廖 川 綜述，韋貴將 審校

廣西壯族自治區(qū)百色市右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西百色 533000

在核酸檢測方面，目前應(yīng)用最廣泛的是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，但由于PCR具有對(duì)溫控設(shè)備過度依賴、熱循環(huán)過程耗時(shí)、操作專業(yè)化等特點(diǎn)，很難應(yīng)用于現(xiàn)場檢測。而由英國TwistDx lnc公司于2006年開發(fā)的重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)技術(shù)，則被稱為是可以替代PCR的新型核酸檢測技術(shù)[1]。雖然RPA技術(shù)從開發(fā)至今只有短短十余年，但其原理卻被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。且近年來RPA技術(shù)的發(fā)展速度達(dá)到了一個(gè)新的高度。RPA技術(shù)最大的亮點(diǎn)就是可在37～42 ℃條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，無需通過高溫解鏈，不依賴于復(fù)雜的熱循環(huán)儀，在常溫下即可完成擴(kuò)增過程，并且核酸擴(kuò)增速度極快，約20 min就可以獲得目的擴(kuò)增產(chǎn)物，可真正實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場快速核酸檢測。

1 RPA技術(shù)的基本原理

RPA技術(shù)主要依賴于兩種酶：重組酶T4 UvsX和枯草芽孢桿菌DNA聚合酶Ⅰ(Bsu)。此外，RPA反應(yīng)體系還需要擴(kuò)增模板、引物和各種原料等。RPA的基本反應(yīng)過程：首先，在腺嘌呤核苷三磷酸水解供能下，重組酶與RPA引物結(jié)合形成重組酶引物復(fù)合體，該復(fù)合體能在模板鏈中尋找與之同源的序列，一旦引物復(fù)合體找到該同源序列，它就會(huì)插入模板鏈中并形成D-環(huán)結(jié)構(gòu)，啟動(dòng)鏈置換反應(yīng)，被替換的那條模板鏈與單鏈結(jié)合蛋白(SSB)結(jié)合以保持單鏈穩(wěn)定。其次，重組酶在進(jìn)行鏈交換后，從復(fù)合體中分離，并可用于下一對(duì)引物。DNA聚合酶從引物的3′-OH端進(jìn)行鏈延伸，形成新的互補(bǔ)鏈。以上步驟重復(fù)進(jìn)行，就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。整個(gè)過程進(jìn)行得非?？欤话慵s20 min獲得可檢出水平的擴(kuò)增產(chǎn)物[2]。

2 RPA與PCR及其他恒溫?cái)U(kuò)增法的對(duì)比

RPA最大的優(yōu)點(diǎn)為可以在37～42 ℃的條件下進(jìn)行反應(yīng)，無需PCR的熱循環(huán)過程，且具有較高的靈敏度和特異度；在所有恒溫?cái)U(kuò)增法中，RPA是最為簡便的方法，它既不需要像以轉(zhuǎn)錄為基礎(chǔ)的擴(kuò)增技術(shù)一樣，反應(yīng)循環(huán)過程需重復(fù)加酶，操作復(fù)雜，也不需要PCR中的高溫解鏈及退火等過程。這一特點(diǎn)使RPA操作更加簡單，更適合現(xiàn)場實(shí)時(shí)檢測。

3 RPA的具體應(yīng)用

3.1RPA在細(xì)菌檢測中的應(yīng)用

3.1.1RPA在革蘭陰性菌檢測中的應(yīng)用 對(duì)于革蘭陰性菌，由于傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)法耗時(shí)較長，不適合于臨床應(yīng)用，因此研究者急需尋找新的方法來快速準(zhǔn)確地檢出各種革蘭陰性致病菌。WANG等[3]建立了一種基于RPA和3段側(cè)向流動(dòng)條的雙檢測生物傳感器，該生物傳感器構(gòu)建了霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌兩個(gè)目標(biāo)的雙鏈RPA反應(yīng)，該方法具有靈敏度高、特異度高、反應(yīng)時(shí)間短、設(shè)備簡單等優(yōu)勢，非常適合于基層醫(yī)院和現(xiàn)場實(shí)時(shí)檢測。與其他細(xì)菌不同的是，創(chuàng)傷弧菌可以進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)，使其不能被常規(guī)方法所檢測到。李偉等[4]用建立的添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的RPA技術(shù)來檢測水產(chǎn)品中的創(chuàng)傷弧菌，并通過設(shè)計(jì)引物對(duì)，將人工構(gòu)建的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)引入RPA體系來克服假陰性問題，這對(duì)于防止創(chuàng)傷弧菌感染有極大的意義。LIU等[5]通過RPA快速檢測鮑曼不動(dòng)桿菌及其耐碳青霉烯類耐藥基因，這對(duì)于指導(dǎo)臨床用藥、避免或延緩耐藥菌株的產(chǎn)生具有極其重要的意義。以上研究均表明了RPA在革蘭陰性菌檢測上的優(yōu)勢及最新研究進(jìn)展。

3.1.2RPA在革蘭陽性菌檢測中的應(yīng)用 革蘭陽性菌也是臨床上常見的致病菌，建立快速檢出方法對(duì)于其臨床早期診斷、治療和預(yù)后是非常有意義的。吳華華等[6]根據(jù)金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因序列，設(shè)計(jì)了特異性引物并建立了利用RPA技術(shù)快速檢測金黃色葡萄球菌的方法，結(jié)果顯示，RPA技術(shù)能擴(kuò)增金黃色葡萄球菌的特異基因序列，且最低檢測限為10 CFU/mL，表明該研究建立的金黃色葡萄球菌的RPA檢測方法具有較高的特異度和靈敏度。利用RPA技術(shù)與國際標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)法同時(shí)檢測被金黃色葡萄球菌污染的牛奶，二者檢測結(jié)果一致，但相比于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)法，RPA技術(shù)具有快速、簡單、方便等優(yōu)點(diǎn)，適合于臨床病例的快速確診。炭疽是一種烈性傳染病，對(duì)人類極具威脅，根據(jù)世界動(dòng)物衛(wèi)生組織規(guī)定，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)炭疽必須通報(bào)，因此人們一直很重視炭疽桿菌的快速準(zhǔn)確檢出。王素華等[7]根據(jù)炭疽桿菌BA5345保守序列建立了39 ℃恒溫水浴鍋檢測炭疽桿菌的RPA方法，該方法能特異性檢測炭疽桿菌，靈敏度也較高，其檢測炭疽桿菌的最低下限100 copy/μL，與實(shí)時(shí)熒光定量PCR相當(dāng)，是常規(guī)PCR的100倍。該研究還將RPA技術(shù)用于被炭疽桿菌污染的毛皮標(biāo)本檢測，其檢出率為65.71%，比實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢出率(71.43%)低，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常規(guī)PCR的檢出率(42.86%)。該研究結(jié)果表明，RPA技術(shù)能快速、準(zhǔn)確地檢測炭疽桿菌，其對(duì)于炭疽桿菌感染的預(yù)防控制有較大的臨床意義。此外，RPA技術(shù)還被用于檢測伯克霍爾德氏菌、結(jié)核分枝桿菌等[8-9]。在這些細(xì)菌檢測實(shí)驗(yàn)中，RPA技術(shù)均表現(xiàn)出較高的特異度、靈敏度和檢出率，可見RPA技術(shù)在細(xì)菌快速檢測方面有其獨(dú)特的優(yōu)勢。

3.2RPA在真菌檢測中的應(yīng)用 目前在醫(yī)學(xué)上對(duì)真菌的檢測主要是通過它的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)等表型進(jìn)行鑒別，而這些方法往往所需周期長且檢出率低。因此迫切地需要尋找一種快速、準(zhǔn)確的方法來檢測這些真菌。新型隱球菌是一種條件致病菌，多數(shù)患者都會(huì)有中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染癥狀，致死率很高，而目前臨床上常用的檢測新型隱球菌的方法有墨汁染色法和病原體培養(yǎng)法，雖然病原體培養(yǎng)法是檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但是至少需要等待72 h，不適合臨床診斷；而墨汁染色法又受限于檢測標(biāo)本類型，僅能檢測腦脊液標(biāo)本，且檢出率偏低，因此這些方法均無法滿足臨床大量標(biāo)本的高效即時(shí)檢測。基于這種情況，劉曄華等[10]建立了利用RPA技術(shù)對(duì)新型隱球菌的快速檢測方法，該研究通過對(duì)10株實(shí)驗(yàn)來源的新型隱球菌株和100份臨床標(biāo)本(包括腦脊液50份、靜脈血20份、痰15份、胸腔積液、腹水15份)進(jìn)行DNA擴(kuò)增，觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)該檢測方法能夠快速、準(zhǔn)確地檢測出新型隱球菌。該研究還對(duì)不同的DNA提取技術(shù)能否影響RPA實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了探索，爭取將熒光法RPA檢測技術(shù)用于大量標(biāo)本的自動(dòng)化檢測。白色念珠菌也是一種常見的致病菌，盡管大多數(shù)皮膚及黏膜白色念珠菌的感染者一般不會(huì)有生命危險(xiǎn)，但它嚴(yán)重降低了人們的生活質(zhì)量，增加了人們的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，所以需要對(duì)它高度重視。雖然目前針對(duì)白色念珠菌的檢測方法很多，如直接檢測法、革蘭染色法、培養(yǎng)法等，但由于檢測時(shí)間較長、檢出率較低、檢測過程復(fù)雜等各種各樣的原因都不能完全滿足研究者的需要。蒙雨丹[11]構(gòu)建了以RPA快速檢測白色念珠菌的方法并優(yōu)化其應(yīng)用，以期待為臨床檢測提供技術(shù)支持；并且為了讓該技術(shù)能用于床旁、基層甚至家庭檢測，還進(jìn)一步設(shè)計(jì)了重組酶聚合酶擴(kuò)增側(cè)流層析技術(shù)(RPA-LFD)的快速檢測方法，這種方法可以通過裸眼直接快速讀取結(jié)果，適合未經(jīng)任何培訓(xùn)的人員操作，可在實(shí)時(shí)診斷和條件受限的現(xiàn)場檢測中得到推廣應(yīng)用。隨著RPA技術(shù)地逐漸普及，越來越多的真菌可以通過RPA技術(shù)檢測。

3.3RPA在病毒檢測中的應(yīng)用 在病毒檢測方面，RPA技術(shù)被用于快速高效檢測流感病毒。孫寧等[12]以甲型流感病毒基質(zhì)蛋白基因、血凝素基因及乙型流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因?yàn)榘袠?biāo)基因設(shè)計(jì)引物，建立了反轉(zhuǎn)錄酶-重組酶聚合酶擴(kuò)增(RT-RPA)方法，用于檢測流感病毒。在臨床上人偏肺病毒感染是較常見的急性病及致死性疾病，且具有較高的流行性，但由于其臨床表現(xiàn)缺乏特異度，不易與其他呼吸道病毒感染相鑒別。唐娟等[13]將臨床收治的患兒納入研究，將RT-RPA檢測結(jié)果與直接熒光免疫法的檢測結(jié)果對(duì)比，以評(píng)估RPA技術(shù)在人偏肺病毒檢測中的可行性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RPA技術(shù)的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度均高于直接熒光免疫法，且前者檢測速度快、操作簡單，更適用于臨床病原診斷。近些年來，由于諾如病毒具有遺傳和抗原多樣性，使其在臨床檢測中面臨較大的挑戰(zhàn)。周樹青等[14]設(shè)計(jì)了基于RPA技術(shù)的快速檢測諾如病毒的方法，該方法可以在5 min左右擴(kuò)增出目的片段，檢測限低至106 copy/μL，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RPA檢測諾如病毒具有較高的特異度，適合于臨床病原檢測。我國曾是甲型肝炎病毒的高流行區(qū)，隨著2008年滅活疫苗的普遍使用，我國甲型肝炎病毒的感染率和發(fā)病率正逐年下降，但目前甲型肝炎病毒感染仍是世界衛(wèi)生主要問題之一，這提示仍需加強(qiáng)對(duì)甲型肝炎病毒的預(yù)防控制，早期快速檢出病毒是疫情預(yù)防控制的關(guān)鍵一步，孫棟良等[15]建立了快速檢測甲型肝炎病毒的RPA方法，該方法以甲型肝炎病毒保守核心區(qū)域?yàn)榘袠?biāo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RPA反應(yīng)4 min時(shí)即可檢測到目的片段，且檢測極限低至15.6 copy/μL。快速、準(zhǔn)確地檢測出甲型肝炎病毒對(duì)于甲型病毒性肝炎的預(yù)防控制具有極大地意義。據(jù)有關(guān)研究報(bào)道，RPA技術(shù)還被用于檢測猴痘病毒、乙型肝炎病毒等[16-17]。

3.4RPA在寄生蟲檢測中的應(yīng)用 自2006年RPA技術(shù)問世以來，RPA技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，在寄生蟲的檢測方面，已經(jīng)建立了針對(duì)原蟲、線蟲、吸蟲及其他寄生蟲的RPA方法。

3.4.1原蟲 瘧疾是由瘧原蟲感染引起的蟲媒傳染病。早期快速診斷是瘧疾防治的關(guān)鍵，KERSTING等[18]通過RPA-LFD靶向擴(kuò)增惡性瘧原蟲的18SrRNA基因片段，反應(yīng)在38 ℃進(jìn)行，最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RPA-LFD對(duì)于瘧原蟲的檢測有較高的特異度和靈敏度，且反應(yīng)條件溫和、操作簡單，非常適合于偏遠(yuǎn)地區(qū)現(xiàn)場檢查，推動(dòng)了全球瘧疾預(yù)防控制的進(jìn)步。在原蟲檢測方面，RPA的靈敏度通常高于PCR，吳耀東[19]將隱孢子蟲卵囊置于濃度為0.1%月桂酰肌氨酸鈉中，使其釋放出DNA并用RPA-LFD進(jìn)行檢查，30 min內(nèi)最少可以檢測出0.5個(gè)隱孢子蟲卵囊DNA，其靈敏度優(yōu)于PCR。同樣，通過含有弓形蟲的環(huán)境樣品中得到的弓形蟲卵囊DNA為模板，設(shè)計(jì)特異性探針和引物，可以檢測出低至0.1個(gè)弓形蟲卵囊DNA，靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR。

3.4.2線蟲 目前對(duì)于線蟲的檢測多采用傳統(tǒng)病原學(xué)和免疫學(xué)方法。異尖線蟲是一種重要的食源性人獸共患的寄生蟲，人和其他哺乳動(dòng)物通過食用生的或半生的含有活的異尖線蟲Ⅲ期幼蟲的魚而引起異尖線蟲寄生蟲病。近年來隨著人們的飲食方式的改變，對(duì)生魚片和壽司的食用越來越多，異尖線蟲寄生蟲病的發(fā)病率也越來越高，由于異尖線蟲寄生蟲病往往有異位現(xiàn)象，在臨床上，感染異尖線蟲患者多會(huì)被誤診為腸梗阻、潰瘍性結(jié)腸炎、膽囊炎等。為了早期快速診斷異尖線蟲感染，張春玲等[20]設(shè)計(jì)了以RPA為原理的異尖線蟲快速檢測方法，該方法可以特異性擴(kuò)增異尖科線蟲約340 bp大小的目的基因片段，并通過與其他寄生蟲對(duì)比發(fā)現(xiàn)RPA技術(shù)能特異性檢測出異尖科線蟲，其靈敏度高達(dá)1 pg/μL，這對(duì)于現(xiàn)場快速檢測線蟲具有極大的意義。廣州管圓線蟲也是一種對(duì)人類危害極大的寄生蟲，它主要引起感染者的炎癥和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，而其主要檢測手段PCR又過于復(fù)雜、昂貴，為了降低檢測成本和優(yōu)化檢測方法，JARVI等[21]設(shè)計(jì)了基于熒光重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(EXO-RPA)和RPA-LFD來取代PCR，實(shí)驗(yàn)通過3種方法來檢測來自夏威夷的35只蛞蝓是否存在廣州管圓線蟲DNA，3種檢查結(jié)果一致，檢出率均為65.7%，但是在低感染水平中EXO-RPA和RPA-LFD的檢出率分別是20.0%和14.3%。另外為了評(píng)估其靈敏度，JARVI等[21]克隆了廣州管圓線蟲的部分ITS1基因，并將其稀釋為一系列的濃度，范圍從1～100 copy/μL，PCR最低能檢測13 copy/μL，EXO-RPA最低能檢測25 copy/μL，而RPA-LFD不能在低于50 copy/μL的情況下持續(xù)擴(kuò)增。此外還有研究者利用RPA的雙重特性檢測寄生蟲，方圓等[22]建立了RPA同時(shí)快速檢測松材線蟲和擬松材線蟲的雙重檢測方法，通過松材線蟲和擬松材線蟲的ITS區(qū)差異序列，設(shè)計(jì)了不同的兩種上游引物和一種共同的下游引物，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)三者的配比達(dá)到5∶3∶8時(shí)，RPA擴(kuò)增效果最好，雙重RPA方法對(duì)檢測松材線蟲和擬松材線蟲的靈敏度分別是10 pg/μL和100 pg/μL，低于普通PCR的靈敏度，但也滿足對(duì)松材線蟲的檢測需求，相對(duì)于普通RPA方法，雙重RPA方法更為快速高效，為病原體快速檢測提供了新的方法。

3.4.3吸蟲 我國比較流行的吸蟲主要是日本血吸蟲，這是一種人獸共患寄生蟲，經(jīng)過我國近幾十年的大力預(yù)防控制，日本血吸蟲病的感染率正逐年下降，但仍有6 000萬人面臨這種疾病的風(fēng)險(xiǎn)，由于傳統(tǒng)的病原學(xué)檢測手段耗時(shí)較長，免疫學(xué)檢測又存在交叉反應(yīng)、較高的假陽性結(jié)果及不能區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染的缺點(diǎn)，因此不能滿足快速準(zhǔn)確診斷的要求。郭慶紅[23]以日本血吸蟲G01片段為檢測靶序列，建立了診斷小鼠和羊日本血吸蟲病的RPA-LFD檢測方法，并用這種方法檢測了36份陽性的小鼠血漿標(biāo)本和48份陽性的羊血漿標(biāo)本，其靈敏度分別為97.22%和93.75%，對(duì)所有的陰性標(biāo)本檢測特異度均為100.00%，其不與其他吸蟲產(chǎn)生交叉反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RPA-LFD方法檢測日本血吸蟲有較高的特異度和靈敏度，因此能夠滿足快速檢測日本血吸蟲的臨床需要。此外，在寄生蟲的快速檢測中，RPA還被用于檢測華支睪吸蟲等[24]。作為一種新興的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，RPA在原蟲、線蟲、吸蟲等方面的應(yīng)用愈發(fā)成熟。

3.5RPA在食品安全檢測中的應(yīng)用

3.5.1食源性病原菌 近年來由食源性病原菌導(dǎo)致的食品安全問題層出不窮，如何快速高效地檢測食源性病原微生物是確保食品安全的首要前提。郝娟等[25]運(yùn)用RPA來檢測不同種類嬰幼兒食品中的克羅諾桿菌，并與傳統(tǒng)培養(yǎng)法和PCR相對(duì)比，結(jié)果表明三者的定性結(jié)果一致，與后兩種方法相比，RPA體現(xiàn)出了效率上的優(yōu)勢，這表明RPA適合于食品安全初篩和現(xiàn)場檢測，并有助于應(yīng)對(duì)食品突發(fā)事件。此外，蘭全學(xué)等[26]還建立了EXO-RPA快速檢測空腸彎曲桿菌的方法，并通過對(duì)模擬污染食品檢測來分析EXO-RPA的實(shí)際應(yīng)用效果，結(jié)果表明，在40份標(biāo)本中檢測陽性率與PCR一致，該研究建立的方法具有特異度高、靈敏度高、抗干擾性強(qiáng)等優(yōu)勢，具有較好的應(yīng)用前景。

3.5.2轉(zhuǎn)基因食品 隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展及更多轉(zhuǎn)基因食品流進(jìn)市場，轉(zhuǎn)基因食物的安全問題備受人們的關(guān)注。許多國家和地區(qū)都對(duì)轉(zhuǎn)基因作物建立了相關(guān)的監(jiān)管制度，這就需要有足夠準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因檢測方法。目前檢測轉(zhuǎn)基因的方法主要有基于蛋白質(zhì)水平和核酸水平兩大類，前者受限于蛋白質(zhì)變性、檢測試劑等各種原因而無法滿足大規(guī)模轉(zhuǎn)基因作物檢測，后者中的PCR技術(shù)具有較高的靈敏度和特異度，但PCR需要復(fù)雜昂貴的熱循環(huán)儀，且操作過程復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適合于現(xiàn)場檢測，為了解決這些問題，謝實(shí)龍[27]針對(duì)MON89788(較早被批準(zhǔn)用于商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因大豆品種)的特異性基因序列設(shè)計(jì)了相應(yīng)的引物和探針，以RPA技術(shù)快速檢測轉(zhuǎn)基因大豆，并用該方法檢測收集到的8個(gè)大豆品種，以反轉(zhuǎn)錄PCR檢測為對(duì)照組，結(jié)果顯示，RPA檢測大豆轉(zhuǎn)基因特異度強(qiáng)，最低檢測限度可達(dá)40 copy/μL，且檢測時(shí)間為3.36～7.72 min，能夠?qū)崿F(xiàn)現(xiàn)場快速、大量檢測轉(zhuǎn)基因大豆。此外，竇雯等[28]對(duì)RPA反應(yīng)溫度和時(shí)間進(jìn)一步優(yōu)化，建立了轉(zhuǎn)基因大豆檢測體系，并利用這種方法對(duì)南京市市場上出售的豆芽菜和新鮮豆莢進(jìn)行檢測。目前，RPA在食品安全快速檢測方面的應(yīng)用已經(jīng)愈發(fā)成熟，但是在轉(zhuǎn)基因食品檢測中的報(bào)道還是比較少，這需要研究者加強(qiáng)對(duì)RPA的研究，進(jìn)一步優(yōu)化RPA檢測的條件。

3.6RPA在新型冠狀病毒檢測中的應(yīng)用 雖然目前我國新型冠狀病毒肺炎疫情已經(jīng)基本控制，但仍有少數(shù)病例不時(shí)出現(xiàn)，并且這種情況將持續(xù)相當(dāng)長的時(shí)間。另外，由于當(dāng)前沒有針對(duì)新型冠狀病毒肺炎的有效抗病毒藥物，因此，疫情預(yù)防控制工作最重要的仍是早期確診、早期隔離。據(jù)調(diào)查，有超過一半的新型冠狀病毒人際傳播來源于無癥狀攜帶者，因此對(duì)無癥狀攜帶者的隔離是限制病毒傳播的有效手段，這就要求必須掌握一種高效準(zhǔn)確的檢測手段。目前，檢測新型冠狀病毒最常用的方法就是核酸檢測，主要有實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄熒光PCR、數(shù)字PCR、各種恒溫核酸擴(kuò)增法，其中實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄熒光PCR是應(yīng)用最為廣泛的檢測方法。然而實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄熒光PCR對(duì)于陽性患者的檢出率僅為30%～50%，部分疑似陽性的病例需要多次核酸檢測才能得出陽性結(jié)果[29]，且PCR檢測新型冠狀病毒操作復(fù)雜、耗時(shí)較長、所需儀器較貴，很難快速篩選出陽性患者，不利于當(dāng)前形勢下的疫情預(yù)防控制。而近些年新興的RPA檢測方法則能夠快速準(zhǔn)確地檢測出目標(biāo)基因序列，而且操作方便、反應(yīng)條件簡單。有學(xué)者報(bào)道了基于RPA技術(shù)快速檢測新型冠狀病毒的試劑盒，該試劑盒無需昂貴的設(shè)備，采樣后僅需20～40 min就可完成現(xiàn)場檢測，而且操作簡單易普及，這對(duì)于全球新型冠狀病毒肺炎疫情預(yù)防控制具有重要的意義[30]。WANG等[31]建立了一種連接和重組酶聚合酶擴(kuò)增(L/RPA)聯(lián)合檢測方法，該方法能夠快速檢測出新型冠狀病毒。此外，SUN等[32]開發(fā)了一種基于反轉(zhuǎn)錄-重組酶聚合酶恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和DNA核酸內(nèi)切酶靶向技術(shù)的單管檢測平臺(tái)用于檢測新型冠狀病毒。目前大多數(shù)恒溫?cái)U(kuò)增法檢測新型冠狀病毒都需要兩個(gè)步驟，即反轉(zhuǎn)錄和恒溫?cái)U(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測，由于兩個(gè)步驟會(huì)相互干擾，因此需要在第一個(gè)步驟完成以后將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至另一個(gè)管，在轉(zhuǎn)移過程中需要打開擴(kuò)增反應(yīng)管，這就可能造成氣溶膠污染，進(jìn)而產(chǎn)生假陽性結(jié)果，該平臺(tái)通過優(yōu)化反應(yīng)組分，將擴(kuò)增反應(yīng)的混合物放在管底，產(chǎn)物檢測的混合物放在管蓋，使整個(gè)反應(yīng)在一個(gè)管內(nèi)完成，減少了氣溶膠污染可能性和操作的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)通過使用一系列稀釋梯度和不同的冠狀病毒來驗(yàn)證其靈敏度和特異度，結(jié)果顯示該方法能夠在約50 min完成擴(kuò)增，并且這種方法還可以通過熒光讀板器直接讀取檢測結(jié)果，以實(shí)現(xiàn)高靈敏、高通量的新型冠狀病毒檢測。RPA恒溫?cái)U(kuò)增法對(duì)設(shè)備要求較低，適合于條件有限的急診科及診所等地的檢測。

4 展 望

作為能夠在常溫下完成核酸擴(kuò)增與檢測的技術(shù)，RPA在近些年得到了極大的發(fā)展。相對(duì)于PCR及其他恒溫?cái)U(kuò)增法，RPA具有靈敏度高、特異度高、操作簡單、反應(yīng)快速及對(duì)設(shè)備要求低等優(yōu)勢，更適合于條件簡陋的現(xiàn)場檢測。在靈敏度方面，RPA最低可檢測到標(biāo)本中的痕量級(jí)核酸(尤其是DNA)，將單個(gè)模板分子擴(kuò)增到可檢出水平；在特異度方面，該技術(shù)可從含有眾多來自不同物種的基因組DNA的標(biāo)本中識(shí)別并擴(kuò)增目的基因序列，具有較強(qiáng)的抗干擾能力。此外RPA在恒定的低溫(37～42 ℃最適宜)下也可以運(yùn)行。RPA對(duì)反應(yīng)條件的溫和性及擴(kuò)增的高效性使該技術(shù)非常適合于臨床早期快速診斷、食品檢測、疫情預(yù)防控制、工業(yè)應(yīng)用及現(xiàn)場實(shí)時(shí)檢測。另外，研究者在原有的優(yōu)勢上進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)，比如將RPA與CRISPR-Cas12a結(jié)合[33]或與rkdna-石墨烯氧化物(GO)探針系統(tǒng)相結(jié)合[34]，以提高RPA的靈敏度和特異度。還有與其他技術(shù)相結(jié)合的多重RPA技術(shù)，一次反應(yīng)檢測多種產(chǎn)物，極大提高了反應(yīng)效率[35]。當(dāng)然，作為一種發(fā)展時(shí)間較短的新興方法，RPA也有一定的局限性，比如至今還沒有開發(fā)出專門針對(duì)RPA引物和探針設(shè)計(jì)的軟件，只能使用PCR的軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)和篩選，導(dǎo)致無法對(duì)過短的核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增，但這并不能阻止研究者對(duì)RPA的研究探索，RPA的優(yōu)勢使它有望成為未來核酸擴(kuò)增的主流方法。