高佩云，楊曉蕓，王麗霞，蔣 彤，陳迎迎，陳曉旭，吳 桐，岳春雨，唐力英*，王祝舉*

炒制對(duì)牽牛子中酚酸類(lèi)成分含量的影響

高佩云1, 2，楊曉蕓2，王麗霞2，蔣 彤2，陳迎迎2，陳曉旭2，吳 桐2，岳春雨1, 2，唐力英2*，王祝舉2*

1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046 2. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700

建立牽牛子中6個(gè)酚酸類(lèi)成分（新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C）的HPLC含量測(cè)定方法，研究炒制前后牽牛子中這些成分的含量變化規(guī)律。采用HPLC法同時(shí)測(cè)定新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C的含量，運(yùn)用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析，并通過(guò)模擬炮制的方法對(duì)此類(lèi)成分在不同溫度下的轉(zhuǎn)化進(jìn)行初步研究。色譜條件為Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫（0～20 min，10%甲醇；20～25 min，10%～15%甲醇；25～45 min，15%甲醇；45～50 min，15%～30%甲醇；50～75 min，30%甲醇；75～80 min，30%～40%甲醇；80～110 min，40%甲醇），檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm，體積流量1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃。與生品比較，炒制后牽牛子中綠原酸的含量無(wú)明顯變化，新綠原酸、隱綠原酸和異綠原酸C在炒制后含量顯著上升；咖啡酸和異綠原酸A在炒制后含量顯著下降。層次聚類(lèi)分析（hierarchical cluster analysis，HCA）將30批樣品分為生品與炮制品2類(lèi)，主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）均標(biāo)記了4個(gè)差異性成分。各單體化合物在模擬炮制過(guò)程中發(fā)生了相互轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化程度與加熱溫度相關(guān)。牽牛子與炒牽牛子的化學(xué)成分含量發(fā)生了一定程度改變，其中新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C可作為牽牛子炒制前后質(zhì)量評(píng)價(jià)的關(guān)鍵性指標(biāo)，可為牽牛子與炒牽牛子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和深入研究提供科學(xué)依據(jù)。

牽牛子；HPLC；酚酸類(lèi)；清炒法；新綠原酸；綠原酸；咖啡酸；隱綠原酸；異綠原酸A；異綠原酸C；層次聚類(lèi)分析；主成分分析；正交偏最小二乘-判別分析；質(zhì)量評(píng)價(jià)

牽牛子始載于《名醫(yī)別錄》[1]，又名黑丑、白丑、二丑等。性寒，味苦，有毒。歸肺、腎、大腸經(jīng)。具有瀉水通便、消痰滌飲、殺蟲(chóng)攻積之功效，主要用于水腫脹滿、二便不通、痰飲積聚、氣逆喘咳、蟲(chóng)積腹痛等證[2]?，F(xiàn)代研究表明牽牛子主要化學(xué)成分為苯丙素類(lèi)、木脂素類(lèi)、香豆素類(lèi)、萜類(lèi)、生物堿、樹(shù)脂苷類(lèi)、脂肪油和糖類(lèi)等，并認(rèn)為牽牛子酚酸類(lèi)成分及樹(shù)脂苷類(lèi)成分可能是其主要活性成分[3]。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，牽牛子主要具有瀉下、利尿、興奮子宮、殺蟲(chóng)、抗菌、抗癌等藥理活性[4-6]。中醫(yī)本草及醫(yī)方書(shū)記載其“有毒”，現(xiàn)代研究認(rèn)為其中的生物堿和樹(shù)脂苷類(lèi)成分有一定神經(jīng)毒性和腎毒性[7-9]。牽牛子的炮制歷代曾用過(guò)水煮、清蒸及各種輔料蒸、清炒及各種輔料炒、以及各種藥汁制等10多種炮制方法[10]，現(xiàn)在沿用了清炒法作為《中國(guó)藥典》收載的炮制方法，認(rèn)為牽牛子生用偏于逐水消腫、殺蟲(chóng)，炮制后毒性降低[11-12]，藥性緩和，免傷正氣，并易于粉碎和煎出，以消食導(dǎo)滯見(jiàn)長(zhǎng)。

《中國(guó)藥典》2005年版曾采用咖啡酸和咖啡酸乙酯作為含量測(cè)定指標(biāo)控制牽牛子的質(zhì)量，隨后發(fā)現(xiàn)該方法存在一定問(wèn)題[13]，自《中國(guó)藥典》2010年版刪除了該方法，直到現(xiàn)在，沒(méi)有合適的定量方法控制質(zhì)量。目前，對(duì)此問(wèn)題有不少研究，但仍將指標(biāo)成分聚焦在咖啡酸上，由于咖啡酸在牽牛子中含量較低，不是理想的指標(biāo)性成分[14-16]。雖然有文獻(xiàn)對(duì)牽牛子中系列酚酸類(lèi)成分進(jìn)行了成分指認(rèn)或指紋圖譜等定性分析[17-18]，但尚無(wú)定量研究，炒制對(duì)此類(lèi)化學(xué)成分影響的研究也未見(jiàn)報(bào)道。牽牛子中綠原酸類(lèi)成分含量較高，能否選取該類(lèi)成分作為定量指標(biāo)控制牽牛子飲片的質(zhì)量呢？藥理學(xué)研究也表明綠原酸類(lèi)成分具有促進(jìn)胃排空、增加小腸推進(jìn)率、抗炎、免疫增強(qiáng)、興奮子宮作用[3]?；诖耍狙芯坎捎肏PLC法建立6個(gè)酚酸類(lèi)指標(biāo)成分的含量分析方法，并對(duì)15批不同產(chǎn)地生、炒牽牛子樣品進(jìn)行含量測(cè)定，采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法分析炒制前后各成分含量的變化，探索牽牛子炒制前后成分變化規(guī)律，為牽牛子飲片的質(zhì)量控制及炮制機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-20A型高效液相色譜儀儀，日本島津公司；DFT-50A型手提式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司；XS205DU型1/10萬(wàn)電子分析天平，瑞士Mettler-Toledo公司；BSA124S-CW型1/1萬(wàn)電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；JY-5002型電子天平，上海衡平儀器儀表廠；DK-S14型電熱恒溫水浴鍋，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 材料

對(duì)照品新綠原酸（批號(hào)CHB201129）、綠原酸（批號(hào)CHB201114）、咖啡酸（批號(hào)CHB201217）、隱綠原酸（批號(hào)CHB201129）、異綠原酸A（批號(hào)CHB180921）、異綠原酸C（批號(hào)CHB180925），均購(gòu)自成都克洛瑪生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%；水為娃哈哈純凈水；甲酸、甲醇均為色譜純，其他試劑均為分析純。

15批牽牛子藥材，產(chǎn)地分別為遼寧鐵嶺（編號(hào)Q1～Q5）、山東青州（編號(hào)Q6～Q8）、山東沂水（編號(hào)Q9～Q12）、河北（編號(hào)Q13～Q15），經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所王祝舉研究員鑒定為旋花科牽牛屬植物裂葉牽牛(L.) Choisy的干燥成熟種子。其中Q1～Q5為白丑，Q6～Q15為黑丑；編號(hào)Q6的牽牛子用于方法學(xué)考察用。

炒牽牛子為本實(shí)驗(yàn)室照清炒法［2020年版《中國(guó)藥典》（四部）通則0213］炮制，取牽牛子生品15份，每份200 g，照清炒法操作，文火炒至稍鼓起，有香氣，即得；炮制過(guò)程中，入鍋前鍋底溫度210 ℃，出鍋時(shí)飲片溫度150 ℃，炒制時(shí)間4 min。炒制后的牽牛子相應(yīng)編號(hào)為CQ1～CQ15。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫：0～20 min，10%甲醇；20～25 min，10%～15%甲醇；25～45 min，15%甲醇；45～50 min，15%～30%甲醇；50～75 min，30%甲醇；75～80 min，30%～40%甲醇；80～110 min，40%甲醇；檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm；體積流量1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30 ℃。對(duì)照品及部分樣品色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C對(duì)照品適量，加50%乙醇制成質(zhì)量濃度分別為19.4、880.0、15.88、140.8、129.2、71.4 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取不同產(chǎn)地牽牛子和炒牽牛子粉末（過(guò)三號(hào)篩，下同）約0.2 g，精密稱(chēng)定，分別置于具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇25 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，回流提取120 min，放冷，稱(chēng)定質(zhì)量，用50%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾紙濾過(guò)，取續(xù)濾液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 將“2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液稀釋2、5、10、25、50倍，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以各酚酸類(lèi)成分的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（）進(jìn)行線性回歸，得各成分的回歸方程和線性范圍，分別為新綠原酸＝2.677 2×108－771 9.119 7，＝0.999 9，線性范圍0.038 8～1.940 ng；綠原酸＝2.770 0×108－ 162 282.205 1，＝0.999 9，線性范圍1.760～88.000 ng；咖啡酸＝4.836 2×108－572 7.692 3，＝0.999 9，線性范圍0.031 76～1.588 ng；隱綠原酸＝2.153 7×108－343 07.658 1，＝0.999 9，線性范圍0.281 6～14.080 ng；異綠原酸A＝3.314 4×108－149 223.974 4，＝0.999 2，線性范圍0.258 4～12.920 ng；異綠原酸C＝3.116 4×108－56 569.307 7，＝0.999 6，線性范圍0.142 8～7.140 ng。

1-新綠原酸 2-綠原酸 3-咖啡酸 4-隱綠原酸 5-異綠原酸A 6-異綠原酸C

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取牽牛子（編號(hào)Q6）粉末適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C峰面積的RSD分別為1.0%、0.4%、2.0%、1.0%、0.7%、0.4%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批牽牛子（編號(hào)Q6）粉末，稱(chēng)取6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算樣品中新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.248 2、10.603 3、0.219 0、1.018 0、1.911 1、1.036 9 mg/g，RSD分別為2.5%、0.5%、2.9%、2.4%、1.0%、1.5%。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份牽牛子（編號(hào)Q6）粉末的供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算樣品中新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C峰面積的RSD分別為2.0%、0.7%、1.5%、1.5%、1.0%、0.6%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取牽牛子（編號(hào)Q6）粉末約0.2 g，精密稱(chēng)定，共6份，分別精密加入混合對(duì)照品溶液25 mL（新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C質(zhì)量濃度分別為2.0、85.6，1.7、8.2、14.6、7.9 μg/mL），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算上述成分的平均加樣回收率分別為85.11%（新綠原酸含量為0.248 2 mg/g，藥典規(guī)定含量為100 μg/g的成分加樣回收率可放寬限度至85%～110%）、100.91%、100.79%、92.23%、90.36%、97.65%，RSD分別為2.9%、1.7%、1.8%、2.2%、1.0%、1.2%，結(jié)果表明建立的含量測(cè)定方法準(zhǔn)確性良好。

2.5 樣品測(cè)定

取不同產(chǎn)地的牽牛子和炒牽牛子粉末適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算各成分含量，采用檢驗(yàn)對(duì)牽牛子炒制前后的成分含量進(jìn)行顯著性差異分析。結(jié)果顯示，首先觀察到黑丑和白丑樣本的差異，發(fā)現(xiàn)牽牛子和炒牽牛子中白丑的新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、異綠原酸C含量均高于黑丑。其次是牽牛子炒制前后的差異，發(fā)現(xiàn)牽牛子炒制后，新綠原酸、隱綠原酸和異綠原酸C在炒制后質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著上升（＜0.001），新綠原酸炒制前、后質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.20～0.47、0.50～0.96 mg/g，隱綠原酸炒制前、后質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.01～1.30、1.59～2.17 mg/g，異綠原酸C炒制前、后質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.93～1.46、1.55～1.88 mg/g。咖啡酸和異綠原酸A在炒制后質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著下降（＜0.01、0.001），咖啡酸炒制前、后質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.11～0.58、0.10～0.38 mg/g，異綠原酸A炒制前、后質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.78～2.08、1.46～1.69 mg/g。綠原酸含量在炒制前、后則無(wú)明顯變化，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。牽牛子炒制前、后含量變化見(jiàn)表2，結(jié)果表明，新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C有極其顯著的變化。

表1 不同牽牛子樣品中6個(gè)成分的含量測(cè)定(n = 2)

表2 牽牛子炒制前后6個(gè)化學(xué)成分含量變化(, n = 15)

與牽牛子比較：**＜0.01***＜0.001

**< 0.01***< 0.001

2.6 多元統(tǒng)計(jì)分析

為了探索牽牛子在炒制前后，酚酸類(lèi)成分的差異，對(duì)“2.5”項(xiàng)中含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。首先，對(duì)15批樣品進(jìn)行無(wú)監(jiān)督模式的層次聚類(lèi)分析（hierarchical cluster analysis，HCA），在牽牛子樣品是生品或炒品未知的情況下，根據(jù)樣品中酚酸類(lèi)成分的含量對(duì)樣本進(jìn)行分析。接著采用無(wú)監(jiān)督模式的主成分分析（principal component analysis，PCA），根據(jù)酚酸成分含量在主成分的載荷權(quán)重，篩選出差異較大的特征成分。此外，采用有監(jiān)督模式的偏最小二乘-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA），根據(jù)VIP值篩選出牽牛子和炒牽牛子的特征變量，進(jìn)而找出牽牛子炒制前后變化明顯的關(guān)鍵成分。

2.6.1 HCA 以牽牛子和炒牽牛子中的6個(gè)成分的含量為變量，利用SIMCA 14.1對(duì)含量測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)分析，見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示，30批樣品整體聚為2大類(lèi)，第1大類(lèi)包括樣品Q(chēng)1～Q15，均為生牽牛子，第2大類(lèi)包括樣品CQ1～CQ15，均為炒牽牛子，說(shuō)明牽牛子炒制前后樣品質(zhì)量存在明顯的差異。第1大類(lèi)可再分為Q1～Q5（白丑）和Q6～Q15（黑丑）2小類(lèi)，說(shuō)明黑丑和白丑之間此類(lèi)化學(xué)成分含量也有一定差異。而Q6～Q15又分成了Q6～Q12（山東）和Q13～Q15（河北）2類(lèi)，說(shuō)明不同產(chǎn)地的牽牛子質(zhì)量也存在差異。而第2大類(lèi)除CQ1外，各分類(lèi)情況與第1大類(lèi)相同。

圖2 不同牽牛子樣品的HCA

2.6.2 PCA 為進(jìn)一步探討牽牛子和炒牽牛子之間的差異，在HCA基礎(chǔ)上，對(duì)6個(gè)成分含量進(jìn)行PCA處理，模型參數(shù)為2（在軸方向上模型的解釋率）＝0.987，2（模型預(yù)測(cè)率）＝0.941，兩參數(shù)均接近于1表示模型擬合數(shù)據(jù)效果良好，得到以第1和第2主成分為變量的雙標(biāo)圖，見(jiàn)圖3。在這種無(wú)監(jiān)督的識(shí)別模式下，牽牛子樣品自動(dòng)聚為2類(lèi)，一類(lèi)（Q1～Q15）為牽牛子，在第II、III象限均有分布，另一類(lèi)（CQ1～CQ15）為炒牽牛子，主要集中在第I～I(xiàn)V象限。而白丑在第I、II象限，黑丑在第III、IV象限，表明白丑和黑丑各化學(xué)成分含量也發(fā)生了變化。第1、2主成分對(duì)區(qū)分這2類(lèi)的貢獻(xiàn)率分別為63.4%、27.2%，這2個(gè)主成分可以反應(yīng)全部信息的90.6%，說(shuō)明2個(gè)主成分可替代原來(lái)6個(gè)酚酸類(lèi)成分反映的樣品信息。在這2個(gè)主成分中的權(quán)重值之和越大表明該成分在牽牛子和炒牽牛子中差別越大。權(quán)重之和值超過(guò)1的成分是隱綠原酸、異綠原酸C、異綠原酸A、新綠原酸，權(quán)重之和分別為1.158 7、1.144 1、1.092 9、1.079 8，說(shuō)明這些成分是牽牛子炒制前后變化較大的成分。

2.6.3 PLS-DA 將6個(gè)成分含量數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-14.1中進(jìn)行有監(jiān)督模式的PLS-DA，獲得相應(yīng)的模型，結(jié)果見(jiàn)圖4，模型參數(shù)為R（在軸方向上模型的解釋率）0.916，R（在軸方向模型的解釋率）0.984，Q（模型預(yù)測(cè)率）0.931，均＞0.5，表明該模型穩(wěn)定可靠。牽牛子在第II、III象限而炒牽牛子在第I～I(xiàn)V象限，表明牽牛子和炒牽牛子2大類(lèi)差別顯著；而白丑在第III、IV象限，黑丑在第I、II象限，表明白丑和黑丑也差別明顯。為了衡量每個(gè)成分在牽牛子炒制前后的變化，結(jié)合變量重要性投影（variable importance projection，VIP）值對(duì)6個(gè)成分含量的VIP值大小進(jìn)行排列，見(jiàn)圖5。以VIP值＞1為標(biāo)準(zhǔn)，篩選炒制對(duì)牽牛子化學(xué)成分差異影響貢獻(xiàn)較大的化合物，結(jié)果隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、新綠原酸是引起牽牛子炒制前后質(zhì)量差異的主要潛在標(biāo)志性成分。該分析結(jié)果與HCA和PCA結(jié)果一致。

圖3 不同牽牛子樣品的PCA雙標(biāo)分析

圖4 不同牽牛子樣品的PLS-DA得分散點(diǎn)

1-新綠原酸 2-綠原酸 3-咖啡酸 4-隱綠原酸 5-異綠原酸A 6-異綠原酸C

結(jié)合化學(xué)計(jì)量法對(duì)牽牛子炒制前后的各成分含量進(jìn)行分析，結(jié)果表明炒制前后牽牛子中酚酸成分種類(lèi)沒(méi)有發(fā)生變化，但可以通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析方法發(fā)現(xiàn)其中變化較為明顯的成分以及黑丑白丑內(nèi)在化學(xué)成分的差別。

2.7 牽牛子炒制前后酚酸類(lèi)成分的變化規(guī)律考察

分析牽牛子中各成分含量變化的原因，可能是部分綠原酸類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，炒制過(guò)程中高溫使其結(jié)構(gòu)發(fā)生了轉(zhuǎn)化。為了驗(yàn)證以上推測(cè)，將新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C 6個(gè)單體化合物分別在不同溫度下（參考牽牛子炒制過(guò)程的溫度，并結(jié)合實(shí)際實(shí)驗(yàn)中各單體化合物發(fā)生轉(zhuǎn)化的溫度）加熱30 min，用50%乙醇溶解后，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖6～11。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①新綠原酸在200 ℃開(kāi)始裂解產(chǎn)生咖啡酸，轉(zhuǎn)化產(chǎn)生少量異綠原酸A和異綠原酸C，210 ℃新綠原酸完全裂解，色譜峰消失，可檢識(shí)到咖啡酸色譜峰等；②綠原酸在200 ℃開(kāi)始少量異構(gòu)化為隱綠原酸；③咖啡酸在180 ℃加熱后，在260 nm波長(zhǎng)下檢識(shí)到生成了新的化合物，且隨著溫度升高，在200 ℃時(shí)全部轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化成的新化合物經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)，可能為2分子咖啡酸脫羧后聚合產(chǎn)生1對(duì)/為271.099 4 [M－H]?的順?lè)串悩?gòu)體，其結(jié)構(gòu)如圖12所示；④隱綠原酸隨著溫度升高異構(gòu)化產(chǎn)生新綠原酸和綠原酸，并逐漸裂解產(chǎn)生咖啡酸，也轉(zhuǎn)化產(chǎn)生少量異綠原酸C，在210 ℃隱綠原酸完全裂解，色譜峰消失，可檢識(shí)到咖啡酸色譜峰等；⑤異綠原酸A隨著溫度的升高轉(zhuǎn)化為異綠原酸C越來(lái)越多，也轉(zhuǎn)化為少量綠原酸，在210 ℃異綠原酸A完全裂解，色譜峰消失，可檢識(shí)到咖啡酸色譜峰等；⑥異綠原酸C隨著溫度升高逐漸異構(gòu)化產(chǎn)生異綠原酸A，也轉(zhuǎn)化為少量綠原酸和咖啡酸。此外，除咖啡酸外的5個(gè)綠原酸類(lèi)成分經(jīng)過(guò)高溫加熱分解后，都可以在55～60 min檢識(shí)到的1組色譜峰，以新綠原酸為例，210 ℃加熱后的產(chǎn)物經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)，可能是/為367.105 6 [M－H]?的3種同分異構(gòu)體和/為335.079 1 [M－H]?的4種同分異構(gòu)體的混合物，從質(zhì)譜圖中雖然可以看出幾種化合物均含有咖啡酸片段，但由于二級(jí)質(zhì)譜差別較大，無(wú)法得出準(zhǔn)確結(jié)構(gòu)。新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸為同分異構(gòu)體，由1分子咖啡酸和1分子奎寧酸組成，異綠原酸A和異綠原酸C為同分異構(gòu)體，由2分子咖啡酸和1分子奎寧酸組成，在一定溫度下這些同分異構(gòu)體之間可以發(fā)生裂解、重排等反應(yīng)，導(dǎo)致異構(gòu)化，從而相互轉(zhuǎn)化。

1-新綠原酸 3-咖啡酸 5-異綠原酸A 6-異綠原酸C

2-綠原酸 4-隱綠原酸

3-咖啡酸

1-新綠原酸 2-綠原酸 3-咖啡酸 4-隱綠原酸 6-異綠原酸C

2-綠原酸 3-咖啡酸 5-異綠原酸A 6-異綠原酸C

3 討論

本研究建立6個(gè)酚酸類(lèi)指標(biāo)成分的HPLC含量分析方法，并對(duì)15批不同產(chǎn)地生、炒牽牛子樣品進(jìn)行含量分析，結(jié)果顯示，炒制對(duì)6個(gè)酚酸類(lèi)成分的影響是不一致的。綠原酸的含量比較穩(wěn)定，其含量變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而新綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C的含量則發(fā)生了顯著變化。新綠原酸、隱綠原酸和異綠原酸C的質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均升高125.20%、61.66%、45.95%（以每批樣品含量變化率的平均值計(jì)算，下同）；咖啡酸和異綠原酸A的質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均降低23.04%、18.58%，可見(jiàn)炒制對(duì)牽牛子中除綠原酸外的其他酚酸類(lèi)成分有較大影響。多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C是牽牛子炒制前后酚酸類(lèi)成分中變化較為明顯的成分，可作為牽牛子炒制前后質(zhì)量評(píng)價(jià)的關(guān)鍵性指標(biāo)。

2-綠原酸 3-咖啡酸 5-異綠原酸A 6-異綠原酸C

圖12 咖啡酸200 ℃加熱后可能產(chǎn)生的2個(gè)化合物

從上述單體酚酸化合物在高溫下的轉(zhuǎn)化規(guī)律，可以初步解釋牽牛子在炒制過(guò)程中各成分變化的原因。新綠原酸含量升高可能是隱綠原酸轉(zhuǎn)化為新綠原酸更為容易（130 ℃就可以發(fā)生裂解）；綠原酸相對(duì)穩(wěn)定，故含量沒(méi)有顯著變化；咖啡酸在高溫條件（高于180 ℃）下，也可以發(fā)生裂解反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為其他成分，含量降低；綠原酸在達(dá)到200 ℃以上后可以轉(zhuǎn)化為少量隱綠原酸，導(dǎo)致隱綠原酸含量升高；隨溫度升高，異綠原酸A向異綠原酸C轉(zhuǎn)化更為明顯，導(dǎo)致異綠原酸C含量升高，異綠原酸A含量降低。但牽牛子中成分復(fù)雜，在炒制過(guò)程中發(fā)生變化或轉(zhuǎn)化的成分絕非僅限于檢測(cè)的幾個(gè)，可能存在未能檢測(cè)到的其他酚酸類(lèi)成分之間進(jìn)行轉(zhuǎn)化，所以，最后看到的各成分的變化幅度是一個(gè)綜合的結(jié)果；另外，從上面單體成分實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，各成分之間的轉(zhuǎn)化與炒制時(shí)的溫度也有很大關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)在確定供試品溶液的制備方法時(shí)，考察了提取方式和提取溶劑對(duì)牽牛子不同成分含量的影響。結(jié)果選擇提取溶劑時(shí)，甲醇制備的樣品不穩(wěn)定，久置或冷藏會(huì)析出絮狀物或難溶物，經(jīng)分離鑒定為脂肪酸類(lèi)化合物，而乙醇制備的樣品較穩(wěn)定；回流提取6個(gè)指標(biāo)性成分的含量均略高于超聲提取法；選擇不同體積分?jǐn)?shù)乙醇（50%、70%、90%、100%）提取時(shí)，50%乙醇對(duì)各成分均具有較好的提取效果且樣品穩(wěn)定，選擇不同回流時(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0 h）提取時(shí)，提取2.0 h各成分含量較高，故確定了“2.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法。

本實(shí)驗(yàn)建立的6種酚酸類(lèi)成分含量測(cè)定方法，可為牽牛子及炒牽牛子的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供有益借鑒，初步揭示了牽牛子炒制前后化學(xué)成分的含量變化規(guī)律，可為牽牛子及炒牽牛子的質(zhì)量評(píng)價(jià)和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effects of stir-frying on content of phenolic acids in

GAO Pei-yun1, 2, YANG Xiao-yun2, WANG Li-xia2, JIANG Tong2, CHEN Ying-ying2, CHEN Xiao-xu2, WU Tong2, YUE Chun-yu1, 2, TANG Li-ying2, WANG Zhu-ju2

1. College of Pharmacy, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China 2. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China

To establish the HPLC method for the determination of six phenolic acids (neochlorogenic acid, chlorogenic acid, caffeic acid, cryptochlorogenic acid, isochlorogenic acid A, and isochlorogenic acid C) in Qianniuzi () and to study the content changes of the compounds inbefore and after stir-frying.The contents of neochlorogenic acid, chlorogenic acid, caffeic acid, cryptochlorogenic acid, isochlorogenic acid A, and isochlorogenic acid C were determined simultaneously by HPLC, and analyzed by chemometrics. The conversions among them at different temperatures were preliminary studied by simulated processing method. Kromasil C18(250 mm × 4.6 mm, 5 μm) was employed, and the mobile phase was methanol-0.1% formic acid aqueous solution for gradient elution (0—20 min, 10% methanol; 20—25 min, 10%—15% methanol; 25—45 min, 15% methanol; 45—50 min, 15%—30% methanol; 50—75 min, 30% methanol; 75—80 min, 30%—40% methanol; 80—110 min, 40% methanol). The detection wavelength was set at 330 nm, flow rate was 1 mL/min, the injection volume was 10 μL, and the column temperature was 30 ℃.Compared with raw, the content of chlorogenic acid had no significant change after processing, while the contents of neochlorogenic, cryptochlorogenic acid and isochlorogenic acid C were increased significantly. And the contents of caffeic acid and isochlorogenic acid A were decreased significantly. The 30 batches ofwere divided into two categories, raw and processed products, by hierarchical cluster analysis (HCA). Four components that caused the differences were marked by principal component analysis (PCA) and partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA). Six monomers transformed into each other in the process of simulated processing, and the degree of transformation was related to temperature.The contents of chemical components inand friedhave changed to a certain extent. Among them, neochlorogenic acid, cryptochlorogenic acid, isochlorogenic acid A and isochlorogenic acid C can be used as the key indicators for quality evaluation ofbefore and after processing. It can provide a scientific basis for the establishment and in-depth study of quality standards forand fried

; HPLC; phenolic acids; stir-fried method;neochlorogenic acid; chlorogenic acid; caffeic acid; cryptochlorogenic acid; isochlorogenic acid A; isochlorogenic acid C; hierarchical cluster analysis; principal component analysis; partial least squares-discriminant analysis; quality evaluation

R283.1

A

0253 - 2670(2022)24 - 7721 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.24.010

2022-06-28

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2018YFC1707106）；山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021SFGC1202）

高佩云（1997—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)轱嬈瘜W(xué)成分及炮制原理。E-mail: gaopeiyun78@163.com

唐力英，副研究員，從事飲片化學(xué)成分及炮制原理研究。E-mail: bjtangliying@163.com

王祝舉，研究員，從事飲片化學(xué)成分及炮制原理研究。E-mail: wangzhuju@sina.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]