錢沉魚, 苑鵬宇, 馬 濤, 溫秀軍

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642)

昆蟲在其生活史和生態(tài)學(xué)的許多方面都會(huì)利用化學(xué)信號(hào)和線索，化學(xué)通訊在昆蟲的覓食、求偶、棲息、交配等生理行為中起著重要作用。信息素是具有揮發(fā)性、半揮發(fā)性和非揮發(fā)性的化學(xué)物質(zhì)，可引起受體生物體的生理或行為反應(yīng)[1-3]，分別參與長(zhǎng)距離、中距離和短距離通信，根據(jù)其行為結(jié)果，可分為性信息素、聚集信息素、告警信息素和示蹤信息素等。自1959 年提出“信息素”一詞以來[4]，第一個(gè)信息素組分bobbykol 在蠶蛾Bombyx mori身上得以鑒定[5]，隨后越來越多的研究揭示了這些信息物質(zhì)在眾多昆蟲中的化學(xué)和生物學(xué)作用。當(dāng)信息素與誘捕器結(jié)合使用時(shí)，可以有效地監(jiān)測(cè)和控制害蟲的危害[6]。昆蟲信息素是農(nóng)林害蟲綜合管理的重要組成部分，尤其是信息素的高效靈敏性，在害蟲種群密度較低時(shí)，表現(xiàn)出巨大的潛力[7-8]。此外，信息素具有物種特異性、對(duì)哺乳動(dòng)物無毒、對(duì)環(huán)境無害等優(yōu)點(diǎn)，可在對(duì)天敵影響最小的情況下長(zhǎng)期減少害蟲種群。大量研究表明，利用化學(xué)信息素作為生物農(nóng)藥，通過監(jiān)測(cè)、大規(guī)模誘捕、交配中斷、吸引、殺死和推拉策略來管理農(nóng)業(yè)、儲(chǔ)存產(chǎn)品和森林害蟲，可以顯著減少傳統(tǒng)殺蟲劑的使用，減緩病蟲抗藥性，從而提供可持續(xù)和生態(tài)友好的害蟲防控技術(shù)[7,9]。

昆蟲的觸角是連接昆蟲與大自然之間的主要化學(xué)信息通訊工具，尤其是觸角上的各類化學(xué)感受器，能接受外部環(huán)境刺激后形成化學(xué)信號(hào)[10]，通過化學(xué)感受器上的微孔進(jìn)入水溶性淋巴液，與周圍的氣味結(jié)合蛋白 (odorant binding protein,OBP)、氣味受體 (odorant receptors, OR)、信息素結(jié)合蛋白 (pheromone binding protein, PBP)、化學(xué)感受蛋白 (chemosensory protein, CSP) 和感覺神經(jīng)元膜蛋白 (sensory neuron membrane proteins,SNMP) 結(jié)合，形成親水性的復(fù)合物，這些復(fù)合物可穿過感受器淋巴而激活信息素受體[11-13]。OR構(gòu)成了氣味檢測(cè)的核心，位于嗅覺受體神經(jīng)元(olfactory receptor neuron, ORN) 的樹突膜上[14]，介導(dǎo)特定氣味分子與嗅覺神經(jīng)元的結(jié)合，將化學(xué)信息信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，負(fù)責(zé)嗅覺神經(jīng)元的敏感性和特異性[15]。最后通過高級(jí)腦中樞的信息整合，支配和調(diào)節(jié)昆蟲的行為反應(yīng)[16]。目前，已在100 多種昆蟲中檢測(cè)到了OBP 的存在，例如蠶蛾[17]、玉米象Sitophilus zeamais[18]、韭菜遲眼蕈Bradysia odoriphaga[19]、東方果實(shí)蠅幼蟲寄生蜂Diachasmimoorpha longicaudata[20]、棉鈴蟲Helicoverpa armigera和煙青蟲Helicoverpa assulta[21]等。昆蟲通過其嗅覺系統(tǒng)感知?dú)馕斗肿?，如性信息素[22]、聚集信息素[23]和植物源揮發(fā)物[24]等。破解昆蟲與昆蟲、昆蟲與寄主植物之間的化學(xué)信息，實(shí)際是對(duì)昆蟲觸角及觸角上化學(xué)感受器的深入研究[25-26]，因此，電生理技術(shù)作為昆蟲觸角研究方法中最重要的技術(shù)之一，也是化學(xué)生態(tài)學(xué)研究中最常用的技術(shù)方法。

目前，常用于昆蟲信息化合物篩選及鑒定的儀器有觸角電位儀 (electroantennography, EAG)、氣相色譜-觸角電位聯(lián)用儀 (gas chromatographyelectroantennographic detection, GC-EAD)、氣質(zhì)聯(lián)用儀 (gas chromatography-mass spectrometer, GCMS)、單感器記錄儀 (single sensillum recordings,SSR) 和氣相色譜-單感器記錄聯(lián)用儀 (GC-SSR)。EAG 主要用于引起昆蟲觸角活性反應(yīng)的已知化合物的篩選與測(cè)定；而GC-EAD 可直接用于混合物的高效篩選，與單獨(dú)使用EAG 相比，其可極大地提高篩查效率，降低工作量；SSR 和GC-SSR 技術(shù)則用于區(qū)分昆蟲觸角不同感受細(xì)胞的電位反應(yīng)。信息素的化學(xué)結(jié)構(gòu)多種多樣，包括碳?xì)浠衔?、醇、酯、環(huán)氧化物、醛、酮、內(nèi)酯、羧酸和異戊二烯等[27-29]，這種結(jié)構(gòu)多樣性是信息素具有特異性的關(guān)鍵。不同組分的作用有可能是無關(guān)的、拮抗的或協(xié)同的，其具體效能取決于組分之間的比例。因此，GC-MS 技術(shù)作為破解化合物質(zhì)譜信息和結(jié)構(gòu)信息的有力手段和前提條件，通過選擇合適的毛細(xì)管柱，能實(shí)現(xiàn)大多數(shù)揮發(fā)性有機(jī)化合物的定性與定量分析。由于電生理技術(shù)具有較強(qiáng)的選擇性和靈敏性，已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于昆蟲的嗅覺行為及其化學(xué)生態(tài)學(xué)的研究，成為昆蟲信息化合物鑒定、篩選及其其他揮發(fā)性有機(jī)化合物生物活性測(cè)定的重要工具，使得信息素化學(xué)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息與作用機(jī)制更加清晰，為害蟲生物防治及綠色防控提供了更多途徑和技術(shù)支撐。本研究對(duì)上述昆蟲信息素的鑒定與分析技術(shù)進(jìn)行了總結(jié)歸納，結(jié)合近年來國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道，討論了電生理技術(shù)和氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的作用原理及應(yīng)用，分析了不同技術(shù)在昆蟲信息素鑒定中的優(yōu)勢(shì)與不足，并對(duì)未來電生理技術(shù)在化學(xué)生態(tài)分析領(lǐng)域中可能面臨的機(jī)遇與難點(diǎn)進(jìn)行了展望，以期為昆蟲信息素的研究提供有價(jià)值的參考。

1 觸角電位技術(shù)

觸角電位儀 (EAG) 是昆蟲化學(xué)生態(tài)中最常用的電生理學(xué)方法，最早是由科學(xué)家Schneider[30]利用EAG 技術(shù)測(cè)定了蠶蛾性信息素的嗅覺生理反應(yīng)，記錄了在化合物的刺激作用下，蠶蛾觸角的尖端和根部之間產(chǎn)生了一個(gè)細(xì)微的電壓波動(dòng)，是由昆蟲觸角內(nèi)的嗅覺神經(jīng)元被電化消磁所引起的。EAG 是一種快速測(cè)量由嗅覺刺激引起的觸角遠(yuǎn)端和近端部分之間電位變化的優(yōu)越技術(shù)，也可使用純化合物來評(píng)估昆蟲觸角對(duì)某種刺激的反應(yīng)和引發(fā)可檢測(cè)反應(yīng)所需的劑量[31]。如圖1 所示，該儀器主要包括：數(shù)據(jù)采集控制器、刺激放大器、微動(dòng)操作儀及觸角電位探頭、計(jì)算機(jī)、巴斯德管等構(gòu)成。昆蟲觸角上存在著大量的化學(xué)感受器，每一個(gè)感受器細(xì)胞都包含著類似于電源和電阻的結(jié)構(gòu)，這樣整根觸角就組成了無數(shù)的電源和電阻，從而形成串聯(lián)的閉合電路[32]。當(dāng)觸角受到活性化合物刺激時(shí)，大量的感受細(xì)胞就會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的電生理反應(yīng)，從而在觸角的基部和端部形成一個(gè)總的電位變化 (去極化的直流信號(hào))，得到觸角電位圖，通常用毫伏 (mV) 表示。這種電位的變化幅度與化合物的種類和屬性等密切相關(guān)，并隨著化合物濃度的增長(zhǎng)而增長(zhǎng)，直至飽和狀態(tài)。除此之外，還與昆蟲的種類及生理狀態(tài)、昆蟲觸角的活性、離體觸角的壽命和觸角電位儀放大器輸入信號(hào)的質(zhì)量及溫濕度狀況等相關(guān)[33]。

目前，EAG 被廣泛應(yīng)用于從一系列疑似化合物中篩選出可以引起昆蟲觸角活性反應(yīng)的物質(zhì)[34]，以測(cè)定昆蟲觸角對(duì)活性化合物的電生理反應(yīng) (圖1)。如Zhao 等[35]等在東方蜜蜂Apis cerana中發(fā)現(xiàn)其氣味結(jié)合蛋白AcerOBP6 與大多數(shù)被測(cè)氣味具有親和力，并用EAG 判定該蜜蜂對(duì)2-庚酮反應(yīng)最強(qiáng)烈，在沉默AcerOBP6 后，發(fā)現(xiàn)所選配體的 EAG 記錄值全部降低，由此推測(cè)出了參與覓食嗅覺識(shí)別的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。Du 等[36]用 GC-EAD探究紅火蟻Solenopsis invicta對(duì)異構(gòu)體混合物中報(bào)警信息素的反應(yīng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)GC-EAD 響應(yīng)太小而無法滿足研究的需要，繼而改用EAG 直接測(cè)量，獲得了顯著的觸角反應(yīng)。近年來, Jacob 等[37-38]還新開發(fā)了一種EAG 結(jié)合電流源密度 (CSD) 模型預(yù)測(cè)的分析方法，并在實(shí)蠅科昆蟲身上驗(yàn)證了該方法可用于繪制單個(gè)觸角的功能激活圖，能更加快速和全面地評(píng)估觸角對(duì)化合物的敏感性。

圖1 EAG 儀器原理示意圖[32]Fig.1 Schematic diagram of EAG equipment[32]

2 氣相色譜-觸角電位聯(lián)用技術(shù)

由氣相色譜 (GC) 和觸角電位儀 (EAG) 組成的氣相色譜-觸角電位聯(lián)用儀 (GC-EAD)，是一個(gè)聯(lián)合的分析系統(tǒng)，將基于 EAG 的方法提高到了更高水平。通常在選擇分析樣品的色譜柱時(shí)，根據(jù)目標(biāo)化合物的特征可采用弱極性柱 (如DB-5MS、HP-5 和HP-5MS 等)、中等極性柱 (DB-17 和DB-17MS 等) 或強(qiáng)極性柱 (如HP-Wax、HP-INNOWax和DB-Wax 等)。雖然色譜柱固定相有著不同的極性，但適用范圍廣，對(duì)大多數(shù)化合物都具有比較高的靈敏度和質(zhì)譜完整性，如醛類、烯烴和萜類等。然而，相對(duì)于弱極性柱而言，強(qiáng)極性柱可改善低沸點(diǎn)分析物的分離度，尤其適用于酸、酯和甘醇等物質(zhì)的分離。氣相色譜柱出口端接Y 型分流器，使得色譜柱餾出物在火焰離子化檢測(cè)器(FID) 和 EAD 之間以 1:1 的分流比通過加熱的傳輸線進(jìn)行分流。控制氣流的支路長(zhǎng)度相同，使到達(dá)FID 和EAD 的時(shí)間基本保持一致，這樣GC和EAG 的響應(yīng)峰可以同時(shí)一一對(duì)應(yīng)記錄，收集的氣味化合物被迅速篩選，其他沒有引起活性反應(yīng)的物質(zhì)不予考慮 (圖2)。雖然GC-EAD 不能提供相關(guān)化合物的結(jié)構(gòu)信息，但比較適用于從復(fù)雜混合物中篩選出主要成分或次要組分中具有活性的化合物，節(jié)省大量的時(shí)間和精力。

圖2 GC-EAD 儀器操作原理圖Fig.2 Schematic diagram of GC-EAD equipment

表1 和表2 中列舉的例子包含了從 2012—2022年期間針對(duì)不同昆蟲的性信息素、表皮揮發(fā)物、聚集信息素、告警信息素以及植物源揮發(fā)物組分，驗(yàn)證昆蟲電生理反應(yīng)的GC-EAD 適用條件以及相應(yīng)的參考文獻(xiàn)。

表1 適用于不同信息素類型的GC-EAD 條件 (2012—2022)Table 1 The application of GC-EAD on pheromones (2012-2022)

Moorhouse 等[39]最早提出GC-EAD 聯(lián)合使用測(cè)定昆蟲觸角的反應(yīng)，但由于EAG 反應(yīng)容易被噪音 (儀器放大器輸入噪音、觸角本身噪音及外部電路噪音等) 或者基線漂移所覆蓋，無法得到令人滿意的結(jié)果。直到1975 年， Arn 等[40]使用氣相色譜柱對(duì)選擇性及敏感性很高的化合物進(jìn)行檢測(cè)，弄清了GC 和EAG 聯(lián)用的GC-EAD 技術(shù)，得到了葡萄花翅小卷蛾Lobesia botrana雄蛾觸角對(duì)雌蛾性信息素腺體粗體物的GC-EAD 反應(yīng)，從此大量的昆蟲信息化合物得到準(zhǔn)確鑒定[41-42]。GC-EAD 技術(shù)已廣泛應(yīng)用于昆蟲性信息素、植物源揮發(fā)物、表皮揮發(fā)物和示蹤信息素等物質(zhì)的初篩 (表2)。本實(shí)驗(yàn)室也采用GC-EAD 技術(shù)分別篩選出了皮暗斑螟Euzophera batangensis、團(tuán)花絹野螟Diaphania glauculalis、麻楝蛀斑螟Hypsipyla robusta、灰茶尺蠖Ectropis grisescens和綠翅絹野螟D.angustalis等昆蟲的性信息素活性組分[43-47]。

表2 適用于不同揮發(fā)物類型的GC-EAD 條件 (2012—2022 年)Table 2 The application of GC-EAD on volatiles (2012-2022)

然而，對(duì)于植物源化合物，由于引起昆蟲觸角反應(yīng)的峰值較小，更容易被噪聲覆蓋，因此需要提高信噪比 (signal to noise ratio，SNR) 以避免該現(xiàn)象的發(fā)生[48]，而新型裝置 (MEMS-GC-EAG)可迅速鑒定出低濃度下的揮發(fā)性有機(jī)化合物 (volatile organic compounds，VOCs)[49]。GC-EAD 還存在一些缺陷，比如：EAD 只顯示是否產(chǎn)生了嗅覺反應(yīng)，不能提供引起昆蟲觸角反應(yīng)的有關(guān)化合物準(zhǔn)確信息；即使在樣品制備和氣相色譜條件最佳的情況下，仍有一些昆蟲也很難對(duì)EAD 做出響應(yīng)，僅靠 GC-EAD 技術(shù)不一定能覆蓋所有的關(guān)鍵線索。最近，Shuttleworth 等[50]改進(jìn)了原來的一次只能用一種固定的運(yùn)行方法，通過四通分流器可以同時(shí)在極性和非極性色譜柱上運(yùn)行樣品，大大提高了對(duì)活性化合物的分離度和鑒定。由于GC-EAD和GC-MS 是兩個(gè)獨(dú)立的系統(tǒng)，因此通常使用不同的氣相色譜系統(tǒng)。然而，兩種氣相色譜系統(tǒng)的類型、載氣和色譜柱不同，所分析化合物的峰形、保留時(shí)間和數(shù)量也有所不同，在比較兩個(gè)色譜圖中所對(duì)應(yīng)的化合物時(shí)更加耗時(shí)；如果樣品量太少，無法保證第2 次進(jìn)樣，則無法進(jìn)一步進(jìn)行分析篩選。因此，Li等[51]通過在氣相色譜中添加毛細(xì)管分離器來改進(jìn)GC-EAD 技術(shù)，F(xiàn)ID 被質(zhì)譜取代。該方法將GC-EAD 和GC-MS 結(jié)合在一個(gè)系統(tǒng)中，不僅降低了一臺(tái)GC 和一臺(tái)FID 設(shè)備的成本，而且避免了不同色譜圖的比較，提高了工作效率。更重要的是，EAD 響應(yīng)本身不能與昆蟲生物吸引力等特定功能直接相關(guān)，因此，GC-EAD實(shí)驗(yàn)結(jié)果需用野外生物活性測(cè)定加以驗(yàn)證，進(jìn)而確認(rèn)已鑒定化合物的生物活性。

3 氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

使用 GC-EAD 可篩選出引起昆蟲電生理行為反應(yīng)的活性成分，而GC-MS 可以通過毛細(xì)管色譜

柱先對(duì)復(fù)雜混合物中的組分進(jìn)行高效分離，再經(jīng)過質(zhì)譜信息鑒定其中能引起昆蟲的電生理活性反應(yīng)的單個(gè)或混合組分。Imrei 等[100]通過GC-MS 技術(shù)對(duì)截尾麗虎天牛Plagionotus detritus雄性體表?yè)]發(fā)物中能引起GC-EAG 響應(yīng)的兩個(gè)物質(zhì)進(jìn)行了分析，將樣品的保留時(shí)間與在弱極性柱 (HP-5 MS)和極性柱 (DB-Wax) 上標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜信息和保留時(shí)間對(duì)比，再結(jié)合手性色譜柱 (Cyclodex B) 分離對(duì)提取物的絕對(duì)構(gòu)型進(jìn)一步分析表明，雄蟲產(chǎn)生的活性信息素組分為 (R)-3-羥基己烷-2 酮和 (S)-2-羥基辛烷-3-酮。類似地，Binyameen 等[102]在發(fā)掘棉花Gossypium hirsutum和丁香花Syringa vulgaris提取物中能引起夜蛾科害蟲Spodoptera littoralis生理活性的化合物時(shí)，為了防止組分在弱極性HP-5 色譜柱上有共餾出現(xiàn)象，用極性DB-Wax 對(duì)化合物重新進(jìn)行了分離。Būda 等[103]用Stabil-Wax極性色譜柱發(fā)現(xiàn)了沙棘實(shí)蠅Rhagoletis batavad雄蟲信息素中潛在對(duì)映異構(gòu)體的存在，并分離出了能引起雌蟲EAD 反應(yīng)的活性化合物，并隨后利用基于環(huán)糊精的固定相手性色譜柱 (Rt?-bDEXsm)分離出了(-)-δ-庚內(nèi)酯和(+)-δ-庚內(nèi)酯，其中只有前者能引起觸角反應(yīng)。此外，結(jié)合質(zhì)譜信息可對(duì)活性物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)，其中保留指數(shù) (RI) 是判斷信息素的化學(xué)特性的重要參數(shù)。通常使用正構(gòu)烷烴混合物來計(jì)算保留指數(shù)：

其中： RTX是未知物X 的保留時(shí)間，RTn是其中第n個(gè)碳的烷烴在 X 之前洗脫的保留時(shí)間，RT(n+1)是在 X 之后洗脫的n+ 1 個(gè)碳的烷烴的保留時(shí)間[104]。為了確保鑒定結(jié)果的可靠性，通常采用從至少兩個(gè)不同固定相的氣相毛細(xì)管柱 (包括弱極性柱和極性柱) 中獲得的保留數(shù)據(jù)進(jìn)行 RI 計(jì)算[57,80]。通過與合成的或購(gòu)買的標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜和保留時(shí)間進(jìn)行比較，最終得到準(zhǔn)確的物質(zhì)信息。在缺乏標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，可將未知化合物的質(zhì)譜與譜庫(kù)中的質(zhì)譜信息進(jìn)行對(duì)比，而此時(shí)往往需要多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù) (如NIST、Wiley/NBS registry) 的交叉多重驗(yàn)證，再結(jié)合文獻(xiàn)或與已發(fā)表的化合物的保留指數(shù)進(jìn)行比對(duì)，以提高化合物定性的準(zhǔn)確度[99,101,105]。

飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)器 (TOFMS) 結(jié)合全二維氣相色譜 (GC × GC) 是一種更為先進(jìn)的化學(xué)分析技術(shù)。原理上，該方法由兩個(gè)配備不同極性色譜柱的串聯(lián)系統(tǒng)組成，通過調(diào)制器進(jìn)行連接[106]。隨后調(diào)制器經(jīng)過反復(fù)調(diào)制，從第1 根色譜柱洗脫的每份組分釋放到第2 根色譜柱，進(jìn)行二次分離。由于調(diào)制之后所產(chǎn)生的二維峰寬比較窄 (低至50 ms，取決于低溫調(diào)制的頻率)，因此需要具有較高采集頻率 (最低每秒50 Hz) 的質(zhì)譜檢測(cè)器才能提高系統(tǒng)精度[107]。在全二維色譜圖中，包含了化合物在一維色譜柱 (以分鐘為單位) 和二維色譜柱 (以秒為單位) 分離后的保留時(shí)間，使用該技術(shù)既可以減少共餾出峰的出現(xiàn)，也能實(shí)現(xiàn)痕量化合物的檢測(cè)。相對(duì)于傳統(tǒng)的一維氣相色譜系統(tǒng)，全二維氣相色譜更有利于發(fā)現(xiàn)隱藏在高含量物質(zhì)下的微量共餾出活性物質(zhì)[108]。由于許多昆蟲揮發(fā)性化合物的組成成分復(fù)雜，存在一些化學(xué)性質(zhì)相似的同分異構(gòu)體，僅靠一維氣相色譜難以達(dá)到理想的分離效果[109]，因此，GC × GC-TOFMS 技術(shù)也引入到了許多昆蟲信息素的分離鑒定中，如非洲果蠅表皮揮發(fā)物[99]、蠟螟科Ahomia sociella雌蟲求偶信息素[110]和灰茶尺蠖E.grisescens性信素[43]等。通過GC × GC-TOFMS 得到的高分辨質(zhì)譜信息，發(fā)現(xiàn)了灰茶尺蠖的兩種性信息素成分為單環(huán)氧化物和三烯，具有II 型鱗翅目信息素成分的特征[43]。地中海果蠅C.capitata雄性揮發(fā)物包括了多種化學(xué)結(jié)構(gòu)接近的復(fù)雜混合物，在用GC-EAD 檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)辛酸乙酯和(E)-3-辛烯酸乙酯兩種化合物都有響應(yīng)，可在一維GC 上兩種化合物幾乎同時(shí)被洗脫[101]，無法精確鑒定。而借助于GC × GC 系統(tǒng)中兩根不同極性的色譜柱 (一維：弱極性DB-5 色譜柱；二維：極性BPX-50 色譜柱)，則大大提高了共餾出化合物的分離度。如圖3 所示，在EAD 圖上可以明顯看到辛酸乙酯(36)和(E)-3-辛烯酸乙酯(37)兩個(gè)化合物的響應(yīng)信號(hào)，且辛酸乙酯的信號(hào)要強(qiáng)于(E)-3-辛烯酸乙酯；GC × GC-TOFMS 也證實(shí)了這兩個(gè)化合物的存在，但(E)-3-辛烯酸乙酯的質(zhì)譜響應(yīng)要明顯高于辛酸乙酯?？梢姡谝痪SGC分析時(shí)會(huì)誤以為只有(E)-3-辛烯酸乙酯的EAD 響應(yīng)。

圖3 地中海果蠅雄性信息素的GC × GC-TOFMS分析及EAD 響應(yīng)[101]Fig.3 The GC × GC-TOFMS analysis and GC-EADs response of C. capitata male pheromone[101]

4 單感器記錄儀

單感器記錄儀 (SSR) 是一種用于研究昆蟲對(duì)化學(xué)刺激引起的嗅覺神經(jīng)元反應(yīng)及細(xì)胞外動(dòng)作電位變化的技術(shù)，是篩選特定氣味受體活性配體的有效方法，常用于昆蟲化學(xué)生態(tài)學(xué)和神經(jīng)生理學(xué)研究[111]。嗅覺受體是嵌在ORN 膜上的通道，負(fù)責(zé)將化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)[112]。由于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)改變了ORN 膜上的活性電位頻率，可作為神經(jīng)元反應(yīng)幅度的指標(biāo)。在操作SSR 時(shí)，先用牙科蠟將活體昆蟲安裝在顯微鏡載玻片上。使用兩個(gè)鎢絲電極，將接地端的參比電極插入昆蟲的復(fù)眼或腹部，另一端記錄電極連接到前置放大器并插入感受器以完成電路。前置放大器連接到模數(shù)信號(hào)轉(zhuǎn)換器，該轉(zhuǎn)換器又連接到計(jì)算機(jī)以便于記錄和可視化信號(hào)[113]。刺激控制器控制經(jīng)過活性炭過濾的恒定氣流，通過硅膠和玻璃管引至昆蟲處。昆蟲觸角和觸須上的嗅覺感覺神經(jīng)元 (olfactory sensory neurons, OSN) 可將嗅覺信息從外界環(huán)境傳送到昆蟲大腦。OSN 的受體活性會(huì)誘導(dǎo)電尖峰的產(chǎn)生，因此SSR 能夠監(jiān)測(cè)感受器和參比電極之間的電位差[114]。Park 等[115]使用單感器記錄技術(shù)研究了雄性和雌性卷葉蛾Cydia succedana中OSN 對(duì)宿主和非宿主揮發(fā)物的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)雌蛾觸角上的ORN和OSN 類別都比雄蛾豐富。其中，兩種最豐富的OSN 對(duì)宿主植物釋放的β-月桂烯和 (E) -β-羅勒烯表現(xiàn)出高度特異性反應(yīng)，而其他的OSN 對(duì)非寄主植物的幾種化合物產(chǎn)生反應(yīng)，說明卷葉蛾可能利用具有高度特異性的OSN 來區(qū)分寄主植物和非寄主植物[115]。

在單感器記錄中，尖峰數(shù)量的變化代表昆蟲對(duì)特定刺激的敏感性，不同類型嗅覺感受器的神經(jīng)信號(hào)對(duì)化學(xué)線索有著不同的動(dòng)作電位類型和幅度[116]。根據(jù)尖峰幅度差異可用于評(píng)估每個(gè)感受器中的ORN 活性，因此可用于研究昆蟲對(duì)特定化學(xué)物質(zhì)的編碼過程。例如，致倦庫(kù)蚊C u l e x qsuinquefasciatus短鈍毛狀Ⅱ型 (short blunt trichoid II, SBTII) 感受器上神經(jīng)元細(xì)胞 A 和B 對(duì)不同類別的氣味表現(xiàn)出明顯不同的反應(yīng)模式。芳烴和雜環(huán)化合物可激發(fā)SBTII A 的強(qiáng)烈響應(yīng)，而引起SBTII B 最積極反應(yīng)的是醛類化合物。此外，SBTII B 對(duì)2-己酮 ((60 ± 14 ) 尖峰/s) 和3-甲基吲哚 ((75 ±4)尖峰/s) 有反應(yīng)，但SBTII A 則沒有反應(yīng)[117]。其次，不同神經(jīng)元響應(yīng)化合物刺激的時(shí)間動(dòng)態(tài)也各不相同，從瞬時(shí)到階段性或持久響應(yīng)。象鼻蟲Apion fulvipes觸角上其中1 類OSN 對(duì)吲哚的反應(yīng)是強(qiáng)烈且持久的。當(dāng)吲哚劑量在1～10 μg 時(shí)，即使是在刺激的幾分鐘后，尖峰幅度仍遠(yuǎn)高于無刺激時(shí)的；而當(dāng)吲哚劑量為0.1 μg 時(shí)，雖然引起的反應(yīng)較弱，但同樣是持續(xù)的。與此同時(shí)，在其他6 類OSN 中，隨著化合物劑量的減少，因刺激產(chǎn)生的響應(yīng)在時(shí)間動(dòng)態(tài)上表現(xiàn)為從持久響應(yīng)變?yōu)殡A段性響應(yīng)[118]。相反，梨小食心蟲Grapholita molesta雄蟲觸角ORN 上的細(xì)胞能對(duì)Z8-12:Ac產(chǎn)生反應(yīng)，但受刺激后的響應(yīng)時(shí)間不足1 s[119]。

此外，化學(xué)刺激物通常需要先在溶劑中溶解和稀釋，以測(cè)試不同濃度的劑量效應(yīng)。甲苯在0.01 μg/μL 的低閾值下便可引發(fā)致倦庫(kù)蚊短鈍毛狀Ⅱ型 (SBTII) 感受器上神經(jīng)元細(xì)胞A 的響應(yīng)，當(dāng)甲苯質(zhì)量濃度達(dá)到10 μg/μL 時(shí)甚至可引起強(qiáng)烈和興奮的反應(yīng)[117]。由于昆蟲對(duì)石蠟油具有低敏性，因?yàn)樵跍y(cè)試許多昆蟲受體神經(jīng)元對(duì)化合物的反應(yīng)時(shí)，通常以石蠟油為溶劑來溶解不同的刺激物[120]。在臭蟲的研究中，同時(shí)驗(yàn)證了石蠟油和二甲亞砜(DMSO) 溶解刺激物的效果[121-122]，發(fā)現(xiàn)同種刺激物在DMSO 中稀釋相同劑量會(huì)引發(fā)感受器更強(qiáng)的神經(jīng)反應(yīng)[123]。SSR 技術(shù)的應(yīng)用范圍極為廣泛，Jiang 等[55]利用SSR 技術(shù)驗(yàn)證了草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda雄性觸角中的感受器對(duì)雌蟲產(chǎn)生的性信息素的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)雄性觸角中存在兩種功能類型的長(zhǎng)毛狀感受器，分別對(duì)信息素Z9-14:Ac 和Z7-12:Ac 敏感。Dong 等[124]通過SSR 評(píng)估了大灰優(yōu)食蚜蠅Eupeodes corollae雌蟲和雄蟲觸角對(duì)10 種花香揮發(fā)物的嗅覺神經(jīng)反應(yīng)，根據(jù)尖峰幅度確定了該蟲觸角上感受器I 亞型中能夠?qū)谆∠惴雍推渌枷阕寤衔锲鸱磻?yīng)的神經(jīng)元。還有研究者利用SSR 表征了致倦庫(kù)蚊神經(jīng)元對(duì)化學(xué)驅(qū)蟲劑的反應(yīng)，這對(duì)今后篩選新的驅(qū)蚊劑具有重要意義[113]。單感器記錄儀是一種強(qiáng)大的勘測(cè)技術(shù)，為昆蟲在嗅覺神經(jīng)元的響應(yīng)動(dòng)態(tài)過程提供了的寶貴見解，開辟了探索昆蟲神經(jīng)反應(yīng)的新途徑，有利于將來開發(fā)有效的害蟲防治新試劑。

5 氣相色譜-單感器記錄儀聯(lián)用技術(shù)

氣相色譜-單感器記錄儀聯(lián)用儀 (GC-SSR) 在近年來得到較快發(fā)展，通過該儀器可明確昆蟲對(duì)特定信息化合物具有生理反應(yīng)的嗅覺受體神經(jīng)元ORN 及其靈敏程度，進(jìn)而驗(yàn)證信息化合物誘發(fā)神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)的過程[125]。操作GC-SSR 時(shí)，需將記錄電極輕輕地壓入感受器的底部，以建立與ORN 的電接觸[126]。目前，該儀器可通過兩種方式將電極與觸角感器細(xì)胞接觸：一種為玻璃刀片切除感覺器的頂端，將充滿電解質(zhì)溶液的電極與去頂?shù)母杏X器連結(jié)；另一種方法為用極細(xì)的鎢絲電極從感覺毛基部一側(cè)插入，電極頂端就和感覺細(xì)胞內(nèi)部接觸。隨后，將樣品放置在巴斯德管口的濾紙條上，通過刺激感覺器來確定樣品的生物活性。通過接口放大器放大位于感覺器中的 ORN 的動(dòng)作電位，當(dāng)提取物引起 ORN 的響應(yīng)時(shí)，隨后將樣品通過加熱傳輸線注入到與 SSR 記錄裝置相連的氣相色譜儀中。在氣相色譜儀中，色譜柱末端安裝一個(gè)分流器，一半的洗脫物通過加熱傳輸線流向昆蟲觸角，另一半流向到FID 中，便可得到同時(shí)記錄了ORN 的活性和在色譜柱上分離組分的色譜圖。當(dāng)受到不同氣味的刺激時(shí)，ORN 表現(xiàn)出不同程度的特異性，可由神經(jīng)元的尖峰幅度差異來區(qū)分單個(gè)ORN[127]。

GC-SSR 已成功運(yùn)用在許多昆蟲對(duì)特殊氣味化合物的反應(yīng)驗(yàn)證。Binyameen 等[102]通過GC-SSR，用GC 分離棉花和丁香花頂空提取物中的單個(gè)成分，用以刺激夜蛾科害蟲Spodoptera littoralis細(xì)胞，從而判斷一個(gè)神經(jīng)元是否對(duì) 45 種刺激物中的任何一種做出反應(yīng)。與使用GC-EAD 或使用單一SSR 的研究相比，使用GC-SSR 檢測(cè)到OSN 和活性化合物的功能類別分別增加了40%和34%。Wang 等[85]在研究雌性煙青蟲H.assulta識(shí)別煙草揮發(fā)物以及將哪些氣味化合物用作產(chǎn)卵線索時(shí)，首先用GC-MS 初篩了14 種揮發(fā)性化合物，隨后用SSR 驗(yàn)證了其對(duì)壬醛和庚醛可作出反應(yīng)，且對(duì)壬醛的反應(yīng)明顯更強(qiáng)，而壬醛是煙青蟲氣味受體的主要配體。此外，GC-SSR 主要記錄的是單個(gè)神經(jīng)元的電位變化，而GC-EAD 主要記錄的是昆蟲整個(gè)觸角的電位變化，故而GC-SSR 具有更高的分辨率和靈敏度。對(duì)于植物源揮發(fā)物活性組分的篩選、以及通過GC-EAD 無法篩選而遺漏的生物活性化合物，GC-SSR 可以作為 GC-EAD 的有力補(bǔ)充。例如使用GC-SSR，在藍(lán)桉Eucalyptusglobulus中得到了6 種可以引起桉樹蛀干害蟲Phoracantha semipunctata的活性化合物，而使用GC-EAD 卻無法檢測(cè)到[128]。這可能是由于少量OSN 的活動(dòng)導(dǎo)致受體電位的總和很小，達(dá)不到GC-EAD 的信號(hào)檢測(cè)閾值，表明在識(shí)別具有生理活性的氣味上，GC-SSR 是比GC-EAD 更優(yōu)越的儀器。

6 展望

隨著昆蟲電生理學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，在信息素的分析、鑒定和表征方面，可獲得的方法更加多樣化，其應(yīng)用范圍也從信息素的快速鑒定擴(kuò)展到分子細(xì)胞水平上的嗅覺機(jī)制及神經(jīng)傳導(dǎo)研究。EAG、GC-EAD、GC-MS、SSR 和GC-SSR 作為化學(xué)生態(tài)學(xué)研究的重要技術(shù)手段，各有優(yōu)缺點(diǎn)，相輔相成。

1) 氣相色譜與電生理技術(shù)的聯(lián)合使用在提高了對(duì)昆蟲性信息素的識(shí)別能力，具有快速分離、反應(yīng)靈敏、可操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，而GC-SSR 的出現(xiàn)將電生理技術(shù)推向了更精準(zhǔn)的高度，可以靈敏、準(zhǔn)確地檢測(cè)到觸角上不同感受器對(duì)信息素組分的特異性反應(yīng)。目前，信息素的鑒定仍以GC-MS 為主，但該技術(shù)難以判定化合物雙鍵位置、順反構(gòu)型以及手性異構(gòu)的判定。

2) 國(guó)內(nèi)對(duì)于Type II 信息素的鑒定以及一些帶有旋光構(gòu)型的物質(zhì)仍難以篩選和鑒定，而一些具有重大危害的害蟲，如春尺蠖Apocheima cinerarius和油桐尺蠖Buzura suppressaria等的性信息素至今尚未能成功破解。因此，核磁共振 (NMR) 和質(zhì)譜 (MS) 等儀器分析技術(shù)也應(yīng)加入鑒定的過程中，以確保準(zhǔn)確獲取揮發(fā)性代謝物的化學(xué)特性。

3) 全二維氣相色譜飛行質(zhì)譜聯(lián)用儀 (GC × GCTOFMS) 等高分辨儀器在對(duì)具有EAG 活性化合物的分離鑒定中也起著非常重要的作用，但目前尚未看到有研究將全二維氣相色譜技術(shù)與EAG 耦合使用的研究報(bào)道，在未來的研究中應(yīng)注重不同技術(shù)的結(jié)合，提高化合物的分離度和結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4) 昆蟲信息素通常具有揮發(fā)性較強(qiáng)、含量較低、組成復(fù)雜等特點(diǎn)，當(dāng)儀器鑒定和量化信息素的靈敏度較低時(shí)，需要采用一些特殊的前處理方法進(jìn)行捕獲及富集。近年來，一些快速、高富集、高效提取方法正在應(yīng)用于信息素的采集，比如固相微萃取技術(shù)、動(dòng)態(tài)頂空分析法、頂空-固相微萃取和直接接觸吸附萃取等，可將目標(biāo)化合物富集在不同吸附材料 (如多孔聚合物、活性纖維或特殊涂層材料) 上，而吸附強(qiáng)度很大程度上依賴于材料對(duì)揮發(fā)性分子的親和力，因此可根據(jù)不同化合物的分子質(zhì)量來選擇或優(yōu)化不同的吸附材料性能。這些方法具有應(yīng)用范圍廣、專一性高的優(yōu)點(diǎn)，尤其是可從生物活體中直接獲得VOC，在信息化合物采集及富集方面具有很大優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，研究者應(yīng)根據(jù)研究目的，采用合理的試驗(yàn)方法才能得到準(zhǔn)確的研究結(jié)果。隨著對(duì)理論研究的不斷深入，相信電生理技術(shù)將在化學(xué)生態(tài)分析領(lǐng)域中會(huì)有更廣闊的應(yīng)用前景。