呂艷，耿強(qiáng)，韓燕燕，鄭旭，李翀，蘭福，趙杰

天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科 國(guó)家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300381

乳腺癌是全世界女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，2018年全世界女性乳腺癌發(fā)病率和病死率分別為46.3/100 000和13.0/100 000，且均呈上升趨勢(shì)［1］。盡管乳腺癌的診療取得了一定進(jìn)展，但是放、化療對(duì)患者的免疫系統(tǒng)帶來(lái)的損害不可避免，因此尋求“減毒增效”的治療方法是目前亟待解決的問(wèn)題。乳腺癌的病因病機(jī)是“正氣內(nèi)虛，毒瘀并存”，治療乳腺癌應(yīng)扶正與祛邪相結(jié)合，在扶正的基礎(chǔ)上解毒祛瘀。消巖湯正是以此為依據(jù)組方而成，方以生黃芪、太子參為君藥，益氣滋陰，扶正驅(qū)邪；白花蛇舌草、夏枯草、生牡蠣為臣藥，清熱解毒，軟堅(jiān)散結(jié)；郁金、姜黃為佐藥，活血祛瘀，行氣解郁。研究表明，消巖湯具有顯著改善乳腺癌患者生活質(zhì)量的功效，但分子機(jī)制不明確［2］。circRNA作為一類(lèi)新型拼接RNA，在乳腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。最新研究證實(shí)，敲低膀胱癌組織中的circRIP2基因可抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2（TGF-β2）活性，從而促進(jìn)膀胱癌進(jìn)展［3］。TGF-β2是重要的腫瘤免疫功能調(diào)節(jié)因子，乳腺干細(xì)胞中高表達(dá)的TGF-β2可誘發(fā)上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）［4-5］。2021年10月—2022年3月，本研究觀察了不同濃度消巖湯含藥血清對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響，并觀察其調(diào)控機(jī)制是否與circRIP2和TGF-β2有關(guān)，為探索消巖湯干預(yù)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料細(xì)胞：乳腺癌MCF-7細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院，使用含10%小牛血清的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，胰蛋白酶溶液消化，每3 d傳代一次。動(dòng)物：BALB/C小鼠40只，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，批號(hào)：SCXK（京）2021-0006。主要試劑：GAPDH、TGF-β2、絲氨酸蘇氨酸激酶2（RIPK2）一抗均購(gòu)自美國(guó)ABclonal公司，TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，CCK-8試劑盒、Transwell小室均購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，無(wú)水乙醇、異丙醇均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SuperReal PreMix Plus均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

1.2 消巖湯含藥血清制備消巖湯配伍組成：黃芪30 g、太子參15 g、郁金10 g、姜黃15 g、夏枯草10 g、生牡蠣15 g、白花蛇舌草10 g，分別按40 g/kg（臨床成人日用量的20倍）、20 g/kg、10 g/kg溶解于生理鹽水。將30只BALB/C小鼠分為三部分，每部分10只，分別灌胃給予40、20、10 g/kg的消巖湯，每次灌胃間隔24 h，連續(xù)3 d。小鼠末次灌胃后禁食禁水，12 h后眼眶取血法采血，無(wú)菌分離血清，經(jīng)56℃、30 min滅活處理后，使用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩Ａ砣?0只BALB/C小鼠不予灌胃，僅采血獲得血清，記為空白鼠血清。

1.3 細(xì)胞分組處理取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×107/μL，以1×105/孔接種于6孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%，將細(xì)胞分為消巖湯含藥血清4組、消巖湯含藥血清2組、消巖湯含藥血清1組、普通牛血清組、空白鼠血清組，依次加入1.2中制備的濃度比為4∶2∶1的消巖湯含藥血清、普通10%小牛血清及空白鼠血清，每孔100 μL，均孵育24 h。

1.4 細(xì)胞增殖能力觀察采用CCK-8法。取“1.3”分組處理的細(xì)胞，按1×103/孔接種于96孔板，并設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔加入培養(yǎng)基100 μL。分別培養(yǎng)24、48 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度（OD）值。

1.5 細(xì)胞遷移能力觀察采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。取“1.3”分組處理的細(xì)胞，用無(wú)菌槍頭在長(zhǎng)滿(mǎn)的細(xì)胞中間位置劃一直線，小心清洗去除漂浮細(xì)胞后（0 h）進(jìn)行拍照，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)24、48、72 h拍照，測(cè)量劃痕距離（D）后計(jì)算24、48、72 h細(xì)胞遷移率。24 h細(xì)胞遷移率（%）=（D0 h-D24 h）/D0 h×100%，48 h細(xì)胞遷移率（%）=（D0 h-D48 h）/D0 h×100%，72 h細(xì)胞遷移率（%）=（D0 h-D72 h）/D0 h×100%。

1.6 細(xì)胞侵襲能力觀察采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)。提前準(zhǔn)備好Transwell小室，在中間鋪Matrigel膠。取“1.3”分組處理的細(xì)胞，胰酶消化后將5×105個(gè)細(xì)胞用培養(yǎng)基重懸至200 μL，加到Transwell上室；Transwell下室加入培養(yǎng)基+10%小牛血清；48 h后擦去Matrigel膠，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡拍照后對(duì)穿膜細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.7 細(xì)胞中circRIP2、RIP2及TGF-β2mRNA檢測(cè)采用qRT-PCR法。采用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。cir?cRIP2、RIP2、TGF-β2及內(nèi)參β-actin的PCR引物設(shè)計(jì)、合成由大連寶生物公司完成，引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系：2×Super Real PreMix Plus 10 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，用ddH2O補(bǔ)充至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 min，1個(gè)循環(huán)；95℃變性10 s，60℃退火20 s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸20 s。熔解曲線：95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s。以β-actin為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 circRIP2、RIP2、TGF-β2及內(nèi)參β-actin引物序列

1.8 細(xì)胞中RIPK2、TGF-β2蛋白檢測(cè)采用West?ern blotting法。取各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，制備SDS-PAGE膠，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉；加入RIPK2、TGF-β2及內(nèi)參GAPDH一抗（稀釋比例均為1∶1 000），4℃孵育過(guò)夜，洗膜；加入二抗（稀釋比例為1∶40 000），室溫下封閉1 h，洗膜后顯色、曝光，Image J軟件分析條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用Shapiro-Wilktest正態(tài)性檢驗(yàn)，呈正態(tài)分布以±s表示，多組間比較采用方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)和SNK法，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量方差分析；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖能力比較培養(yǎng)24 h，消巖湯含藥血清4、2組細(xì)胞增殖能力均低于普通牛血清組（P均<0.05）；培養(yǎng)48 h，消巖湯含藥血清4、2、1組細(xì)胞增殖能力均低于普通牛血清組，消巖湯含藥血清4組細(xì)胞增殖能力均低于空白鼠血清組（P均<0.05）。其他兩組間同時(shí)間點(diǎn)比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均>0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組培養(yǎng)24、48 h的細(xì)胞增殖能力比較（±s）

表2 各組培養(yǎng)24、48 h的細(xì)胞增殖能力比較（±s）

注：與空白鼠血清組比較，*P<0.05；與普通牛血清組比較，#P<0.05。

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2.2 各組細(xì)胞遷移能力比較見(jiàn)表3及OSID碼圖1。

表3 各組培養(yǎng)24、48、72 h的細(xì)胞遷移率比較（±s）

表3 各組培養(yǎng)24、48、72 h的細(xì)胞遷移率比較（±s）

注：與同組24 h比較，*P<0.05；與普通牛血清和空白血清組同時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.05。

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2.3 各組細(xì)胞侵襲能力比較消巖湯含藥血清4、2、1組及普通牛血清組、空白鼠血清組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（24±2）、（37±4）、（47±6）、（88±5）、（82±8）個(gè)，消巖湯含藥血清4、2、1組穿膜細(xì)胞數(shù)均低于普通牛血清組、空白鼠血清組（P均<0.05），消巖湯含藥血清4、2、1組穿膜細(xì)胞數(shù)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。見(jiàn)OSID碼圖2。

2.4 各組細(xì)胞circRIP2及RIP2、TGF-β2mRNA相對(duì)表達(dá)量比較見(jiàn)表4。

表4 各組細(xì)胞circRIP2及RIP2、TGF-β2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表4 各組細(xì)胞circRIP2及RIP2、TGF-β2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與空白鼠血清組比較，*P<0.05；與普通牛血清組比較，#P<0.05。

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2.5 各組細(xì)胞RIPK2、TGF-β2蛋白表達(dá)比較消巖湯含藥血清4組RIPK2蛋白相對(duì)表達(dá)量低于空白鼠血清組、消巖湯含藥血清1組，TGF-β2蛋白相對(duì)表達(dá)量低于普通牛血清組（P均<0.05）。見(jiàn)表5及OSID碼圖3、4。

表5 各組細(xì)胞RIPK2、TGF-β2蛋白表達(dá)比較（±s）

表5 各組細(xì)胞RIPK2、TGF-β2蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與空白鼠血清組比較，*P<0.05；與普通牛血清組比較，#P<0.05；與消巖湯含藥血清1組比較，△P<0.05；

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3 討論

消巖湯是天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，在臨床應(yīng)用數(shù)十年，對(duì)多種腫瘤包括乳腺癌［4］、非小細(xì)胞肺癌和甲狀腺癌［6-7］等均有良好療效。但是，消巖湯治療各種腫瘤的分子機(jī)制尚不明確。研究證實(shí)，消巖湯含藥血清經(jīng)Survivin siRNA抑制人肺腺癌A549細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其凋亡［8］。此外，消巖湯能夠增強(qiáng)毒性T淋巴細(xì)胞和自然殺傷（NK）細(xì)胞的活性而提高腫瘤患者免疫功能［9-10］。本研究結(jié)果顯示，培養(yǎng)相同時(shí)間點(diǎn)消巖湯含藥血清4、2組細(xì)胞增殖能力均低于普通牛血清組，消巖湯含藥血清4、2、1組24 h細(xì)胞遷移率均低于普通牛血清組、空白鼠血清組，消巖湯含藥血清4、2組48、72 h細(xì)胞遷移率均低于普通牛血清組、空白鼠血清組，消巖湯含藥血清4、2、1組穿膜細(xì)胞數(shù)均低于普通牛血清組、空白鼠血清組；這提示消巖湯含藥血清可有效抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，以中高濃度消巖湯含藥血清效果更明顯。

環(huán)狀RNA可通過(guò)海綿樣吸附miRNA對(duì)下游基因進(jìn)行調(diào)控，產(chǎn)生后續(xù)的表觀遺傳特性。研究顯示，miR-1305是影響乳腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素之一［11］，而TGF-β2可通過(guò)激活Smad3參與調(diào)控乳腺癌轉(zhuǎn)移［12］。盡管circRIP2首先是在膀胱癌相關(guān)研究中被人們認(rèn)識(shí)，但是鑒于其“海綿樣”吸附分子miR-1305以及下游調(diào)控蛋白TGF-β2均與乳腺癌進(jìn)展關(guān)系密切。因此，本研究觀察了消巖湯含藥血清抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的相關(guān)機(jī)制是否與circRIP2有關(guān)。cir?cRIP2是一個(gè)長(zhǎng)度為282 bp的環(huán)狀RNA，不能編碼、翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)，只有在解鏈狀態(tài)才能夠吸附miR-1305，并對(duì)下游調(diào)控通路產(chǎn)生作用，并且只有在線性RNA狀態(tài)下才能夠編碼產(chǎn)生蛋白R(shí)IPK2。最近研究發(fā)現(xiàn)，RIPK2活性增加導(dǎo)致了NF-κB的活化，隨后促進(jìn)了乳腺癌的發(fā)生和侵襲［13］。本研究結(jié)果表明，消巖湯含藥血清4組細(xì)胞circRIP2相對(duì)表達(dá)量均低于普通牛血清組、空白鼠血清組，RIP2相對(duì)表達(dá)量均低于普通牛血清組；消巖湯含藥血清4組RIPK2蛋白相對(duì)表達(dá)量低于空白鼠血清組；這提示高濃度消巖湯含藥血清對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的circRIP2具有抑制作用，同時(shí)抑制線性RIP2 mRNA蛋白產(chǎn)物RIPK2表達(dá)，可能是其降低乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的相關(guān)機(jī)制之一，為探索消巖湯通過(guò)調(diào)控circRIP2而影響乳腺癌進(jìn)展的分子機(jī)制提供了重要線索。

此外，TGF-β2/Smad3通路激活對(duì)乳腺癌易感性的影響已被證實(shí)［14］。TGF-β2基因敲除可加速乳腺癌T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤排斥反應(yīng)，對(duì)于乳腺癌的進(jìn)展具有重要的臨床意義［15］。關(guān)于TGF-β2及其通路與放療和化療耐受的關(guān)系是目前研究的焦點(diǎn)［16］，TGF-β2有可能成為突破腫瘤患者放療、化療耐藥性的關(guān)鍵點(diǎn)［17-18］。本研究結(jié)果表明，消巖湯含藥血清4組細(xì)胞TGF-β2mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于普通牛血清組、空白鼠血清組，TGF-β2蛋白相對(duì)表達(dá)量低于普通牛血清組；這提示高濃度消巖湯含藥血清可能通過(guò)抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞TGFβ2mRNA和蛋白表達(dá)而降低其細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力。

綜上所述，高濃度消巖湯含藥血清可通過(guò)降低cir?cRIP2、TGF-β2表達(dá)而參與抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在未來(lái)研究中，我們將重點(diǎn)探索cir?cRIP2和TGF-β2之間的調(diào)控關(guān)系及下游蛋白與乳腺癌進(jìn)展的相關(guān)性。