殷凱楠, 吳酬飛, 尹良鴻*,, 林海萍*,

(1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 生物農(nóng)藥高效制備技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，浙江 臨安 311300；2. 湖州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 湖州 313000)

赤霉酸 (gibberellic acid，GA) 是一類天然植物生長調(diào)節(jié)劑，具有提高種子發(fā)芽率、促進(jìn)植株生長和調(diào)節(jié)開花等重要作用，同時(shí)具有綠色環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)，因而一直以來備受關(guān)注，市場需求日益增大，產(chǎn)量急需提高。國內(nèi)外赤霉酸的研究已有較長的歷史[1]。近年來，隨著赤霉酸的結(jié)構(gòu)和功能被逐漸認(rèn)識(shí)，赤霉酸合成途徑和關(guān)鍵酶得到了更全面的闡釋[2-3]，如何通過微生物高效生產(chǎn)赤霉酸日益成為學(xué)者們的關(guān)注重點(diǎn)。眾多研究人員在此基礎(chǔ)上提出了基于培養(yǎng)基組成、發(fā)酵條件控制、菌種分子改造等生產(chǎn)優(yōu)化策略，顯著提高了赤霉酸的產(chǎn)量，但目前國內(nèi)外大部分研究成果還不能實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)地掌握細(xì)胞內(nèi)赤霉酸代謝途徑的變化。

代謝組學(xué)作為一項(xiàng)新興技術(shù)已在微生物[4-5]、植物[6-7]、中醫(yī)[8-9]、食品工程[10-11]、疾病診斷[12-13]、藥物毒性和機(jī)理[14-15]等研究領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，并取得了重要成果。但基于代謝組學(xué)技術(shù)分析，實(shí)現(xiàn)微生物體內(nèi)赤霉酸高效合成的研究還鮮見報(bào)道。近年來，隨著高通量測序、基因編輯等技術(shù)的快速發(fā)展，特別是代謝組學(xué)技術(shù)的日益成熟，為研究赤霉酸的動(dòng)態(tài)合成提供了新的方法與思路，利用代謝組學(xué)探究赤霉酸的合成機(jī)理具有巨大潛力，可為提高赤霉酸發(fā)酵產(chǎn)量提供新路徑。本論文綜述了基于代謝組學(xué)的赤霉酸生物合成國內(nèi)外研究進(jìn)展，通過代謝組學(xué)分析技術(shù)，探究藤倉赤霉菌Gibberella fujikuroi赤霉酸高效合成的機(jī)理，旨在為提高赤霉酸產(chǎn)量提供新的研究與應(yīng)用思路。

1 赤霉酸概述

1.1 赤霉酸種類

赤霉酸是一類四環(huán)雙萜羧酸化合物，可由綠色植物、真菌和細(xì)菌產(chǎn)生，與生長素、脫落酸、細(xì)胞分裂素、乙烯合稱植物五大激素。赤霉酸自1935 年首次被發(fā)現(xiàn)以來，至今已鑒定出136 種不同結(jié)構(gòu)的GA，按照發(fā)現(xiàn)的先后順序依次命名為GA1、GA2……GA136，統(tǒng)稱赤霉酸類 (GAs)，其中具有生物活性的赤霉酸主要有GA1、GA2、GA3、GA4、GA7等[16]。赤霉酸是植物激素中種類最多的一種，而且在同一植物中往往出現(xiàn)多種赤霉酸并存的現(xiàn)象。

1.2 赤霉酸生產(chǎn)菌種

藤倉赤霉菌為當(dāng)前工業(yè)上生產(chǎn)赤霉酸的主要菌種，是隸屬于真菌界 (Fungi)、子囊菌門 (Ascomycota)、子囊菌綱 (Ascomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、肉座菌科 (Hypocreaceae)、赤霉菌屬 (Gibberella) 的一種絲狀真菌。菌絲生長最適條件為25～28 ℃。子囊呈圓筒形，內(nèi)含4～8 個(gè)無色橢圓形子囊孢子。有大小兩型分生孢子，以小型為主，呈卵形、橢圓形或紡錘形，無色，一般無隔，于分生孢子梗上簇生成球狀；大型分生孢子呈鐮刀形，無色，有3～5 個(gè)隔；產(chǎn)孢細(xì)胞單復(fù)梗并存[17]。

1935 年，赤霉酸首次在藤倉赤霉菌發(fā)酵液中被分離出來。隨后，在多種真菌和細(xì)菌中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了赤霉酸，如Khan 等[18]在篩草Carex kobomugi根部分離出一株毛竹基腐病菌Arthrinium phaeospermum，發(fā)現(xiàn)其能產(chǎn)生多種活性赤霉酸，但產(chǎn)量很低，均在10 ng/mL 以下。Kang 等[19]從土壤中分離得到一株乙酸鈣不動(dòng)桿菌Acinetobacter calcoaceticus，發(fā)現(xiàn)其具有生產(chǎn)赤霉酸和溶解磷酸鹽的能力，但產(chǎn)量更低，其中具有生物活性的GA1、GA3和GA4產(chǎn)量僅分別為0.45、6.2 和2.8 ng/100 mL。因此其他菌種無法滿足赤霉酸工業(yè)化生產(chǎn)要求，而由藤倉赤霉菌生產(chǎn)的GA3產(chǎn)量可達(dá)1 000～1 200 mg/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他可生產(chǎn)赤霉酸的菌種，因此藤倉赤霉菌具有廣闊的應(yīng)用前景。

為進(jìn)一步提高藤倉赤霉菌的商業(yè)價(jià)值，國內(nèi)外學(xué)者紛紛開展菌株改造，以期獲得赤霉酸產(chǎn)量更高的優(yōu)質(zhì)菌株。1960 年，科研人員首次將自然界分離得到的產(chǎn)赤霉酸與不產(chǎn)赤霉酸藤倉赤霉菌的菌株進(jìn)行雜交，獲得了產(chǎn)赤霉酸種類和產(chǎn)量均不同的雜交菌株[20]。Candau 等[21]利用亞硝基胍誘變手段得到了能大量積累GA7卻不產(chǎn)生GA4的突變菌株。20 世紀(jì)70 年代，國內(nèi)通過發(fā)酵生產(chǎn)赤霉酸的開創(chuàng)者“九二零菌種選育協(xié)作組”篩選出了高產(chǎn)變種“4303”，成為當(dāng)時(shí)國內(nèi)赤霉酸工業(yè)化生產(chǎn)的主要菌株。李武軍等[22]通過原生質(zhì)體誘變，獲得了可將赤霉酸產(chǎn)量提高25%以上的突變菌株。這些研究成果使藤倉赤霉菌生成赤霉酸的優(yōu)勢更加突出。

1.3 赤霉酸生產(chǎn)

赤霉酸的生產(chǎn)方法主要有3 種，分別為植物提取、化學(xué)合成和微生物發(fā)酵。雖然多數(shù)植物都可以合成赤霉酸，但是提取率很低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)需求；而化學(xué)合成法存在成本高、效率低、污染大等缺點(diǎn)。因此，赤霉酸的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)主要通過微生物發(fā)酵法進(jìn)行。目前應(yīng)用最廣泛的赤霉酸為GA3，工業(yè)生產(chǎn)菌種主要是藤倉赤霉菌[23]，國內(nèi)GA3的工業(yè)化產(chǎn)量為1 200～2 000 mg/L，而國外采用液態(tài)深層發(fā)酵，GA3產(chǎn)量可達(dá)3 900 mg/L。與GA3相比，新型赤霉酸GA4能打破植物休眠，但不影響植物抗倒伏性，也不會(huì)造成植物果皮破裂，對(duì)蘋果樹大小年的調(diào)節(jié)和緩解蘋果褐銹病十分有效[24-25]，因此GA4具有更優(yōu)的功能和更廣闊的應(yīng)用前景。通過發(fā)酵條件優(yōu)化可有效提高GA4的合成效率，但增幅較為有限[26]。隨著赤霉酸的廣泛應(yīng)用，對(duì)其需求也日益增長，目前的發(fā)酵產(chǎn)量已不能滿足市場需求，因此探究提高赤霉酸產(chǎn)量的策略迫在眉睫[27-28]。

1.4 赤霉酸的應(yīng)用

赤霉酸在生物體內(nèi)起著內(nèi)源性激素的作用，能調(diào)節(jié)多種植物的生長發(fā)育，廣泛應(yīng)用于蔬菜、水果、糧食作物等打破種子休眠、緩解逆境脅迫、提高抗倒伏性及保花保果等方面。在農(nóng)林業(yè)、釀造業(yè)，特別是糧食生產(chǎn)等領(lǐng)域創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟(jì)效益與社會(huì)效益。

1.4.1 打破種子休眠 種子休眠是指有活力的種子在適宜的溫度、水分等萌發(fā)條件下仍不發(fā)芽的現(xiàn)象，種子過度休眠，會(huì)影響萌發(fā)率或造成萌發(fā)推遲。有研究表明，赤霉酸可以解除種子休眠，促進(jìn)種子萌發(fā)[29]。DELLA 蛋白家族是赤霉酸信號(hào)途徑中的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子，可抑制赤霉酸途徑的基因表達(dá)從而抑制種子發(fā)芽，但這種抑制作用可以被外源赤霉酸解除[30]。此外，一定濃度的赤霉酸對(duì)種皮的蠟質(zhì)層具有腐蝕作用，浸種后能提高種皮的透水、透氣性，增強(qiáng)種子內(nèi)生理生化過程與呼吸作用，促進(jìn)胚生長，從而能促進(jìn)種子萌發(fā)[31]。劉彩紅等[32]發(fā)現(xiàn)，用300 μg/g 的赤霉酸溶液浸泡吉生羊草Leymus chinensis種子48 h，能有效促進(jìn)種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢和活力指數(shù)，并使幼苗高度有效增長。聶瑩瑩等[33]用不同濃度的赤霉酸溶液處理呼倫貝爾黃花苜蓿Medicago sativa種子，發(fā)現(xiàn)其發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽速率以及根長隨著赤霉酸濃度的增加而增加，當(dāng)赤霉酸質(zhì)量濃度為200 mg/L 時(shí)效果最好。此外，對(duì)于需要光照和低溫才能萌發(fā)的種子，赤霉酸可代替光照和低溫打破休眠，這是因?yàn)槌嗝顾峥商岣吲邇?nèi)酶如α-淀粉酶、蛋白酶等水解酶的活性和代謝活動(dòng)，催化種子內(nèi)貯藏物質(zhì)的降解，以供胚胎的生長發(fā)育[34]。K?pczyński等[35]通過對(duì)野生燕麥Avena fatua的研究，發(fā)現(xiàn)赤霉酸影響了野生燕麥種子萌發(fā)過程中α-淀粉酶的活性，提高了種子的萌發(fā)率。李振華[36]研究發(fā)現(xiàn)，萌發(fā)過程需要光照的煙草Nicotiana tabacum種子，通過赤霉酸處理，可代替光照從而促進(jìn)休眠的煙草種子萌發(fā)。牡丹Paeonia suffruticosa植株上的芽在深秋即進(jìn)入休眠狀態(tài)，必須要經(jīng)過一段時(shí)間的低溫才能打破休眠而萌發(fā)，而以500～1 000 mg/L 的GA3處理3～4 次，解除花芽休眠的有效率在90%以上，可大大縮短發(fā)芽時(shí)間，提高發(fā)芽率[37]。

1.4.2 緩解逆境脅迫 當(dāng)植物受到逆境脅迫時(shí)，赤霉酸可以有效緩解逆境帶來的危害。例如，當(dāng)植物受到干旱等外界脅迫時(shí)，光合作用會(huì)受到嚴(yán)重抑制，導(dǎo)致光合速率下降[38]。高等植物內(nèi)源赤霉酸水平與光合活性呈正相關(guān)，提高內(nèi)源赤霉酸水平能提升光合活性[39]。同時(shí)，大量研究表明，通過施加外源赤霉酸，可以使葉片的葉綠素含量、光合速率等一系列指標(biāo)有不同程度的提高，以達(dá)到增強(qiáng)植物光合作用的目的[40]。劉文婷[41]用赤霉酸處理葦狀羊茅Festuca arundinacea，其葉綠素含量顯著高于干旱脅迫下的對(duì)照組，最高增加了25.77%。郝鵬等[42]用1 mg/L 的赤霉酸處理辣椒Capsicum annuum幼苗，發(fā)現(xiàn)處理組葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量顯著高于空白組。研究發(fā)現(xiàn)，外源赤霉酸可通過提高活性氧清除劑超氧化物歧化酶 (SOD) 和過氧化氫酶 (CAT) 的活性調(diào)節(jié)脂質(zhì)過氧化，從而抑制植株衰老[43]。外源噴施赤霉酸后，植株體內(nèi)丙二醛 (MDA) 的含量顯著降低，有效阻止了活性氧自由基對(duì)保護(hù)酶的破壞，延緩了膜系統(tǒng)的衰老[44]。石全梅[45]發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫條件下，通過對(duì)藥用丹參Salvia miltiorrhiza外源施用GA3能顯著緩解鹽脅迫對(duì)幼苗的傷害，其原因是GA3可以顯著提高葉片中CAT、SOD等抗氧化酶活性，使葉片中MDA 含量下降，從而有效緩解膜脂過氧化過程，提高植物抗鹽性。

1.4.3 提高抗倒伏性 有報(bào)道稱赤霉酸可通過增加側(cè)根的數(shù)量與植株的節(jié)間距以促進(jìn)作物抗倒伏能力[46]。高建芹等[47]在油菜Brassica napus幼苗期噴施赤霉酸，發(fā)現(xiàn)可以有效降低油菜株高，而且其根頸加粗，根干質(zhì)量和單位長度莖稈干質(zhì)量增加，植株抗倒能力增強(qiáng)。張大雷[48]研究表明，在分蘗盛期噴施赤霉酸，拔節(jié)期噴施多效唑能在不影響其產(chǎn)量的情況下顯著增加水稻Oryza sativa的抗倒伏性。有研究表明，GA4增強(qiáng)植物抗倒伏性作用顯著優(yōu)于GA3，這是因?yàn)镚A4在打破植物休眠的同時(shí)不會(huì)引發(fā)胚軸的過度生長[49]。樊炎迪[50]在利用GA3和GA4處理鐵皮石斛Dendrobium officinale時(shí)發(fā)現(xiàn)，GA3僅能促進(jìn)其縱向伸長，而GA4在保證其正常縱向生長的同時(shí)增加了莖粗，從而提高了抗倒伏性。

2 代謝組學(xué)研究進(jìn)展

2.1 代謝組學(xué)概念

代謝組學(xué)產(chǎn)生于20 世紀(jì)90 年代中期，是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)這3 大組學(xué)后的又一新型組學(xué)技術(shù)，作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，代謝組學(xué)是3 大組學(xué)的延伸和補(bǔ)充。代謝組學(xué)概念最初由英國帝國理工大學(xué)J. Nicholson于1999 年提出，他認(rèn)為人體作為一個(gè)完整的系統(tǒng)，機(jī)體的生理病理過程應(yīng)該作為一個(gè)動(dòng)態(tài)的系統(tǒng)來進(jìn)行研究，并且將代謝組學(xué)定義為生物體對(duì)病理生理或基因修飾等刺激產(chǎn)生的代謝物質(zhì)動(dòng)態(tài)應(yīng)答的定量變化[51]。但德國學(xué)者Fiehn 在2000 年卻提出了不同的觀點(diǎn)，他認(rèn)為代謝組學(xué)中代謝物的定性和定量研究應(yīng)處于靜止?fàn)顟B(tài)[52]。雖然兩位學(xué)者的觀點(diǎn)有所差異，但在后續(xù)的實(shí)際研究和應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)二者的觀點(diǎn)存在相似之處和互相借鑒的現(xiàn)象。

2.2 代謝組學(xué)優(yōu)點(diǎn)

代謝組學(xué)是通過現(xiàn)代分析技術(shù)對(duì)生物體內(nèi)的小分子代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析，可以直觀反映細(xì)胞內(nèi)生理生化動(dòng)態(tài)過程，從而探究細(xì)胞內(nèi)生化途徑，揭示生命現(xiàn)象的內(nèi)在規(guī)律[53-55]。與其他組學(xué)相比，代謝組學(xué)處于系統(tǒng)生物學(xué)的最下游，在各種組學(xué)研究中最接近表型。除了遺傳因素，培養(yǎng)基組分與培養(yǎng)條件的變化均會(huì)影響菌體合成代謝過程中關(guān)鍵基因及酶的變化，從而直接或間接影響相關(guān)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量[56]。同時(shí)，這些代謝產(chǎn)物又會(huì)對(duì)細(xì)胞的基因表達(dá)、菌體生長等產(chǎn)生影響。

與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及蛋白組學(xué)等其他組學(xué)相比，代謝組學(xué)具有以下優(yōu)點(diǎn)：基因、蛋白等微小的變化會(huì)通過最終的代謝物得以體現(xiàn)和放大，可以更加直觀地觀測到結(jié)果；省去了工作量巨大的全基因測序、建立大量表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫等流程；代謝物的種類遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于基因和蛋白的數(shù)量，使得測定和分析更為便利；通過對(duì)生物體的代謝物分析可了解機(jī)體系統(tǒng)的生理或病理狀態(tài)；通過生物體在各種內(nèi)外環(huán)境擾動(dòng)后的不同應(yīng)答，可以區(qū)分同種不同個(gè)體之間的表型差異；代謝組學(xué)以其高靈敏度、高分辨率、高通量的技術(shù)特點(diǎn)以及無創(chuàng)、便于實(shí)施等優(yōu)點(diǎn)在癌癥等醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[57]。

2.3 代謝組學(xué)研究方法

根據(jù)研究目的不同，代謝組學(xué)可分為非靶向、靶向和廣泛靶向3 種[58-59]。

非靶向代謝組學(xué)是一種對(duì)有機(jī)體內(nèi)的代謝物進(jìn)行全面和無偏向的分析方法，具有檢測物質(zhì)的信息量大、覆蓋面廣等優(yōu)點(diǎn)。但是，由于標(biāo)準(zhǔn)品缺乏，非靶向代謝組學(xué)可能會(huì)產(chǎn)生假陽性信號(hào)，造成重復(fù)性差且不能定量的結(jié)果[60]。在非靶向代謝組學(xué)中目前常用的研究方法主要有兩類。第1 類為核磁共振技術(shù) (nuclear magnetic resonance,NMR)。由于NMR 可深入物質(zhì)內(nèi)部而不破壞樣品，并具有迅速、準(zhǔn)確、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)而得以迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，但NMR 檢測靈敏度相對(duì)較低、動(dòng)態(tài)范圍有限、只能鑒別出很少一部分代謝物，且很難同時(shí)測定生物體系中共存的濃度相差較大的代謝物[61-63]。第2 類為色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，包含氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 (gas chromatographymass spectrometry, GC-MS) 和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatograph-spectrometry, LC-MS) 以及毛細(xì)管電泳和質(zhì)譜聯(lián)用 (capillary electrophoresismass spectrometry, CE-MS)。GC-MS 的優(yōu)勢在于具有較高的分辨率和檢測靈敏度，并且有可供參考與比較的標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫，可以方便地得到待分析代謝組分的定性結(jié)果，但GC-MS 只能對(duì)樣品中的揮發(fā)性組分進(jìn)行分析，無法得到難揮發(fā)的代謝組分信息，因此局限性也很明顯[64-66]。與GC-MS 技術(shù)相比，LC-MS 不需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生化預(yù)處理，并且適用于熱不穩(wěn)定、不易揮發(fā)且相對(duì)分子質(zhì)量較大的物質(zhì)，這些優(yōu)點(diǎn)都使LC-MS 技術(shù)的應(yīng)用頻率大大提高。而CE-MS 技術(shù)具有分離效率高、分析時(shí)間短、樣品需要量少且一般不需要進(jìn)行樣品預(yù)處理等優(yōu)勢，但是其檢測靈敏度較低，且主要只能用于分析氨基酸、有機(jī)酸等極性帶電化合物[67]。

靶向代謝組學(xué)主要是通過標(biāo)準(zhǔn)品或同位素內(nèi)標(biāo)對(duì)有機(jī)體內(nèi)特定的一類代謝物進(jìn)行定性或定量分析。相比于非靶向，靶向代謝組學(xué)關(guān)注特定種類的代謝物，所以可以對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行準(zhǔn)確定性和絕對(duì)定量，具有較好的重復(fù)性和靈敏度，而且數(shù)據(jù)分析比非靶向更簡單。但是，靶向代謝組學(xué)通量相對(duì)較低且需要購買標(biāo)準(zhǔn)品[68]。在使用方法和數(shù)據(jù)庫應(yīng)用方面，靶向和非靶向代謝組學(xué)相似[69]。

廣泛靶向代謝組學(xué)結(jié)合了非靶向檢測的廣譜性和靶向檢測的準(zhǔn)確性，主要通過多反應(yīng)監(jiān)測技術(shù) (multiple reaction monitoring, MRM) 采集數(shù)據(jù)，并建立數(shù)據(jù)庫來實(shí)現(xiàn)對(duì)代謝物的精確定性與定量[70]。廣泛靶向代謝組學(xué)整合了非靶向和靶向代謝組學(xué)的優(yōu)點(diǎn)，具有通量高和定性準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。但是，它的應(yīng)用需要自建數(shù)據(jù)庫，由于生物體內(nèi)代謝物種類的復(fù)雜性和多樣性，數(shù)據(jù)庫并不能覆蓋生物體內(nèi)所有的代謝物[71]。

代謝產(chǎn)物經(jīng)過檢測、分析與鑒定后，需進(jìn)行后期數(shù)據(jù)分析處理。為了降低誤差，提高數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性，需要對(duì)采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化或標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)處理，其中應(yīng)用最多的是主成分分析 (principal component analysis, PCA) 和偏最小二乘-顯著性分析聯(lián)合法 (partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)。當(dāng)PLS-DA 無法很好區(qū)分不同組別的樣品時(shí)，還可以用正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis, OPLS-DA)[72-74]。同時(shí)根據(jù)相應(yīng)的代謝物或代謝途徑數(shù)據(jù)庫如MassBank、KEGG 等查找相應(yīng)數(shù)據(jù)，最后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析[75]。

2.4 代謝組學(xué)中赤霉酸的測定

赤霉酸作為自然界中種類最多的一類植物激素，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上具有共同的基本骨架，即赤霉烷。各種赤霉酸的結(jié)構(gòu)非常相似，僅在羧基數(shù)目和位置上有差異，但卻具有不同的生物活性，在生物體內(nèi)的作用也大不相同。因此，對(duì)不同種類的赤霉酸建立準(zhǔn)確、可靠的定性、定量測定方法十分重要。

儀器聯(lián)用已成為色譜分析技術(shù)的發(fā)展趨勢，其中最常用的是色譜分離技術(shù)與質(zhì)譜聯(lián)用[76]。在代謝組學(xué)研究中，為了快速高效地測定赤霉酸，通常選擇高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 (high performance liquid chromatograph-mass spectrometry, HPLCMS)技術(shù)。1997 年，Castillo 等[77]首次建立了微生物發(fā)酵液中赤霉酸含量測定的反向高效液相色譜法。該技術(shù)既有高效液相色譜分離能力強(qiáng)、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，又避免了氣相色譜繁瑣的衍生化，同時(shí)兼具質(zhì)譜法的靈敏和準(zhǔn)確，因此是目前檢測復(fù)雜體系中赤霉酸含量最常用的方法[78-79]。近年來，HPLC-MS 被廣泛應(yīng)用于蔬菜、水果、茶葉、保健品等產(chǎn)品中赤霉酸的測定，一般采用非靶向代謝組學(xué)和高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法[80-83]，李偉等[84]研究了超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法測定松花粉中赤霉酸的含量，取得了較好的測定效果。

3 代謝組學(xué)在赤霉酸生物合成中的應(yīng)用

由藤倉赤霉菌發(fā)酵生產(chǎn)赤霉酸的生物合成途徑及中間代謝產(chǎn)物已較為清晰，主要可分為3 個(gè)階段：上游部分由乙酰輔酶A (acetyl-coA)合成二萜類化合物的共同前體牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphat, GGPP)；中游部分GGPP 通過烯萜合成酶 (terpene synthases, TPSs) 的催化形成GA12醛；下游部分GA12醛通過P450單加氧酶 (cytochrome P450 monooxygenases, P450s)的一系列氧化形成赤霉酸[85]。

3.1 基因改造對(duì)赤霉酸合成的影響

基因改造對(duì)某些微生物表型特征的影響并不明顯，而利用代謝組學(xué)能有效地探測基因改造引起的變化。近年來，藤倉鐮刀菌Fusarium fujikuroi和擬南芥Arabidopsis thaliana中的赤霉酸生物合成基因已被克隆出來，研究表明，盡管它們能產(chǎn)生相同的赤霉酸，但高等植物和真菌合成赤霉酸的途徑并不完全相同，而且與赤霉酸合成相關(guān)的基因在高等植物和真菌中也存在差異[86]?；虻目寺?、敲除突變體的構(gòu)建、基因的過表達(dá)會(huì)對(duì)赤霉酸合成種類及效價(jià)產(chǎn)生影響[87-88]。通過代謝組學(xué)分析基因改造前后代謝物的差異，可以進(jìn)一步探究影響赤霉酸代謝合成的機(jī)理，為進(jìn)一步改造菌株、高效合成赤霉酸提供理論依據(jù)。表1 從分析工具、優(yōu)化位點(diǎn)、應(yīng)用功能3 個(gè)方面，列出了基于基因改造的代謝組學(xué)在赤霉酸生物合成中發(fā)揮的作用。

表1 基于基因改造的代謝組學(xué)在赤霉酸生物合成中的應(yīng)用Table 1 Application of metabolomics based on genetic modification in the biosynthesis of gibberellic acid (GA)

此外，還可以在代謝組研究的基礎(chǔ)上使用不同的突變體來大量生產(chǎn)與赤霉酸生物合成途徑相關(guān)的前體物質(zhì)，如內(nèi)根-貝殼杉烯 (ent-kaurene)、內(nèi)根-貝殼杉烯酸 (ent-kaurenoic acid) 或GA14等。Tudzynski 等[89]發(fā)現(xiàn)，P450-4基因上游存在一個(gè)ORF3基因，將其敲除后的突變株 (6314) 與野生菌株 (m567) 發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)6314 發(fā)酵液中不存在GA4與GA3，表明ORF3基因缺失后，GA7不能向GA3轉(zhuǎn)變，從而提高了GA7的產(chǎn)量。為了進(jìn)一步確認(rèn)去飽和酶基因DES的作用，在敲除了DES與ORF3的雙基因缺失突變體(6314Δorf3-1) 中，用放射性14C 標(biāo)記的GA4作為底物進(jìn)行試驗(yàn)，通過GC-MS 分析代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)GA4為唯一產(chǎn)物，表明DES基因在分解GA4的過程中發(fā)揮著重要作用，見圖1。這個(gè)結(jié)論可為實(shí)際生產(chǎn)提供思路，如敲除DES基因可提高GA4產(chǎn)品純度。Tudzynski 等[90]進(jìn)一步對(duì)處于赤霉酸合成基因簇中的P450-2基因進(jìn)行了敲除突變體的構(gòu)建，然后利用薄層色譜法 (thin-layer chromatography,TLC)、HPLC 和GC-MS 法進(jìn)一步分析，表明敲除了P450-2的突變體中只合成GA14，喪失了向下游繼續(xù)合成赤霉酸的能力?？梢奝450-2基因是GA4、GA7、GA3與GA1合成的關(guān)鍵基因。

圖1 3 個(gè)菌株的高效液相色譜圖[89]Fig.1 High-performance liquid chromatographic analysis of three strains[89]

3.2 非生物脅迫對(duì)赤霉酸合成的影響

微生物可通過合成相應(yīng)物質(zhì)來抵抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)、溫度、酸堿度、滲透壓、氧化還原電位異常等不利生存環(huán)境帶來的影響，因此代謝產(chǎn)物會(huì)隨著培養(yǎng)條件的改變而改變。代謝組學(xué)可通過代謝物差異有效檢測出微生物在不同環(huán)境脅迫下細(xì)胞內(nèi)的代謝差異。氮源在赤霉酸合成過程中至關(guān)重要，高濃度的氮源會(huì)抑制赤霉酸的合成，在氮源限制的情況下赤霉酸才能大量積累[91]。張萬存等[92]利用LC-MS 法對(duì)不同培養(yǎng)階段蟬棒束孢Isaria cicadae菌絲體的代謝物進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)赤霉酸在發(fā)酵后期快速合成并大量積累，比發(fā)酵前期的赤霉酸產(chǎn)量提高了44 倍，這可能是因?yàn)殡S著發(fā)酵的進(jìn)行，培養(yǎng)基中的氮源含量不斷降低，消除了高濃度氮源對(duì)GA 合成的抑制作用。除氮源外，鎂、鉀、鋅等無機(jī)鹽也是影響赤霉酸合成的重要因素，可能是因?yàn)闊o機(jī)鹽的加入不僅為酶活性的發(fā)揮提供離子，還具有控制氧化還原電位、平衡細(xì)胞滲透壓等作用[85]。Jefferys[93]發(fā)現(xiàn)，在藤倉赤霉菌發(fā)酵過程中加入微量鋅能有效促進(jìn)赤霉酸的生成。儲(chǔ)修云等[94]通過在培養(yǎng)基中添加鎂、硼、磷等物質(zhì)提高了赤霉酸的產(chǎn)量。李冠軍等[95]利用HPLC 法和GC-MS 法對(duì)木麻黃Casuarina equisetifolia內(nèi)生真菌 (炭團(tuán)菌屬Hypoxylon) 代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其在不同濃度氯化鈉下代謝產(chǎn)物差異顯著，當(dāng)氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到5.0%時(shí)，赤霉酸產(chǎn)量達(dá)到最高點(diǎn)。

當(dāng)前基于代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)非生物脅迫影響赤霉酸產(chǎn)量的相關(guān)報(bào)道較少，可借鑒其他成熟案例進(jìn)行赤霉酸合成研究。戚曉雪等[96]通過PCA、PLS-DA、差異代謝物聚類分析等方法，篩選、鑒定出了砷脅迫下庫德畢赤酵母Pichia kudriavzevii的差異代謝物，結(jié)果如圖2 所示。他們進(jìn)一步對(duì)差異代謝物進(jìn)行了KEGG 富集通路分析，結(jié)果(圖3) 表明，差異代謝物主要富集在糖酵解、三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化和脂肪酸、谷胱甘肽與氨基酸代謝等通路，可見庫德畢赤酵母通過提高能量供給、還原砷等方式以應(yīng)對(duì)砷脅迫導(dǎo)致的毒性效應(yīng)，減少砷對(duì)菌體的損傷。

圖2 庫德畢赤酵母在砷脅迫下的代謝物差異[96]Fig.2 Metabolite difference of P. kudriavzevii under arsenic stress[96]

圖3 庫德畢赤酵母在砷脅迫下的KEGG 富集通路氣泡圖[96]Fig.3 Bubble diagram of KEGG enrichment pathway in P. kudriavzevii under arsenic stress[96]

3.3 前體物質(zhì)對(duì)赤霉酸合成的影響

前體物質(zhì)是指加入到培養(yǎng)基中能被微生物直接利用或參與目標(biāo)產(chǎn)物的生成，進(jìn)而提高產(chǎn)物產(chǎn)量的物質(zhì)。通常來說，前體物質(zhì)的添加可以使得次級(jí)代謝過程避開初級(jí)代謝對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的調(diào)控，從而增加次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。目前，利用代謝組學(xué)方法研究前體物質(zhì)對(duì)赤霉酸合成影響的報(bào)道較少，可通過其他物質(zhì)的研究報(bào)道為提高赤霉酸的產(chǎn)量提供思路。汪澤[97]在小白鏈霉菌Streptomyces albulus發(fā)酵ε-聚賴氨酸 (ε-poly-L-lysine,ε-PL) 過程中，添加了前體物質(zhì)L-賴氨酸，通過超高效液相色譜法 (UPLC) 分析發(fā)酵產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)ε-PL 的產(chǎn)量顯著提高，增長率達(dá)到20.8%。Guan 等[98]對(duì)產(chǎn)酸丙酸桿菌Propionibacterium acidipropionici進(jìn)行代謝組學(xué)分析，確定了影響丙酸 (PA) 合成的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。對(duì)差異較大的代謝物進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)糖酵解中間產(chǎn)物、氨基酸中間體等對(duì)PA 均有顯著影響，通過外源添加這些中間產(chǎn)物后PA 含量提高了54.9%。國內(nèi)外學(xué)者也應(yīng)用代謝組學(xué)，初步研究了前體物質(zhì)對(duì)赤霉酸合成的影響。Cihangir 等[99]在研究添加前體物質(zhì)對(duì)黑曲霉Aspergillus niger生長及產(chǎn)物產(chǎn)量影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)向發(fā)酵體系中添加少量甲羥戊酸 (mevalonic, MVA) 作為前體物時(shí)，代謝產(chǎn)物中赤霉酸產(chǎn)量顯著提高。王衛(wèi)[100]通過在培養(yǎng)基中添加草酰乙酸、葡萄糖酸鈣、維生素B2等前體物質(zhì)，大大提高了發(fā)酵液中GA 的產(chǎn)量。由圖4 可知，以上前體物質(zhì)的添加分別使乙酰CoA、磷酸戊糖途徑、檸檬酸循環(huán)的代謝通量r17、r7、r13比對(duì)照提高了11.0%、78.8%和降低了19.8%。同時(shí)，目標(biāo)產(chǎn)物GA3的代謝通量r20提高了10.12%。這是因?yàn)椴蒗Ｒ宜岬募尤虢獬颂墙徒馔緩降囊种?，并通過降解產(chǎn)生了丙酮酸 (Pyr) 參與EMP 反應(yīng)；葡萄糖酸鈣則可以促進(jìn)磷酸戊糖途徑途徑暢通，提高GA3合成所需的還原力；維生素B2是能量代謝過程中重要的輔酶，適當(dāng)補(bǔ)充有助于能量的高效利用。

圖4 添加前體物質(zhì)對(duì)代謝通量的影響[100]Fig.4 Effect of precursor addition on metabolic flux[100]

4 總結(jié)與展望

赤霉酸的合成與調(diào)控是一個(gè)涉及基因、蛋白、代謝的全局過程，通過基因改造、環(huán)境脅迫、外源添加前體物質(zhì)等手段均可提高赤霉酸的合成效率[101]。近年來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，組學(xué)技術(shù)被應(yīng)用于提高赤霉酸產(chǎn)量。與其他組學(xué)相比，代謝組學(xué)不僅可以明確赤霉酸生產(chǎn)菌株在合成赤霉酸過程中對(duì)內(nèi)外環(huán)境變化的響應(yīng)，以期從宏觀角度創(chuàng)新發(fā)酵方式，優(yōu)化發(fā)酵條件，實(shí)現(xiàn)提高赤霉酸產(chǎn)量，滿足工業(yè)需求的目標(biāo)；而且可以從代謝物變化解析影響赤霉酸代謝合成的調(diào)控機(jī)制，從微觀角度挖掘GA 合成途徑中的關(guān)鍵中間產(chǎn)物及其關(guān)鍵作用，進(jìn)而探究赤霉酸的高效合成機(jī)理。

代謝組學(xué)近年來應(yīng)用廣泛，但大部分集中在動(dòng)植物研究領(lǐng)域。郭鳳丹等[102]概述了代謝組學(xué)在植物遺傳與代謝途徑研究中的應(yīng)用，田菁等[103]綜述了代謝組學(xué)在農(nóng)業(yè)動(dòng)物領(lǐng)域取得的最新成果。而本論文則聚焦微生物藤倉赤霉菌合成赤霉酸，從不同角度闡述了代謝組學(xué)的重要作用。除此之外，現(xiàn)階段關(guān)于藤倉赤霉菌的研究主要局限于基因和赤霉酸合成層面。Malonek 等[104]從基因工程和赤霉酸生產(chǎn)兩個(gè)方面綜述了目前藤倉赤霉菌研究的工具和方法。王冰璇等[85]綜述了藤倉赤霉菌赤霉酸生物合成途徑、關(guān)鍵酶、環(huán)境因素、代謝流調(diào)控等方面的研究進(jìn)展。本論文則是在介紹赤霉酸的基礎(chǔ)上，主要從基因改造、非生物脅迫、前體物質(zhì)3 個(gè)方面綜述了代謝組學(xué)技術(shù)在藤倉赤霉菌合成赤霉酸中的作用，為工業(yè)生產(chǎn)中赤霉酸產(chǎn)量的進(jìn)一步提升提供了新的思路。

隨著各種組學(xué)技術(shù)的聯(lián)系日益緊密，代謝組學(xué)分析結(jié)果可為基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)提供數(shù)據(jù)支撐，因此采用多組學(xué)聯(lián)合的分析方法極具潛力[105-106]，可從不同維度解析影響赤霉酸合成的代謝途徑和生物學(xué)過程，進(jìn)而站在全局角度提出更全面精準(zhǔn)的赤霉酸生物合成調(diào)控策略。