葉立果，綦仰之，陳謙學(xué)，田道鋒

武漢大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)外科，湖北武漢 430060

腦膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)腫瘤，患者的中位生存期主要取決于腫瘤的組織學(xué)分級[1]。目前，手術(shù)切除仍是膠質(zhì)瘤的主要治療手段，此外，放療聯(lián)合替莫唑胺化療為一線輔助治療策略，可將患者的生存時間延長2.5個月[2]，但患者獲得性耐藥和放化療抵抗的風(fēng)險較高[3]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，免疫治療已成為膠質(zhì)瘤治療的一個快速發(fā)展的領(lǐng)域[4-5]，尤其是針對細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA4)、程序性死亡受體1(programmed cell death 1，PD-1)和細(xì)胞程序性死亡配體1(programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1)的免疫檢查點阻斷療法的成功，使腫瘤免疫治療取得了突破性進(jìn)展[6-8]。作為腫瘤免疫治療的重要組成部分，治療性腫瘤疫苗被證實對多種實體癌有效，并引起了廣泛關(guān)注[9]。2015年Kübler等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，CV9103(一種mRNA腫瘤疫苗)可在大部分前列腺癌患者中保持良好的免疫原性和耐受性，增強(qiáng)患者的免疫應(yīng)答，最終延長患者的總生存時間；2016年Hong等[11]發(fā)現(xiàn)，RNActive?疫苗CV9201可提高或延長部分非小細(xì)胞肺癌患者的特異性免疫應(yīng)答率及生存時間。以上研究結(jié)果表明，采用mRNA腫瘤疫苗治療實體癌是一種可行且具有巨大潛力的治療策略。本文對新抗原mRNA腫瘤疫苗在腦膠質(zhì)瘤治療中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 新抗原

在腫瘤癌變的過程中，遺傳不穩(wěn)定性引起的基因突變通常發(fā)生在非編碼區(qū)和編碼區(qū)，其中編碼區(qū)DNA的變化包括非同義突變或單核苷酸變異[12]、突變框架(插入/刪除)[13]、基因融合[14]、改變氨基酸序列的翻譯后修飾[15]及內(nèi)含子保留[16]等，這些DNA變化引起的氨基酸序列改變可產(chǎn)生正常細(xì)胞中沒有的短肽(2～20個氨基酸殘基)，這些短肽被稱為新抗原(neo-antigen)。其中一些短肽被運送到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，裝載到主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ(major histocompatibility complex class Ⅰ，MHC-Ⅰ)上[17]，這些載有多肽的MHC-Ⅰ分子通過高爾基體進(jìn)入細(xì)胞膜，從而引起抗原呈現(xiàn)，并被CD8+T細(xì)胞上的受體識別，細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)因此被激活并發(fā)揮腫瘤殺傷作用[18-21]。

腫瘤免疫治療通過刺激和加強(qiáng)人體的抗腫瘤免疫反應(yīng)來消滅癌細(xì)胞[22]。腫瘤相關(guān)抗原(tumorassociated antigen，TAA)[23]是一種由未突變基因表達(dá)的蛋白質(zhì)，在腫瘤細(xì)胞中顯著高表達(dá)，但在正常細(xì)胞中卻很少表達(dá)[24]，免疫細(xì)胞可識別這些過表達(dá)的蛋白，并激活免疫系統(tǒng)，從而起到殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。但由于TAA是正常的宿主蛋白，同時受到中樞和外周免疫耐受機(jī)制的影響[18]，靶向TAA也可能導(dǎo)致自身免疫毒性[25]。相反，新抗原是腫瘤特異性抗原，包括整合到基因組中的腫瘤病毒產(chǎn)生的抗原和突變蛋白產(chǎn)生的抗原，這些抗原只在腫瘤細(xì)胞中大量表達(dá)，而不在正常細(xì)胞中表達(dá)，具有很強(qiáng)的免疫原性和異質(zhì)性，且不受中樞耐受的影響[14,26]。此外，靶向新抗原不易誘導(dǎo)自身免疫[25]。因此，新抗原是治療性腫瘤疫苗和基于T細(xì)胞的免疫治療的理想靶點。利用新抗原的免疫活性，根據(jù)腫瘤細(xì)胞的突變情況可設(shè)計合成新抗原藥物，激活免疫系統(tǒng)，從而達(dá)到抗腫瘤的目的。

異檸檬酸脫氫酶1型(isocitrate dehydrogenase type 1，IDH1)是膠質(zhì)瘤中的特異性分子標(biāo)志物[27]，彌漫性2級和3級膠質(zhì)瘤中發(fā)生的最常見的突變?yōu)镽132H型IDH1突變[27-28]。IDH1(R132H)被認(rèn)為是世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)2級和3級彌漫性星形膠質(zhì)瘤中潛在的特異性新抗原，可被免疫系統(tǒng)特異性識別，并誘導(dǎo)突變特異性CD4+T輔助細(xì)胞-1(CD4+T-helper 1，Th1)反應(yīng)[29]。Platten等[30]的多中心臨床試驗發(fā)現(xiàn)，接種IDH1(R132H)肽類疫苗可明顯激活WHO 3、4級膠質(zhì)瘤患者(與對照組比較)的T細(xì)胞抗腫瘤反應(yīng)，最終改善預(yù)后。

2 新抗原的識別及預(yù)測

新抗原是高度個體特異性的，通常不涉及已知的癌基因[20]。識別新抗原對mRNA腫瘤疫苗的制備至關(guān)重要。測序深度、腫瘤組織的質(zhì)量、測序材料的來源、單核苷酸變異的算法及其他因素都可能影響新抗原的鑒定[31-32]。新抗原識別的第一步通常是使用高通量測序技術(shù)對腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的DNA序列進(jìn)行快速比較。但由于腫瘤細(xì)胞的突變比較復(fù)雜，包括非編碼突變和無義突變，篩選出能表達(dá)突變蛋白的DNA突變序列具有一定的難度[33]。隨著測序技術(shù)和生物信息學(xué)算法的發(fā)展，新抗原預(yù)測及識別的準(zhǔn)確性和可靠性有所提高，全外顯子測序技術(shù)具有識別效率高、覆蓋面廣、假陰性率低等優(yōu)點[34]，目前大多數(shù)新抗原是通過全外顯子測序技術(shù)鑒定的。

突變能否形成新抗原取決于以下因素：(1)突變序列能否轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)；(2)突變蛋白能否加工成肽并被抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)所識別；(3)突變肽與患者M(jìn)HC分子的親和力；(4)突變肽-MHC復(fù)合物與T細(xì)胞受體的親和力[35]。因此，新抗原的預(yù)測不僅需要識別可表達(dá)的基因組突變，還需要關(guān)注患者腫瘤MHC類型相關(guān)的分子信息。

3 新抗原mRNA腫瘤疫苗的優(yōu)勢

與普通的預(yù)防性疫苗不同，腫瘤疫苗是用于惡性腫瘤患者并輔以適當(dāng)?shù)淖魟?，以激活患者的自身免疫反?yīng)并殺死腫瘤細(xì)胞[36]。腫瘤細(xì)胞的基因突變改變了蛋白質(zhì)的氨基酸序列，這些氨基酸序列隨后被翻譯并加工成為新抗原(一種短肽)。作為非自身抗原，新抗原接觸到MHC分子，隨后觸發(fā)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)[20]。腫瘤疫苗的治療效果通常取決于腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之間靶抗原表達(dá)的差異。新抗原作為外源抗原，不僅能增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)，而且能降低自身免疫的風(fēng)險[37]。Schumacher等[29]觀察到，IDH1單等位基因點突變的積累在彌漫性星形細(xì)胞瘤的發(fā)展過程中是一個早期和決定性的事件，可導(dǎo)致致癌代謝物2-羥基戊二酸的產(chǎn)生，使細(xì)胞內(nèi)遺傳不穩(wěn)定性增加，基因組高甲基化，以及蛋白突變，最終引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。該研究將IDH1突變產(chǎn)生的短肽作為新抗原用于小鼠腫瘤疫苗接種，觸發(fā)了小鼠體內(nèi)有效的MHC-Ⅱ型抗腫瘤免疫應(yīng)答反應(yīng)[29]。

由于測序技術(shù)的快速發(fā)展和生物信息學(xué)算法的不斷優(yōu)化，目前研究者能夠準(zhǔn)確地識別新抗原，并預(yù)測其MHC親和力及免疫原性，從而開發(fā)出個體化的治療策略。目前，研究者設(shè)計了多種形式的腫瘤疫苗，包括腫瘤細(xì)胞疫苗[38]、長肽疫苗或蛋白疫苗[39-40]、基因組疫苗(以mRNA或DNA為主)[41]和樹突狀細(xì)胞疫苗[42]等。與其他類型疫苗相比，mRNA腫瘤疫苗應(yīng)用于臨床治療具有明顯優(yōu)勢：(1)mRNA序列很容易修改，以編碼需要的蛋白質(zhì)[43]；(2)傳統(tǒng)的肽疫苗需要對腫瘤進(jìn)行全基因組分析，成本較高，而mRNA疫苗則不需要[44]；(3)為了確保安全性，mRNA的半衰期可通過RNA序列修飾或傳遞系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)[45]；(4)mRNA可防止基因缺失和插入突變，DNA類型的抗原經(jīng)常發(fā)生不相關(guān)序列排除和基因整合，而mRNA抗原不存在這樣的風(fēng)險[46]；(5)mRNA疫苗的佐劑特性可提高其體內(nèi)免疫原性，誘導(dǎo)強(qiáng)烈和持久的免疫反應(yīng)[47]。已有研究證實了mRNA腫瘤疫苗在臨床試驗中的有效性[10-11]。

4 新抗原mRNA腫瘤疫苗應(yīng)用面臨的挑戰(zhàn)

Sahin等[48]對13例Ⅲ/Ⅳ期黑色素瘤患者進(jìn)行新抗原mRNA疫苗臨床試驗發(fā)現(xiàn)，8例(治療前影像學(xué)排除腫瘤存在)在腫瘤疫苗接種12～23個月的隨訪期間沒有復(fù)發(fā)；5例在接受治療時已發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，其中2例在治療后產(chǎn)生了客觀存在的免疫反應(yīng)，3例接受新抗原mRNA腫瘤疫苗聯(lián)合PD-1阻斷劑治療后產(chǎn)生了明顯的免疫反應(yīng)。免疫監(jiān)測顯示，所有患者都對疫苗中包含的新抗原及表位產(chǎn)生了T細(xì)胞相關(guān)反應(yīng)。最近，Ali等[49]用編碼新抗原的mRNA轉(zhuǎn)染單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞，以刺激健康供體的自體幼稚CD8+T細(xì)胞，該程序可使T細(xì)胞的激活不受腫瘤宿主免疫抑制環(huán)境的影響，結(jié)果顯示，聯(lián)合腫瘤疫苗和免疫檢查點抑制治療較單一治療更有效[50-51]。Curran等[52]對黑色素細(xì)胞瘤小鼠模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，新抗原疫苗結(jié)合PD-1和CTLA-4阻斷治療能有效延長小鼠的生存期，并增加小鼠腫瘤微環(huán)境中效應(yīng)T細(xì)胞與調(diào)節(jié)T細(xì)胞的比例。在Ott等[53]的臨床研究中，6例接受手術(shù)切除的黑色素瘤患者注射了新抗原mRNA疫苗，其中2例治療效果較差，但通過聯(lián)合抗PD-1治療獲得了完全的抗腫瘤免疫應(yīng)答。此外，新抗原疫苗與適應(yīng)性T細(xì)胞療法的組合在其他腫瘤的免疫治療中也已取得成功[54]。

截至目前，免疫療法對神經(jīng)膠質(zhì)瘤(特別是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)的治療效果十分有限，有研究認(rèn)為這可能是由于部分膠質(zhì)瘤中新抗原數(shù)量不足導(dǎo)致的[55]。在部分膠質(zhì)瘤進(jìn)展過程中，可能存在的少量新抗原是否真正被免疫系統(tǒng)識別尚不明確。Nejo等[56]對25例不同WHO分級的膠質(zhì)瘤組織樣本進(jìn)行外顯子及轉(zhuǎn)錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤組織中新抗原數(shù)目和表達(dá)水平、腫瘤突變負(fù)荷及免疫學(xué)特征隨時間而發(fā)生變化，表明由于免疫監(jiān)視的存在，新抗原的數(shù)量和表達(dá)均會隨著時間的推移而減少，而新抗原表達(dá)減少有助于腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。

腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸是阻礙腫瘤疫苗有效應(yīng)用的關(guān)鍵。Tran等[57]的研究發(fā)現(xiàn)，人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)位點雜合性的缺失可影響靶向新抗原或過繼性T細(xì)胞治療的腫瘤疫苗的臨床應(yīng)答。除了抗原丟失外，腫瘤細(xì)胞還具有多種復(fù)雜的免疫逃逸機(jī)制，如PD-1和CTLA-4等免疫檢查點相關(guān)的腫瘤逃逸機(jī)制，腫瘤微環(huán)境中各種細(xì)胞的免疫抑制作用[58]，以及腫瘤細(xì)胞壞死后釋放的離子或蛋白等影響T細(xì)胞對新抗原的識別和激活[59]等。另外，腫瘤細(xì)胞本身固有的特性，如突變景觀、干擾素信號通路的功能、抗原呈遞分子的表達(dá)及免疫逃避致癌信號通路等均可影響T細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的啟動、激活和招募[60]，最終影響免疫治療的效果。

免疫抑制微環(huán)境是膠質(zhì)瘤的重要特征[61-62]，骨髓源性抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Tregs)可特異性抑制效應(yīng)T細(xì)胞的活性及功能[63]。因此，膠質(zhì)瘤的免疫抑制特性很可能會抑制患者免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的抗腫瘤反應(yīng)，并影響腫瘤疫苗的治療效果，尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是具有高度固有和適應(yīng)性免疫抵抗的高級別膠質(zhì)瘤，研究發(fā)現(xiàn)，在特異性表達(dá)表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中，對免疫治療有反應(yīng)者不到10%[55]，且由于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤微環(huán)境中存在較強(qiáng)的獲得性免疫抵抗，導(dǎo)致免疫治療產(chǎn)生的反應(yīng)極為短暫，對治療效果無法產(chǎn)生實質(zhì)性的影響[64]。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)由于其獨特的免疫微環(huán)境，在基線水平，大腦處于免疫性靜止的狀態(tài)，另外，由于血腦屏障的存在，大多數(shù)外周免疫細(xì)胞無法穿透血腦屏障進(jìn)入大腦[65]。然而，當(dāng)檢測到危險信號時，在干擾素誘導(dǎo)的趨化因子的幫助下，外周免疫細(xì)胞容易通過血腦屏障，引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，這可能為腦腫瘤的免疫治療提供了必要的條件[66]。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤的個體異質(zhì)性很強(qiáng)[67]，每個腫瘤產(chǎn)生的新抗原幾乎只對同一腫瘤具有特異性，患者之間沒有共享，不同個體產(chǎn)生同一新抗原的概率極低[21]，必須根據(jù)某一類型的膠質(zhì)瘤尋找新抗原。因此，腫瘤類型和個體之間的巨大差異可能會限制針對突變新抗原的mRNA腫瘤疫苗的應(yīng)用。Hilf等[68]為15例HLA-A* 02:01或HLA-A* 24:02陽性的非復(fù)發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者制備并接種了兩種高度個性化的疫苗，結(jié)果顯示，疫苗均激活了患者體內(nèi)的特異性T細(xì)胞，這些T細(xì)胞從外周血液遷移到大腦，改變了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的免疫微環(huán)境，并且患者的中位總生存期延長至29.0個月。因此，新抗原腫瘤疫苗的制備必須強(qiáng)調(diào)個體特異性才能達(dá)到較可觀的治療效果。

膠質(zhì)瘤微環(huán)境中內(nèi)在的免疫抵抗阻止了免疫治療反應(yīng)的產(chǎn)生，適應(yīng)性抵抗阻止了腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的抗腫瘤活動，獲得性抵抗能夠保護(hù)腫瘤細(xì)胞在免疫系統(tǒng)的攻擊下不被消除。這些免疫抵抗機(jī)制均嚴(yán)重影響新抗原mRNA腫瘤疫苗的治療效果。因此，開發(fā)同時針對這些機(jī)制的治療策略非常必要。聯(lián)合免疫檢查點抑制劑(如抗PD-1、PD-L1及CTLA-4)，在干擾素的介導(dǎo)下協(xié)助外周免疫細(xì)胞進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮免疫效應(yīng)，是提高新抗原mRNA腫瘤疫苗治療效果的重要策略。另外，借助生物信息學(xué)或者機(jī)器學(xué)習(xí)算法，通過對不同類型及不同WHO分級的膠質(zhì)瘤組織多組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，從而識別出不同亞型的免疫微環(huán)境特征，以制定個性化的免疫治療方案非常關(guān)鍵。此外，雖然目前的測序技術(shù)已經(jīng)取得了長足的進(jìn)步[33]，但新抗原的識別及驗證仍然是耗時和昂貴的，從組織樣本到制備疫苗的過程通常需要3～5個月[48]，嚴(yán)重限制了新抗原疫苗的臨床應(yīng)用。實體腫瘤中新抗原的鑒定對腫瘤組織樣本量的需求較大，新抗原的預(yù)測算法工作量繁多，除了預(yù)測不同MHC分子與新抗原的結(jié)合外，還需要預(yù)測基因融合、插入和其他變化所產(chǎn)生的潛在新抗原[20]。這都需要耗費大量的時間和費用，可能是新抗原mRNA腫瘤疫苗在未來臨床應(yīng)用中面臨的重要挑戰(zhàn)。

5 總結(jié)與展望

新抗原對個體具有高度特異性，靶向新抗原的mRNA腫瘤疫苗可在不殺死正常細(xì)胞的情況下有效地誘導(dǎo)患者體內(nèi)腫瘤特異性T細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，從而實現(xiàn)個體化的精準(zhǔn)治療。作為一種新興的抗腫瘤免疫治療方法，新抗原疫苗在多項試驗中取得了預(yù)期的治療效果，在一定程度上延長了患者的生存期，且在多種類型的膠質(zhì)瘤及其他腫瘤中顯示出較高的安全性和誘導(dǎo)能力。然而，由于膠質(zhì)瘤的抑制性免疫微環(huán)境特征、免疫逃逸機(jī)制及不同的免疫抵抗機(jī)制，新抗原mRNA腫瘤疫苗在誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞活化后可能無法使其繼續(xù)發(fā)揮預(yù)期的腫瘤殺傷作用，這是其應(yīng)用于腦膠質(zhì)瘤的主要挑戰(zhàn)。進(jìn)一步深入了解腫瘤組織的免疫抑制和逃逸機(jī)制，有助于制定更有效的免疫治療策略。如何將mRNA新抗原疫苗療法與其他免疫治療策略結(jié)合起來，以克服腫瘤免疫逃逸及抵抗機(jī)制，提高膠質(zhì)瘤患者的治療效果，需要不斷進(jìn)行測試和完善。