李燕，孟凱，杜允宏，陳斐，劉文靜，鮑慧婧

1青島大學(xué)附屬泰安市中心醫(yī)院眼科，山東泰安 271000；

2青島大學(xué)附屬泰安市中心醫(yī)院肛腸外科

青光眼濾過性手術(shù)是目前治療青光眼尤其是終末期青光眼的主要手段，但該手術(shù)方式存在較高的遠(yuǎn)期失敗率，手術(shù)區(qū)濾過泡瘢痕形成是導(dǎo)致青光眼濾過性手術(shù)失敗的主要原因［1］。轉(zhuǎn)化生長因子β2（TGF-β2）是創(chuàng)傷后組織修復(fù)過程中關(guān)鍵的調(diào)控分子，可通過介導(dǎo)人Tenon氏囊成纖維細(xì)胞（HTFs）增殖、遷移并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞纖維化進(jìn)程，加速青光眼術(shù)后濾過泡瘢痕化，從而造成手術(shù)失敗。miR-26是微小RNA（miRNA）的一種，位于人3號(hào)染色體3P21.3，由21～23個(gè)核苷酸組成，被證實(shí)能夠影響多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展［2-4］。近年來多項(xiàng)研究表明，miR-26在肝臟纖維化、心肌細(xì)胞纖維化、腎臟纖維化以及晶狀體纖維化等多種纖維化疾病中發(fā)揮重要調(diào)控作用，已經(jīng)成為進(jìn)一步開發(fā)抗纖維增生藥物的新靶點(diǎn)［5-8］。但是，目前關(guān)于miR-26在青光眼術(shù)后濾過泡瘢痕化中的研究比較少。2018年9月—2021年12月，本研究觀察了miR-26對(duì)TGF-β2誘導(dǎo)后HTFs細(xì)胞遷移及細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白分泌的影響，并對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行探討，為青光眼術(shù)后抗瘢痕化治療提供新的靶點(diǎn)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料DMEM陪養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Gibco公司，青—鏈霉素雙抗購自美國Hyclone公司，胰蛋白酶購自上海實(shí)生生物技術(shù)有限公司，Lipo?fectamineTM2000試劑購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR試劑盒均購自大連寶生物科技有限公司，TGF-β2購自美國R&D Systems公司；角蛋白一抗、波形蛋白一抗、FITC熒光二抗、纖維連接蛋白（Fibronectin）一抗、Ⅰ型膠原蛋白（COLⅠ）一抗、CTGF一抗 均購 自美 國Santa Cruz公 司。miR-26的模擬物和2'甲氧基修飾的反義寡核苷酸序列根據(jù)Elbashir的設(shè)計(jì)原則進(jìn)行設(shè)計(jì)，由上海吉瑪制藥有限公司合成，經(jīng)BLAST查詢，排除與其他基因同源。

1.2 HTFs的提取、培養(yǎng)及鑒定

1.2.1 HTFs的提取選擇2018年9月—2021年10月于本院行青光眼濾過性手術(shù)的青光眼患者10例，平均年齡50.12歲，男女比例為4∶6。術(shù)中沿患者角鞏緣剪開球結(jié)膜，取結(jié)膜下適當(dāng)體積的Tenon氏囊組織，注意避免混入結(jié)膜上皮組織，置于無菌的生理鹽水瓶中保存。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，患者均簽署知情同意書。

1.2.2 HTFs的原代培養(yǎng)將無菌取材的Tenon氏囊組織置于培養(yǎng)皿中，PBS反復(fù)沖洗，加入少量含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液；用眼科剪將其剪成大小約0.5 mm3的組織塊，置于35 mm2培養(yǎng)皿中，接種后加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天換液1次，組織塊貼壁培養(yǎng)3～8 d后，倒置顯微鏡下可見細(xì)胞從組織邊緣游離出，細(xì)胞形態(tài)不一，多呈長梭形、多邊形或星狀，可有2～5個(gè)細(xì)長狀突起，細(xì)胞核大而居中；20 d左右細(xì)胞生長漸漸達(dá)融合狀態(tài)。倒置顯微鏡下觀察當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到90%時(shí)，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞傳代3次后，細(xì)胞生長趨于一致，細(xì)胞呈長梭形，大小不一，呈旋渦狀或魚群樣分布，有一定的方向性；細(xì)胞體透亮，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，呈橢圓形，符合HTFs的形態(tài)學(xué)特征，見OSID碼圖1。

1.2.3 HTFs表型鑒定采用免疫熒光染色。取傳至第4代的HTFs進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，6孔板中加入培養(yǎng)液，放入爬片，以4×104/mL進(jìn)行接種，培養(yǎng)48 h后取出爬片，每孔加入PBS 1～2 mL漂洗3次；吸除PBS，用乙醇與冰醋酸（99∶1）的混合液固定細(xì)胞15 min，PBS漂洗。加入0.5% Triton X-100 1 mL，室溫下孵育10 min，PBS漂洗；加入10%羊血清1 mL，室溫下封閉30 min，吸除羊血清。滴加0.5%BSA稀釋的單克隆兔抗人波形蛋白、角蛋白一抗（稀釋比例均為1∶100），置于4℃濕盒孵育過夜，PBS漂洗；滴加FITC標(biāo)記的0.5%BSA稀釋二抗，室溫孵育1 h，PBS漂洗。加入碘化丙啶（PI），37℃孵育10 min，封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。免疫熒光染色結(jié)果顯示，波形蛋白在HTFs細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈陽性表達(dá)，表現(xiàn)為與細(xì)胞生長方向一致的束狀綠色高熒光，角蛋白在HTFs細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈陰性表達(dá)，見OSID碼圖2；證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞分組及處理方法取對(duì)數(shù)期傳代的HT?Fs，調(diào)整細(xì)胞密度為4×104/mL，每孔板2 mL接種到6孔板。將細(xì)胞隨機(jī)分為空白組（不予轉(zhuǎn)染）、TGFβ2組（不予轉(zhuǎn)染）、TGF-β2+miR-26 mimics組（轉(zhuǎn)染miR-26類似物）、TGF-β2+mimics NC組（轉(zhuǎn)染miR-26陰性對(duì)照物）、TGF-β2+miR-26 inhibitors組（轉(zhuǎn)染miR-26抑制物）、TGF-β2+inhibitors NC組（轉(zhuǎn)染miR-26抑制物陰性對(duì)照物），按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行操作；轉(zhuǎn)染24 h后，空白組加入等體積含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，其余各組更換為含5 μg/L TGF-β2及10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.4 細(xì)胞遷移能力觀察采用劃痕實(shí)驗(yàn)。取各組細(xì)胞，吸除培養(yǎng)基，用200 μL無菌槍頭在融合的細(xì)胞層上沿直尺作一劃痕，PBS沖洗，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h后將細(xì)胞置于倒置顯微鏡下拍照。采用Image J軟件測量劃痕寬度，細(xì)胞遷移率=（初始劃痕寬度-48 h劃痕寬度）/初始劃痕寬度×100%。

1.5 細(xì)胞COLⅠ、Fibronectin蛋白檢測采用Western blotting法。取各組細(xì)胞，使用RIPA試劑提取總蛋白，BCA法定量。加入5×蛋白上樣緩沖液，100℃恒溫水浴5 min，使蛋白充分變性。取變性蛋白40 μg行SDS?PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h。分別加入COLⅠ、Fibronectin、GAP?DH一抗（稀釋比例均為1∶1 000），4℃孵育過夜；加入二抗（稀釋比例均為1∶1 000），室溫條件孵育1 h。采用Odyssey紅外圖像成像系統(tǒng)掃描成像，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算COLⅠ、Fibronectin蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 miR-26和CTGF的靶向作用觀察采用生物信息學(xué)軟件Target Scan篩選發(fā)現(xiàn)，CTGF基因下游的3′非翻譯區(qū)存在miR-26的結(jié)合位點(diǎn)（見圖1）。采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，CTGF的野生型（WT）和突變型（MUT）3'-UTR均由上海吉瑪制藥有限公司克隆到報(bào)告基因監(jiān)測系統(tǒng)pmiR-RBReportTM質(zhì)粒載體中。取對(duì)數(shù)期傳代的HTFs，分為四部分，分別共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-CTGF、MUT-CTGF 100 ng與miR-26 mimics、miR-26 NC載體50 nmol/L，嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行操作，共轉(zhuǎn)染48 h后按照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書操作，記錄海腎熒光素酶與螢火蟲螢光素酶的熒光值，以二者的比值表示熒光素酶相對(duì)活性。共轉(zhuǎn)染miR-26 mimics+WT-CTGF的HTFs熒光素酶相對(duì)活性明顯低于共轉(zhuǎn)染miR-26 NC+WT-CTGF的HTFs（P<0.05），共 轉(zhuǎn) 染miR-26 mimics+MUT-CTGF的HTFs與 共 轉(zhuǎn) 染miR-26 NC+MUT-CTGF的HTFs熒光素酶相對(duì)活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

圖1 Target Scan軟件顯示miR-26和CTGF存在結(jié)合位點(diǎn)

1.7 各組細(xì)胞CTGF mRNA及蛋白檢測①CTGF mRNA：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。取各組細(xì)胞，采用TRIzol法提取總RNA，行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。CTGF引物序列：上游引物5′-GCGGCTTACCGACTGGA-3′、下 游 引 物5′-AGGCGGCTCTGCTTCTC-3′，內(nèi) 參GAPDH引 物 序 列：上 游 引 物5′-GTCGATGGC?TAGTCGTAGCATCGAT-3′、下 游 引 物5′-TGC?TAGCTGGCATGCCCGATCGAT-3′。PCR反應(yīng)體系：模板1.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，Master 12.5 μL，加雙蒸水補(bǔ)充至25 μL。PCR反應(yīng)過程：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火、延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸3 min。PCR完成后，采用2－ΔΔCt法計(jì)算CTGF mRNA相對(duì)表達(dá)量。②CTGF蛋白：參照1.5采用Western blotting法檢測各組細(xì)胞CTGF蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 CTGF、miR-26共同作用對(duì)TGF-β2誘導(dǎo)的HTFs細(xì)胞遷移及COLⅠ、Fibronectin蛋白表達(dá)影響的觀察

1.8.1 細(xì)胞分組處理參照Gen Bank數(shù)據(jù)庫提供的CTGF基因序列，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成CTGF-siRNA和陰性對(duì)照siRNA。將對(duì)數(shù)生長期的HTFs分為空白轉(zhuǎn)染組（不予轉(zhuǎn)染）、miR-26 inhibitor組（轉(zhuǎn)染miR-26 inhibitor）、miR-26 inhibi?tors+si-NC組（轉(zhuǎn) 染miR-26 inhibitor+陰 性 對(duì) 照siRNA）、miR-26 inhibitors+si-CTGF組（轉(zhuǎn)染miR-26 inhibitor+CTGF-siRNA），嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000說明書操作；轉(zhuǎn)染24 h后，空白轉(zhuǎn)染組加入等體積含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，其余各組更換為含5 μg/L TGF-β2及10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.8.2 細(xì)胞遷移能力參照“1.4”采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞遷移率。

1.8.3 細(xì)胞COLⅠ、Fibronectin蛋白表達(dá)參照“1.5”采用Western blotting法檢測各組細(xì)胞COLⅠ、Fibronectin蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)，呈正態(tài)分布以±s表示，多組間比較采用方差分析，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量的方差分析；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 六組細(xì)胞遷移率及COLⅠ、Fibronectin蛋白表達(dá)比較空白組、TGF-β2+miR-26 mimics組

表1 六組細(xì)胞遷移率及COLⅠ、Fibronectin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表1 六組細(xì)胞遷移率及COLⅠ、Fibronectin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與空白組、TGF-β2+miR-26 mimics組比較，*P<0.05；與TGF-β2組、TGF-β2+mimics NC組、TGF-β2+inhibitors NC組比較，#P<0.05。

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2.2 六組細(xì)胞CTGF mRNA和蛋白表達(dá)比較CT?GF mRNA相對(duì)表達(dá)量：空白組

表2 六組細(xì)胞CTGF mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表2 六組細(xì)胞CTGF mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與空白組比較，*P<0.05；與TGF-β2組、TGF-β2+mimics NC組、TGF-β2+inhibitors NC組比較，#P<0.05。

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2.3 四組細(xì)胞遷移率及COLⅠ、Fibronectin蛋白表達(dá)比較TGF-β2+miR-26 inhibitors+si-CTGF組<空白 轉(zhuǎn)染 組

表3 四組細(xì)胞遷移率及COLⅠ、Fibronectin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表3 四組細(xì)胞遷移率及COLⅠ、Fibronectin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與空白轉(zhuǎn)染組比較，*P<0.05；與TGF-β2+miR-26 inhibitors組、TGF-β2+miR-26 inhibitors+si-NC組比較，#P<0.05。

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3 討論

青光眼濾過性手術(shù)后瘢痕過度增生導(dǎo)致的濾過泡包裹是青光手術(shù)失敗的主要原因，目前臨床上通常采用的5-FU、MMC、環(huán)孢霉素A（CsA）等均是通過抑制成纖維細(xì)胞增殖而發(fā)揮作用，取得了一定療效，但是由于這些藥物對(duì)眼部組織的作用具有非特異性，常常導(dǎo)致濾過泡滲漏、低眼壓性黃斑病變等一系列并發(fā)癥的發(fā)生。因此，闡明青光眼術(shù)后濾過通道瘢痕化的機(jī)制，并積極探索特異性更強(qiáng)、更安全有效的新靶點(diǎn)一直是眼科青光眼領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

TGF-β2是創(chuàng)傷后組織修復(fù)過程中關(guān)鍵的調(diào)控分子，與青光眼術(shù)后濾過泡瘢痕形成關(guān)系密切，主要通過介導(dǎo)HTFs細(xì)胞增殖、遷移并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)以促進(jìn)細(xì)胞纖維化進(jìn)程。過去曾認(rèn)為，抗TGF抗體是青光眼術(shù)后抗纖維化治療的方法之一，有多項(xiàng)研究嘗試通過阻斷TGF-β2表達(dá)來有效抑制濾過泡瘢痕，從而提高手術(shù)成功率，如ilomastat、Decorin、ASON等。但事實(shí)證實(shí)這種方法具有雙刃劍的作用，阻斷TGF在緩解了其促纖維化效應(yīng)的同時(shí)，也抑制了其正面的抗炎效應(yīng)。因此，臨床亟需尋找一種靶向作用更強(qiáng)、療效更高、不良反應(yīng)更小的藥物用于抑制青光眼濾過性手術(shù)后瘢痕的形成。

miRNA是真核生物體內(nèi)的一類長22～24個(gè)核苷酸的單鏈小分子RNA，是非編碼RNA的一種，具有高度的基因保守性。miRNA對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控位于轉(zhuǎn)錄后水平，通過完全或者不完全互補(bǔ)配對(duì)，特異性結(jié)合到靶mRNA的3′非翻譯區(qū)，引起靶mRNA的降解或者翻譯抑制，從而抑制靶蛋白表達(dá)。近年多項(xiàng)研究表明，miRNA與青光眼的發(fā)病、進(jìn)展有關(guān)［9-12］。miR-26作為miRNA的一種，最早被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移方面具有重要作用，近年來越多的研究證實(shí)miR-26在多種器官纖維化過程中發(fā)揮重要作用。ZHANG等［7］研究發(fā)現(xiàn)，在單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）小鼠的腎臟、肌肉和外泌體中，miR-26a表達(dá)減少，小鼠骨骼肌注射miR-26a可減弱UUO小鼠的腎纖維化。CHEN等［8］研究認(rèn)為，miR-26a和miR-26b在體內(nèi)外均能顯著抑制晶狀體上皮細(xì)胞的增殖、遷移和晶狀體纖維化。但是，關(guān)于miR-26在青光眼術(shù)后濾過通道瘢痕化過程中的作用目前尚無相關(guān)研究。

成纖維細(xì)胞向創(chuàng)面的遷移移行是創(chuàng)面愈合的重要步驟，而細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的過量分泌和合成是創(chuàng)傷后瘢痕形成的關(guān)鍵因素。本研究通過檢測COLⅠ和Fibronectin蛋白表達(dá)來評(píng)價(jià)miR-26對(duì)ECM蛋白分泌的影響；結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，TGF-β2組細(xì)胞遷移率及COLⅠ、Fibronectin蛋白表達(dá)均升高，提示TGF-β2可誘導(dǎo)HTFs細(xì)胞遷移及ECM蛋白分泌；與TGF-β2組比較，miR-26 mimics組COLⅠ和Fibronectin蛋白表達(dá)下降，miR-26 inhibitors組COLⅠ和Fibronectin蛋白表達(dá)提高，提示miR-26能抑制TGF-β2誘導(dǎo)的ECM蛋白分泌，而敲低miR-26可以促進(jìn)ECM分泌。KOGA等［13］研究表明，在糖尿病腎病模型中，miR-26可以抑制TGF-β誘導(dǎo)的ECM蛋白表達(dá)，與本研究結(jié)果一致。

目前已有多項(xiàng)研究表明，miR-26的抗纖維化作用是通過抑制CTGF表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。YANO等［14］研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞暴露于電離輻射后，miR-26a表達(dá)下調(diào)，miR-26a在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)向調(diào)控CTGF表達(dá)，可減輕輻射后引起的纖維化作用。LI等［15］研究發(fā)現(xiàn)，miR-26a-5p過表達(dá)可通過降低支氣管肺泡灌洗液中總蛋白、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)以及腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、IL-6、丙二醛（MDA）和髓過氧化物酶（MPO）表達(dá)，緩解脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠的炎癥反應(yīng)，而CTGF過表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)miR-26a-5p對(duì)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響。本研究采用生物信息學(xué)軟件Target Scan對(duì)CT?GF基因的3′非翻譯區(qū)進(jìn)行了潛在靶點(diǎn)的篩選，發(fā)現(xiàn)CTGF基因下游的3′非翻譯區(qū)存在miR-26的結(jié)合位點(diǎn)，此結(jié)合位點(diǎn)位于人CTGF基因mRNA的3′非翻譯區(qū)652～659 bp處；雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)也證實(shí)miR-26可與CTGF靶向結(jié)合，證實(shí)CTGF是miR-26的下游靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，miR-26過表達(dá)后HTFs中的CTGF蛋白表達(dá)降低，抑制miR-26表達(dá)后細(xì)胞內(nèi)CTGF蛋白表達(dá)增高，但miR-26過表達(dá)/抑制對(duì)細(xì)胞CTGF mRNA表達(dá)無明顯影響。由此我們推測，miR-26可能在轉(zhuǎn)錄后水平直接靶向結(jié)合CTGF mRNA而負(fù)調(diào)控CTGF蛋白表達(dá)。本研究在轉(zhuǎn)染miR-26 inhibitors質(zhì)粒的基礎(chǔ)上采用RNA干擾技術(shù)抑制細(xì)胞內(nèi)CTGF基因表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與TGF-β2+miR-26 inhibitors組比較，TGF-β2+miR-26 inhibitors+si-CTGF組細(xì)胞遷移能力以及促ECM蛋白分泌能力降低，表明敲除CTGF基因能夠逆轉(zhuǎn)miR-26下調(diào)對(duì)TGF-β2誘導(dǎo)的HTFs細(xì)胞遷移和ECM蛋白表達(dá)的影響。

綜 上 所 述，miR-26可 以 抑 制TGF-β2誘 導(dǎo) 后HFTs細(xì)胞遷移及ECM蛋白合成，該作用可能是通過轉(zhuǎn)錄后水平靶向CTGF來實(shí)現(xiàn)的，調(diào)控miR-26表達(dá)有望為青光眼術(shù)后抗瘢痕化治療提供新的思路。