汪 茗，席廣民，苑輝卿

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室；2.活性大分子省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241002；3.山東大學(xué)第二醫(yī)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，山東 濟(jì)南 250014)

慢性粒細(xì)胞白血病又稱慢性髓系白血病(Chronic myelogenous leukemia，CML)是一種發(fā)生在多能造血干細(xì)胞的惡性腫瘤，主要表現(xiàn)為外周血白細(xì)胞異常升高以及大量未成熟粒細(xì)胞的聚集[1]。目前臨床上的主要治療方式有：傳統(tǒng)化療藥物(白消安、羥基脲、干擾素α等)以及分子靶向藥物(酪氨酸激酶抑制劑),造血干細(xì)胞移植等。因現(xiàn)有的化療藥物在有效劑量下毒性較大或出現(xiàn)耐藥，因此尋找低毒高效的天然藥物顯得尤為迫切。

苔蘚植物作為從水生到陸生過渡的一類高等植物，其化學(xué)成分多樣，是篩選藥效活性分子的寶貴資源。聯(lián)芐類化合物作為苔蘚植物的有效成分之一，其結(jié)構(gòu)獨(dú)特，類型繁多，具有抗菌、抗病毒等多種生物學(xué)活性[2]，但其抗腫瘤活性研究尚處于初級(jí)階段。之前本實(shí)驗(yàn)室通過對(duì)多種聯(lián)芐類化合物進(jìn)行抗腫瘤活性篩選，發(fā)現(xiàn)雙聯(lián)芐化合物地錢素C(Marchantin C，MC)對(duì)某些實(shí)體腫瘤具有較好的抗腫瘤活性，并能誘導(dǎo)其凋亡[3-4]。本研究擬探討MC對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞的增殖抑制作用，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 MC由山東大學(xué)藥學(xué)院天然藥物研究所提供，純度大于99%。人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562由本實(shí)驗(yàn)室保存。Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自BD公司；Caspase-3、PARP、Akt 、p-Akt、mTOR、p-mTOR、p70S6K、p- p70S6K抗體購自CST公司；ECL發(fā)光試劑盒購自Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 白血病K562細(xì)胞采用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),在37 ℃ 、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到50%～70%。加藥前1 d更換為含有1% 血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 加入3、6、12 μmol/L MC后24 h熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.2.3 MTT實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，濃度為1×105/mL，接種于96孔板。加入3、6、12 μmol/L MC分別作用24、48、72 h，加入MTT(5 mg/L)10 μL,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，離心棄上清，加DMSO 100 μL，震蕩后使用酶標(biāo)儀在570 nm波長下測定吸光度值A(chǔ)，并按照以下公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(A對(duì)照-A實(shí)驗(yàn))/A對(duì)照×100%。

1.2.4 DAPI染色 4%多聚甲醛固定細(xì)胞，10 min后PBS洗滌去除固定劑。加入少量DAPI染色液，覆蓋住樣品混勻。 室溫避光孵育20 min，吸除DAPI染色液，用PBS洗滌2～3次，每次3～5 min，洗掉未結(jié)合的DAPI。采用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞(濾光片的激發(fā)波長為360 nm，發(fā)射波長為460 nm)。

1.2.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 3、6、12 μmol/L MC作用24 h后，收集細(xì)胞，冷PBS洗2遍，1×binding Buffer 100μL重懸細(xì)胞，加入Annexin V或PI各5 μL，暗處孵育30 min后加入300μL 1×binding Buffer，轉(zhuǎn)移至流式管，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 細(xì)胞周期 測定 3、6、12 μmol/L MC作用24 h后，收集細(xì)胞，冷PBS洗2遍，經(jīng)70%冷乙醇固定24 h，PI染色后上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化。

1.2.7 Western-blotting實(shí)驗(yàn) 收集總蛋白，按100 μg/well上樣。10% SDS- PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜上。采用5%脫脂牛奶封閉約1 h，加入一抗4 ℃孵育過夜。次日將一抗回收后采用TBST洗膜。加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育約45 min，同法洗膜。將膜置于暗匣中，經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光后，暗室內(nèi)膠片曝光，沖洗膠片。

2 結(jié)果

2.1 MC抑制K562細(xì)胞的增殖 首先分析MC對(duì)細(xì)胞表型的影響，采用熒光倒置顯微鏡觀察MC作用24 h后K562細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯的形態(tài)學(xué)變化(見圖1A)。圖1B中可見對(duì)照組細(xì)胞大小均一，形態(tài)規(guī)則，而MC處理組細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的分裂受阻、形態(tài)不規(guī)則、細(xì)胞皺縮、核破碎、核溶解等改變，以12 μmol/L組最為明顯。

細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，MC 3、6、12 μmol/L組細(xì)胞的作用24、48、72 h后，增殖抑制率均高于對(duì)照組(P<0.01,n=3)。其中12 μmol/L 組72 h的增殖抑制率可達(dá)(79.71±0.27)%，見圖1C。

A：MC的結(jié)構(gòu)式；B：MC引起的形態(tài)學(xué)變化；C:MC對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用,**：與對(duì)照組比較，P<0.01。

2.2 MC誘導(dǎo)K562細(xì)胞的凋亡 由于MC處理細(xì)胞后出現(xiàn)皺縮等現(xiàn)象，提示MC可能具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。本研究采用DAPI染色后分析細(xì)胞凋亡特征。熒光倒置顯微鏡下紫外光激發(fā)觀察K562細(xì)胞核的變化，對(duì)照組細(xì)胞核染色質(zhì)均一，而藥物處理組均出現(xiàn)不同程度的染色質(zhì)凝集、向周邊聚集、凝集成球形、出現(xiàn)核碎裂等細(xì)胞凋亡征象，以12 μmol/L組最為顯著(見圖2A)。

采用流式細(xì)胞術(shù)(Annexin V/PI 雙染法)檢測MC處理后細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果如圖2B所示。不同劑量MC( 3、6、12 μmol/L)作用24 h后， 細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡終末效應(yīng)子caspase-3的剪切形式隨MC濃度的升高，表達(dá)發(fā)生變化。且凋亡標(biāo)志物PARP(poly ADP- ribose polymerase,多聚ADP-核糖聚合酶)的活性剪切帶隨MC濃度的升高逐漸增加(見圖2C)。

2.3 MC對(duì)K562細(xì)胞周期的影響 由于MC具有抑制細(xì)胞增殖的作用，本研究采用流式細(xì)胞儀檢測MC對(duì)細(xì)胞周期的影響。圖3結(jié)果顯示，MC作用K562細(xì)胞后G2/M期細(xì)胞所占的比例有所增加，以12μmol/L組最為明顯。提示MC可引起K562細(xì)胞阻滯在G2/M期。

2.4 MC對(duì)K562細(xì)胞凋亡相關(guān)通路蛋白表達(dá)的影響 由于Akt是細(xì)胞存活、凋亡的關(guān)鍵信號(hào)分子，本研究進(jìn)一步分析MC對(duì)Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白的影響。結(jié)果顯示MC抑制Akt/mTOR信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的活化，表現(xiàn)為磷酸化形式的p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K表達(dá)隨MC濃度的升高逐步降低。而總蛋白形式的Akt、mTOR、p70S6K蛋白的表達(dá)卻未出現(xiàn)明顯變化(見圖4)。

**：與對(duì)照組比較，P<0.01 。

3 討論

慢性粒細(xì)胞白血病(Chronic myelogenous leukemia，CML)是一種較為常見的血液系統(tǒng)惡性疾病。95%以上的CML患者含有特征性Ph染色體?；颊?號(hào)染色體和22號(hào)染色體發(fā)生易位，形成BCR-ABL融合基因，主要編碼P210蛋白[1]。P210具有酪氨酸激酶活性，可激活下游一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包括Ras/Raf/MEK/ERK，PI3K/AKT，NF-кB ，JAK-STAT等，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，產(chǎn)生CML[5-7]。CML作為比較常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，因高度增生和惡性侵襲的特性使其成為臨床防治上的難點(diǎn)。目前所用的抗白血病藥物在殺傷白血病細(xì)胞的同時(shí)，也殺傷正常骨髓中造血干(祖)細(xì)胞，導(dǎo)致骨髓抑制、粒細(xì)胞缺乏從而發(fā)生各種嚴(yán)重感染，還有很容易產(chǎn)生耐藥并導(dǎo)致化療無效。因此，尋找新的治療方法以及高效低毒的抗白血病藥物對(duì)CML的治療具有重要意義。

苔蘚植物在全世界有23 000多種。隨著對(duì)苔蘚植物研究的逐步深入，從苔蘚植物中分離獲得了大量結(jié)構(gòu)新穎且活性顯著的萜類化合物和芳香族化合物，特別是地錢屬(Marchantia)植物富含聯(lián)芐及雙聯(lián)芐化合物。藥理活性實(shí)驗(yàn)表明，許多雙聯(lián)芐化合物具有抗真菌、抗微生物、細(xì)胞毒等生物學(xué)活性，被認(rèn)為是新型的植物抗生素[8]。雙聯(lián)芐化合物MC是從眾多雙聯(lián)芐化合物中篩選出的、具有較好抗腫瘤活性的化合物，已有文獻(xiàn)報(bào)道MC具有抗腫瘤作用[9]，但其對(duì)血液系統(tǒng)腫瘤是否有類似的效應(yīng)卻并不清楚。

本研究的細(xì)胞形態(tài)學(xué)、MTT及細(xì)胞周期的結(jié)果提示，當(dāng)加入一定濃度的MC作用一段時(shí)間之后，白血病K562細(xì)胞的分裂就會(huì)受阻，細(xì)胞阻滯在G2/M期，增殖受到抑制，而且這種抑制效應(yīng)與MC的劑量和作用時(shí)間有關(guān)。這說明一定濃度范圍內(nèi)MC可有效抑制白血病K562細(xì)胞的分裂，具有較好的增殖抑制作用。DAPI染色、流式細(xì)胞術(shù)及Western blotting的檢測結(jié)果提示，在MC作用K562細(xì)胞的過程中存在細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，且細(xì)胞凋亡程度與MC的濃度有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)MC的抗白血病活性及凋亡誘導(dǎo)作用，與MC抑制實(shí)體瘤增殖的結(jié)果類似。

Akt/mTOR信號(hào)通路是關(guān)鍵性的細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)通路之一，很多CML患者存在Akt/mTOR信號(hào)通路的持續(xù)活化，該信號(hào)通路異常活化可促進(jìn)CML細(xì)胞周期進(jìn)程、侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制CML細(xì)胞凋亡，促進(jìn)新生血管形成等，與CML的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在Akt/mTOR信號(hào)通路中，Akt又稱PKB(Protein kinase B)，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是信號(hào)通路的核心分子。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin，mTOR) 作為Akt的下游分子之一，是一種不典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可以整合多種因素激發(fā)的信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的增殖以及細(xì)胞周期。mTOR一般通過調(diào)控其下游與翻譯等相關(guān)多種蛋白的磷酸化來發(fā)揮其生物學(xué)功能，在細(xì)胞的生長、增殖過程中起中心調(diào)節(jié)作用。激活后的mTOR可磷酸化下游的兩種主要靶蛋白，p70核糖體S6蛋白激酶(p70S6 kinase，p70S6K)和真核細(xì)胞始動(dòng)因子4E結(jié)合蛋白1(4E binding protein 1，4EBP1)，它們都是翻譯調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子。其中p70S6K可使p70核糖體S6蛋白磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)某些蛋白 mRNA的翻譯，促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖[10-13]。

本研究結(jié)果提示，當(dāng)加入一定濃度MC后，Akt/mTOR信號(hào)通路中，活性形式的p-Akt、p-mTOR及p- p70S6K蛋白表達(dá)均下調(diào)，且下調(diào)程度與MC劑量有關(guān)。這說明加入MC后K 562細(xì)胞的Akt/mTOR通路中各效應(yīng)分子的活化均受到抑制，提示MC可能是通過抑制凋亡相關(guān)的Akt/ mTOR通路的活化來抑制K562細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡。

綜上所述，我們認(rèn)為MC可以有效抑制白血病K562細(xì)胞的增殖，能誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，作用機(jī)制與Akt/mTOR通路受抑有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為MC將來作為新的抗慢性粒細(xì)胞白血病藥物應(yīng)用于臨床治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。