué)活檢對(duì)所有轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)及轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細(xì)胞來(lái)源進(jìn)行判斷。所有標(biāo)本在收集前其患者暫未接受放療及化療。本研究通過(guò)遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，編號(hào)：倫審(2020)-70號(hào)。

1.2 臨床組織芯片 所使用的組織芯片購(gòu)自武漢愛(ài)威爾生物科技有限責(zé)任公司，芯片編號(hào)為L(zhǎng)AC1402，點(diǎn)直徑為1.5mm，該芯片包含35例非小細(xì)胞肺癌組織和35例配對(duì)的癌旁肺組織，以及患者的臨床病理資料，包括患者年齡、性別、分化程度、腫瘤大小、TNM分期等。

1.3 免疫組織化學(xué)染色試劑 兔抗人YWHAZ抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；山羊抗兔IgG、10%正常羊血清、蘇木精、抗原修復(fù)液及顯色試劑均購(gòu)自上海基因科技有限公司；3%過(guò)氧化氫、無(wú)水乙醇、二甲苯均購(gòu)自南昌雨露公司；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)按說(shuō)明書(shū)自行配制。

1.4 免疫組織化學(xué) 二甲苯對(duì)組織切片脫蠟、過(guò)梯度酒精后PBS洗滌，內(nèi)源性過(guò)氧化物酶被3%過(guò)氧化氫封閉，抗原修復(fù)液在高溫及高壓條件下修復(fù)抗原3 min，自然冷卻至室溫，用10%正常羊血清室溫進(jìn)行封閉，半小時(shí)后用YWHAZ抗體在室溫孵育3 h，PBS洗滌3次，用山羊抗兔IgG在37 ℃恒溫箱中孵育0.5 h，PBS洗滌3次，用 DAB顯色劑進(jìn)行顯示處理，復(fù)染用蘇木精，再經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明，用中性樹(shù)脂進(jìn)行封片，在顯微鏡下觀察染色結(jié)果。YWHAZ的染色評(píng)估，采用Image-Pro Puls軟件對(duì)染色效果統(tǒng)計(jì)評(píng)分，根據(jù)細(xì)胞的染色范圍(<5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分)和染色的強(qiáng)度(陰性為0分；弱陽(yáng)性為1分；中等陽(yáng)性為2分；強(qiáng)陽(yáng)性為3分)評(píng)分，最終分?jǐn)?shù)為染色范圍分?jǐn)?shù)乘以染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)。病例被分為低表達(dá)組(0～6分)和高表達(dá)組(6分以上)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間差異比較采用χ2檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 YWHAZ在多種腫瘤中的表達(dá) 為了評(píng)估YWHAZ在腫瘤中的表達(dá)情況，本研究對(duì)137例多種癌癥類型的臨床標(biāo)本進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示，YWHAZ在每種癌癥中均有表達(dá)，主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞膜(見(jiàn)圖1)。我們分析了其總體陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)到94.2%(129/137)，其中，肺癌的陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)96.4%(27/28),甲狀腺癌陽(yáng)性表達(dá)率為100%(28/28)，乳腺癌陽(yáng)性表達(dá)率為100%(18/18)，胃癌陽(yáng)性表達(dá)率為100%(6/6)，結(jié)、直腸癌陽(yáng)性表達(dá)率為92.8%(13/14)，肝癌陽(yáng)性表達(dá)率為100%(3/3)，泌尿系統(tǒng)癌陽(yáng)性表達(dá)率為100%(4/4)，女性生殖系統(tǒng)癌陽(yáng)性表達(dá)率為87.5%(14/16)，淋巴瘤陽(yáng)性表達(dá)率為66.7%(6/9)，其他類型癌陽(yáng)性表達(dá)率為90.9%(10/11)，見(jiàn)表1、圖1。

表1 YWHAZ在多種類型癌癥中的表達(dá)率

2.2 YWHAZ在非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁肺組織中的表達(dá) 將收集的73例非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本(38例術(shù)中標(biāo)本及35例組織芯片標(biāo)本)和36例癌旁肺組織標(biāo)本，其中肺腺癌50例，肺鱗癌23例，用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了其中YWHAZ的表達(dá)。結(jié)果顯示，YWHAZ主要表達(dá)于非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜，呈狀棕黃色或棕褐色區(qū)，與癌旁肺組織相比，在肺腺癌組織及肺鱗癌組織中都觀察到Y(jié)WHAZ的表達(dá)水平增加(見(jiàn)圖2)。在肺腺癌組織中，YWHAZ高表達(dá)率54%(27/50)，在肺鱗癌組織中，YWHAZ高表達(dá)率78.2%(18/23)，在癌旁肺組織中高表達(dá)率16.7%(6/36)，肺腺癌和肺鱗癌的高表達(dá)率均高于癌旁肺組織(P<0.001，見(jiàn)表2)。

表2 YWHAZ在非小細(xì)胞肺癌及其癌旁組織中的表達(dá)

A:肺鱗癌癌旁組織；B:肺腺癌癌旁組織；C:肺鱗癌低表達(dá)；D:肺腺癌低表達(dá)；E:肺鱗癌高表達(dá)；F:肺腺癌高表達(dá)；×400。

2.3 YWHAZ的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征之間的差異 為了評(píng)價(jià)YWHAZ在非小細(xì)胞肺癌病例中的臨床意義，將73例非小細(xì)胞肺癌組織中YWHAZ的高低表達(dá)與患者的臨床病理特征之間的差異采用χ2檢驗(yàn)分析(見(jiàn)表3)。73例非小細(xì)胞肺癌患者，腫瘤長(zhǎng)徑的中位數(shù)為4 cm。本實(shí)驗(yàn)觀察到Y(jié)WHAZ的高表達(dá)與患者的腫瘤大小(P=0.001)、臨床分期(P<0.001)以及轉(zhuǎn)移(P<0.001)之間的差異有顯著性，與患者的年齡、性別、吸煙史均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

3 討論

2021年全球高發(fā)病率的癌癥中，包含了結(jié)直腸癌、肺癌、淋巴瘤、甲狀腺癌、膀胱癌、腎癌、宮頸癌、肝癌、乳腺癌[9]。目前對(duì)高發(fā)癌癥類型的靶向基因研究是當(dāng)下腫瘤研究的熱點(diǎn)。本研究收集的137例臨床組織標(biāo)本包含了這十類高發(fā)癌癥類型，通過(guò)免疫組織化學(xué)染色分析，我們發(fā)現(xiàn)，YWHAZ在多種癌癥中均呈陽(yáng)性表達(dá)，且平均陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)94.2%。已有研究表明，YWHAZ的表達(dá)水平在肝細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌等多種癌癥中均顯著上調(diào)，參與腫瘤細(xì)胞的多種細(xì)胞活動(dòng)[10-13]，我們的研究結(jié)果與上述研究一致，提示把YWHAZ作為人類癌癥診斷的靶點(diǎn)分子可能具有潛在臨床意義。我們還發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是在男性或女性中都高發(fā)的肺癌，YWHAZ的陽(yáng)性染色率高達(dá)96.4%，高于94.2%的平均水平,表明YWHAZ在肺癌中可能更具研究?jī)r(jià)值。

YWHAZ已被證明在多種癌癥中經(jīng)常被上調(diào)并通過(guò)調(diào)節(jié)癌癥中的多種信號(hào)通路發(fā)揮致癌基因的作用[7]。在肺癌中，有研究發(fā)現(xiàn)，與30個(gè)非肺癌組織相比，在152個(gè)NSCLC組織中，YWHAZ的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高[14]。YWHAZ在高侵襲性肺癌細(xì)胞株中的mRNA和蛋白表達(dá)均高于低侵襲性肺癌細(xì)胞株[15]。此外，YWHAZ在肺癌的發(fā)展進(jìn)程中可能參與了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程[16]。在我們的研究中，通過(guò)免疫組織化學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌組織中YWHAZ的陽(yáng)性表達(dá)水平明顯高于癌旁肺組織，與先前研究結(jié)果一致，已有的研究結(jié)果表明YWHAZ可能是非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展中關(guān)鍵的核心樞紐分子。另外，在分別對(duì)癌旁肺組織、肺腺癌和肺鱗癌中YWHAZ高低表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)中，肺腺癌與肺鱗癌的YWHAZ表達(dá)顯著高于癌旁肺組織。

細(xì)胞的增殖失控、抗凋亡和轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是腫瘤的惡性生物學(xué)行為，是影響患者預(yù)后的重要因素。已有研究發(fā)現(xiàn)，YWHAZ的過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[13]。在另一項(xiàng)研究中，YWHAZ通過(guò)結(jié)合 Par3 可促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和轉(zhuǎn)移[17]。在乳腺癌中，YWHAZ敲除可誘導(dǎo)MCF-37細(xì)胞的凋亡[18]。這些研究表明，YWHAZ在腫瘤中起著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮惡性生物學(xué)行為的重要作用。本實(shí)驗(yàn)的73例非小細(xì)胞肺癌病例中，腫瘤直徑≥4cm患者的YWHAZ高表達(dá)率顯著高于腫瘤直徑<4cm的患者，腫瘤臨床分期為晚期患者的YWHAZ高表達(dá)率顯著高于腫瘤臨床分期為早期的患者，發(fā)生轉(zhuǎn)移患者的YWHAZ高表達(dá)率顯著高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者。提示YWHAZ的高表達(dá)增強(qiáng)了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、抗凋亡以及轉(zhuǎn)移能力。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，YWHAZ的表達(dá)增加可能普遍存在于多種腫瘤的發(fā)生過(guò)程中。YWHAZ在肺腺癌及肺鱗癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用，可為肺腺癌及肺鱗癌的臨床靶向治療提供新的思路。