馮家陽(yáng), 李常凱, 丁勝利, 劉 佳, 尹新明,安世恒, 那日松, 劉曉光

(省部共建小麥玉米作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南省害蟲(chóng)綠色防控國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室/河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，鄭州 450002)

RNA 干擾 (RNA interference，RNAi) 是由雙鏈RNA (double-stranded RNA，dsRNA) 誘發(fā)，經(jīng)過(guò)體內(nèi)一系列作用，引起與之匹配的mRNA 降解或表達(dá)受到抑制，從而降低靶基因表達(dá)的一種生物學(xué)現(xiàn)象。RNAi 廣泛存在于植物、微生物和動(dòng)物中。植物中最早由Jorgensen 等[1]在研究矮牽牛的兩種不同色素基因疊加時(shí)發(fā)現(xiàn)；微生物中則是Cogoni[2]在研究粗糙脈胞霉Neurospora crassa內(nèi)源性類(lèi)胡蘿卜素基因時(shí)，首次檢測(cè)到該基因的轉(zhuǎn)錄可受到外源同源基因片段抑制；動(dòng)物中，最早由Guo 等[3]在研究野生型秀麗線蟲(chóng)Caenorhabditis elegans生殖細(xì)胞不對(duì)稱分裂和細(xì)胞極性的建立中觀察到。隨后，經(jīng)Fire 等進(jìn)一步研究，驗(yàn)證了外源dsRNA 可阻礙C.elegans特定基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而導(dǎo)致靶標(biāo)基因的沉默或下調(diào)，并將這一現(xiàn)象正式命名為RNAi[4]。由于RNAi 對(duì)靶標(biāo)基因沉默的特異性和高效性，因而可作為一種便捷手段用于病蟲(chóng)害防控及農(nóng)藥新靶標(biāo)的篩選與鑒定[5]。至今，RNAi 技術(shù)已被廣泛研究并應(yīng)用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，主要包括植物改良、有害生物基因功能研究及防控應(yīng)用等方面。

1 RNAi 類(lèi)型及作用機(jī)制

誘發(fā)RNAi 的分子可分為小干擾RNA (small interfering RNA，siRNA)、微小RNA (microRNA，miRNA) 和P 轉(zhuǎn)座子誘導(dǎo)互作RNA (P-elementinduced wimpy testis interacting RNA，piRNA) 等類(lèi)型。siRNA 是由外源RNA 或外源載體等進(jìn)入細(xì)胞后產(chǎn)生的一系列小RNA，可與目標(biāo)mRNA 互補(bǔ)[6-7]；大多數(shù)miRNA 屬內(nèi)源性RNA，首先在RNA 聚合酶II 參與下轉(zhuǎn)錄生成初級(jí)轉(zhuǎn)錄物pri-microRNA，隨后經(jīng)過(guò)兩次剪切成熟，其降解功能的行使不一定需與靶標(biāo)mRNA完全互補(bǔ)；而piRNA 常與Piwi家族蛋白結(jié)合，可通過(guò)從頭合成 (初級(jí)) 與“乒乓”循環(huán) (次級(jí)) 兩種路徑產(chǎn)生，在生殖或其他細(xì)胞中，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平這兩個(gè)階段的精細(xì)調(diào)控，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子的沉默[8-10]。在不同生物中，RNAi 作用機(jī)制類(lèi)似，但又不盡相同。外源dsRNA 或內(nèi)源性前體微小RNA (Pre-miRNA) 可被Dicer 酶特異性識(shí)別后進(jìn)行有效切割而形成，加上生殖細(xì)胞中形成的piRNA，共同形成有RNAi功能的、長(zhǎng)度一般穩(wěn)定在21～26 nt 的RNA 片段，這些短鏈RNA 中的反義鏈與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Argonaute(AGO) 等蛋白作用，組成RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，該復(fù)合物能夠特異性識(shí)別靶mRNA并與之結(jié)合，隨后引起靶mRNA 片段降解、切割，進(jìn)而引起靶基因的沉默或表達(dá)下調(diào)。同時(shí)，在植物中以及某些其他非植物物種中，外源性siRNA 在RNA 依賴的RNA 聚合酶 (RNA-depend RNA polymerase，RdRP) 作用下，將自身的反義鏈作為擴(kuò)增引物，以靶標(biāo)mRNA 為模板，重新復(fù)制成dsRNA，經(jīng)過(guò)降解形成新的siRNA (次級(jí)siRNA，secondary siRNA)。這種新形成的siRNA 可以繼續(xù)與RISC復(fù)合物結(jié)合并作用于mRNA，使其降解，該過(guò)程不斷循環(huán)，進(jìn)入級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)階段，從而提升了與靶標(biāo)基因結(jié)合的特異性和干擾的高效性，為RNAi 的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)[11,12]。

2 RNAi 技術(shù)在農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害防控中的研究及應(yīng)用

RNAi 技術(shù)主要通過(guò)兩種方式應(yīng)用于病蟲(chóng)害防控，即寄主誘導(dǎo)的基因沉默 (host-induced gene silencing，HIGS) 和噴霧誘導(dǎo)的基因沉默 (sprayinduced gene silencing，SIGS)。HIGS 主要通過(guò)在轉(zhuǎn)基因作物中表達(dá)出一類(lèi)針對(duì)害蟲(chóng)或病原物的dsRNA，SIGS 則更類(lèi)似于傳統(tǒng)農(nóng)藥的施用方法，通過(guò)非轉(zhuǎn)基因手段，將體外合成的dsRNA 直接施用。不同途徑產(chǎn)生的dsRNA 一旦傳遞至有害靶標(biāo)生物體內(nèi)，可進(jìn)一步將靶標(biāo)基因沉默而使其失去功能，最終抑制有害生物的正常生長(zhǎng)發(fā)育或提高宿主植物的抗逆能力，為作物安全生產(chǎn)提供保障[8,13-18]。

2.1 RNAi 在害蟲(chóng)防控中的研究及應(yīng)用

作為一種反向遺傳工具，RNAi 可引起靶基因的缺失或下調(diào)，最終通過(guò)基因功能或表型缺失來(lái)驗(yàn)證已知或探索未知基因的功能[19-20]。RNAi 技術(shù)在昆蟲(chóng)領(lǐng)域的應(yīng)用最初見(jiàn)于遺傳學(xué)家構(gòu)建的大量黑腹果蠅Drosophila melanogaster轉(zhuǎn)基因品系 (見(jiàn)http://flybase.org/)，以此推動(dòng)了果蠅遺傳發(fā)育機(jī)制的解析。隨著該技術(shù)的不斷完善，目前已作為一種常規(guī)手段被用于昆蟲(chóng)生理生化研究，在鞘翅目[21-23]、鱗翅目[24-26]、半翅目[27-28]、膜翅目[29]、直翅目[30-31]和纓翅目[27,32]等農(nóng)業(yè)昆蟲(chóng)及蜚蠊目[33-34]和雙翅目[35-36]等衛(wèi)生害蟲(chóng)中得到了廣泛使用，為該技術(shù)在害蟲(chóng)綜合防控領(lǐng)域的應(yīng)用提供了重要的理論基礎(chǔ)。

康樂(lè)團(tuán)隊(duì)利用RNAi 技術(shù)，分別對(duì)飛蝗Locusta migratoria重要神經(jīng)肽NPF (neuropeptide F) 與細(xì)胞色素P450 (cytochrome P450，CYP450) 家族基因的功能進(jìn)行了深入挖掘，首次揭示了NPF與CYP305M2基因在參與飛蝗群居型和散居型轉(zhuǎn)變、適應(yīng)環(huán)境以及躲避天敵中的分子生態(tài)學(xué)機(jī)制，為監(jiān)測(cè)蝗蟲(chóng)種群動(dòng)態(tài)變化及開(kāi)展有害生物生態(tài)治理提供了重要依據(jù)[37-38]。而張友軍團(tuán)隊(duì)[39]利用人工合成dsRNA 和VIGS (virus induced gene silencing，病毒誘導(dǎo)的基因沉默) 構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物的方法，通過(guò)RNAi 反向遺傳技術(shù)，解析了煙粉虱Bemisia tabaci體內(nèi)一個(gè)關(guān)鍵基因即酚糖丙二?；D(zhuǎn)移酶 (phenolic glucoside malonyltransferase，PMaT) 基因1，參與了試蟲(chóng)取食正常番茄葉片后對(duì)體內(nèi)植物次生代謝產(chǎn)物的解毒代謝過(guò)程，并系統(tǒng)證明了該基因是煙粉虱在長(zhǎng)期演化過(guò)程中成功從植物基因組、經(jīng)水平遺傳獲得，在一定程度上揭示了煙粉虱生態(tài)適應(yīng)性增強(qiáng)的重要原因，為進(jìn)一步開(kāi)展生態(tài)治理和新的生物或化學(xué)農(nóng)藥開(kāi)發(fā)提供了全新的思路。Arce 等[40]通過(guò)RNAi 技術(shù)對(duì)玉米根葉甲Diabrotica virgifera幼蟲(chóng)CO2候選受體基因DvvGr2的功能驗(yàn)證，一定程度解釋了地下害蟲(chóng)在苗期如何為害作物根部、以及巧妙定位寄主植物的重要生態(tài)學(xué)機(jī)制。同樣，這些生態(tài)理論的不斷完善和發(fā)展，也極大促進(jìn)和調(diào)整了RNAi 的應(yīng)用范圍與害蟲(chóng)防控策略，即通過(guò)干擾參與害蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的重要基因，并將其作為殺蟲(chóng)靶標(biāo)，進(jìn)而應(yīng)用于害蟲(chóng)防控，這些領(lǐng)域也逐漸成為研究熱點(diǎn)。

Mao 等[41]首次構(gòu)建了能夠表達(dá)含有棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa armigera(Hübner)P450基因dsRNA片段的轉(zhuǎn)基因棉花，在幼蟲(chóng)取食該轉(zhuǎn)基因棉花葉片后，通過(guò)將害蟲(chóng)體內(nèi)棉酚解毒基因P450表達(dá)量調(diào)低，成功抑制了幼蟲(chóng)的取食為害，為有害生物防控提供了里程碑式的新策略。而早期轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物一般采用的是植物細(xì)胞核遺傳轉(zhuǎn)化 (nuclear transformation) 技術(shù)，隨后又建立了植物葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù) (chloroplast transformation)[16,42]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，由于植物細(xì)胞的質(zhì)體 (葉綠體) 中缺少RNAi 途徑所需要的Dicer 酶，使得葉綠體能夠穩(wěn)定地積累長(zhǎng)dsRNA (圖1)。相比而言，通過(guò)葉綠體轉(zhuǎn)化dsRNA 較之細(xì)胞核轉(zhuǎn)化更具干擾效果。因此，可利用植物表達(dá)昆蟲(chóng)特異性外源dsRNA/hpRNA(hairpin RNA)，確保昆蟲(chóng)通過(guò)不同取食方式攝入的長(zhǎng)dsRNA 的完整性，一旦這些長(zhǎng)dsRNA 進(jìn)入昆蟲(chóng)腸道，即可被Dicer 酶特異性識(shí)別，從而提升干擾效率及殺蟲(chóng)效果[43]。還有研究者利用參與昆蟲(chóng)激素合成的基因或激素參與的信號(hào)通路中某些重要基因，將其作為靶標(biāo)基因去合成相應(yīng)的dsRNA，之后，該dsRNA 或摻入飼料飼喂試蟲(chóng)，或直接注射蟲(chóng)體，其結(jié)果或顯著抑制了幼蟲(chóng)取食，或減輕了蟲(chóng)體重量，或形成畸形蛹等表型，甚至引起蟲(chóng)體最終死亡，為篩選高致死性靶標(biāo)基因、拓展RNAi 害蟲(chóng)防控策略提供了新的研究思路[41,43-44]。

圖1 不同RNAi 轉(zhuǎn)基因策略 (經(jīng)修改，引自Whyard[46])Fig.1 Different strategies of RNAi transgene[46]

隨著研究的進(jìn)一步深入，諸多具有致死效應(yīng)的潛在靶基因通過(guò)RNAi 的方法被鑒定出來(lái)，如ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (ATP-binding cassette transporter，ABC transporter) H1 基因、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸脫氫酶 (reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate dehydrogenase，NADPH dehydrogenase) 基因、甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (glycerol-3- phosphate dehydrogenase，G3PDH)基因、雄性特異性致死3 蛋白 (male-specific lethals，MSL3) 基因[45]、GW182 同源蛋白家族(GW182 homologue，GAWKY) 基因、驅(qū)動(dòng)蛋白Kinesin 基因、Sec23、蔗糖非發(fā)酵蛋白7 (sucrose non-fermenting protein 7，SNF7) 基因、26S 核糖體酶調(diào)節(jié)亞基 (26S protease regulatory subunit 6B，26Sprot) 基因[47-48]、蛋白酶亞基5 (proteasome subunit beta 5，PSMB5) 基因和酚糖丙二酰基轉(zhuǎn)移酶1 (phenolic glucoside malonyltransferases，PMaT1) 基因[39]等。根據(jù)這些基因片段合成相應(yīng)的dsRNA，以不同方式飼喂幼蟲(chóng)，最終可造成靶標(biāo)昆蟲(chóng)的較高死亡率，為利用RNAi技術(shù)開(kāi)展害蟲(chóng)防控提供了潛在的靶標(biāo)基因。目前，含有能夠表達(dá)Snf7dsRNA 的轉(zhuǎn)基因玉米品種已開(kāi)始用于防控玉米根葉甲，該玉米品種于2017 年經(jīng)美國(guó)環(huán)保署(EPA) 批準(zhǔn)，成為全球第一個(gè)以RNAi為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)基因玉米[48]；而開(kāi)發(fā)的帶有PSMB5基因的dsRNA生物農(nóng)藥目前也正在加緊申請(qǐng)美國(guó)EPA 注冊(cè)，有望成為第一款可噴施dsRNA 類(lèi)生物殺蟲(chóng)劑的上市產(chǎn)品[49]。近幾年的研究成果 (表1) 進(jìn)一步表明，RNAi 技術(shù)在害蟲(chóng)防控中正發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。

表1 近年來(lái)RNAi 技術(shù)在害蟲(chóng)防控中的研究及應(yīng)用Table 1 The application of RNAi technology in pest control in recent years

續(xù)表1Table 1 (Continued)

續(xù)表1Table 1 (Continued)

2.2 RNAi 技術(shù)在真菌等病害防控中的研究及應(yīng)用

同害蟲(chóng)防控類(lèi)似，研究者在將RNAi 用于植物病害研究與防控時(shí)，也主要采用HIGS 和SIGS兩種策略[27,71]。對(duì)于大多數(shù)真菌病害的防控，不同學(xué)者在采用HIGS 策略上也做了大量工作。例如，目前已明確與病原菌侵染寄主毒力相關(guān)的基因有Chs3b[72]，Ave1、Sge1和NLP1[73]以及致病效應(yīng)蛋白基因SvrPm3a1/f1[74]等，利用這些靶標(biāo)基因構(gòu)建的dsRNA 瞬轉(zhuǎn)植株或穩(wěn)轉(zhuǎn)植株，均能夠在一定程度上抵御多種真菌病害的進(jìn)一步侵染。而SIGS 作為HIGS 策略的模擬與補(bǔ)充，具有其顯著優(yōu)勢(shì)，首先其不需要開(kāi)發(fā)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化植物，其次在公眾認(rèn)知上具有一定的接受度，目前已被證明可以通過(guò)該方法有效控制灰葡萄孢和禾谷鐮刀菌等真菌的侵染[75,76]。

此外，針對(duì)由植物感染病毒引起的病害則需要區(qū)別對(duì)待，由于病毒大多由刺吸式害蟲(chóng)傳播，因此RNAi 的應(yīng)用策略需要轉(zhuǎn)移至防蟲(chóng)以控病。比如灰飛虱Laodelphax striatellus是傳播黑條矮縮病毒 (rice black-streaked dwarf virus，RBSDV) 的主要媒介，因此，通過(guò)防蟲(chóng)以阻斷病毒傳播是其綜合治理的首選，可將防病間接轉(zhuǎn)化為利用RNAi防控昆蟲(chóng)的策略而實(shí)現(xiàn)[77]。其次，還可利用病毒傳播阻斷機(jī)制，根據(jù)媒介昆蟲(chóng)參與病毒復(fù)制和裝配的潛在功能蛋白，通過(guò)RNAi 將該功能蛋白表達(dá)水平顯著調(diào)低，從而可顯著降低刺吸式害蟲(chóng)對(duì)病毒的傳播[78]。同時(shí)，還可進(jìn)一步深入挖掘植物、昆蟲(chóng)與病原菌三者的營(yíng)養(yǎng)關(guān)系，提升作物自身的抗逆水平[79]。此外，也可單純從植物病毒本身出發(fā)，利用RNAi 開(kāi)展防控工作。Bonfim 等[80]根據(jù)病毒AC1基因的序列區(qū)，成功構(gòu)建了能夠產(chǎn)生高抗菜豆金色花葉病毒 (bean golden mosaic virus，BGMV) 的轉(zhuǎn)基因菜豆Phaseolus vulgaris。Holeva 等[81]根據(jù)黃瓜花葉病毒 (cucumber mosaic virus，CMV) 外殼蛋白 (coat protein，CP) 等關(guān)鍵基因序列區(qū)，成功合成了相應(yīng)的dsRNA，并同時(shí)在體外和活體植株進(jìn)行了抗病毒測(cè)定：在體外抗病毒測(cè)定中，dsRNA 無(wú)論是在接種前或與病毒同時(shí)接種，均具有很好的抗病毒效果；而在活體植株中檢測(cè)，則發(fā)現(xiàn)CPdsRNA 具有更好的防效。類(lèi)似地，Vadlamudi 等[82]和Ravelonandro 等[83]以CP 基因?yàn)榘悬c(diǎn)，構(gòu)建了抗番木瓜環(huán)斑病毒 (papaya ringspot virus，PRSV) 和李痘病毒 (plum pox virus，PPV) 的轉(zhuǎn)基因植株，例如轉(zhuǎn)基因木瓜華農(nóng)1 號(hào)番木瓜的成功培育，為我們國(guó)家番木瓜農(nóng)業(yè)健康生產(chǎn)構(gòu)筑了堅(jiān)實(shí)的保障[84]。Ghag 等[85]全面總結(jié)了利用RNAi 技術(shù)防控香蕉種植中多種由病毒、真菌和細(xì)菌等病原物所致病害的防控效果。這些最新研究成果 (表2) 明確了RNAi 策略在總體上能夠有效保證植物免受病毒的侵襲，為進(jìn)一步研究奠定了理論基礎(chǔ)。

表2 近年來(lái)RNAi 技術(shù)在植物病原真菌防控中的研究及應(yīng)用Table 2 The application of RNAi technology in the control of plant fungal diseases in recent years

續(xù)表2Table 2 (Continued)

2.3 RNAi 技術(shù)在植物線蟲(chóng)防控中的研究及應(yīng)用

RNAi 技術(shù)在植物抗寄生線蟲(chóng)中的研究也有較大進(jìn)展，研究者將部分線蟲(chóng)基因通過(guò)轉(zhuǎn)基因植物介導(dǎo)途徑，獲得了能夠產(chǎn)生相應(yīng)dsRNA 基因的轉(zhuǎn)基因作物，可有效防控線蟲(chóng)的為害。Huang 等[95]通過(guò)體外合成并在擬南芥中表達(dá)了南方根結(jié)線蟲(chóng)Meloidogyne incongnita16D10基因的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，用其飼喂包括南方根結(jié)線蟲(chóng)在內(nèi)的4 種常見(jiàn)植物病原線蟲(chóng)，發(fā)現(xiàn)與用對(duì)照植株飼喂的線蟲(chóng)相比，轉(zhuǎn)基因組線蟲(chóng)侵染活力均呈現(xiàn)不同程度下降。Dalzell等[96]將根結(jié)線蟲(chóng)RNase III 酶相關(guān)基因drosha、dicer以及輔因子pasha分別合成相應(yīng)的siRNA，利用浸潤(rùn)方式處理線蟲(chóng)卵，發(fā)現(xiàn)可引起根結(jié)線蟲(chóng)卵的不規(guī)則生長(zhǎng)和胚胎死亡。類(lèi)似的現(xiàn)象在孢囊線蟲(chóng)中也有發(fā)現(xiàn)。Tian 等[97]采用大豆胞囊線蟲(chóng)Heterodera glycines為研究對(duì)象，以該線蟲(chóng)特異蛋白HgY25 和HgPrp17基因?yàn)槟０澹谵D(zhuǎn)基因大豆中表達(dá)相應(yīng)的siRNA，結(jié)果表明，該轉(zhuǎn)基因大豆根中胞囊線蟲(chóng) (卵) 量平均減少了70%以上，對(duì)大豆包囊線蟲(chóng)后代的種群抑制效果顯著。以RNAi為基礎(chǔ)，結(jié)合生物防控等傳統(tǒng)防控技術(shù)，Blyuss等[98]研究了禾谷孢囊線蟲(chóng)H.avenae及其寄主植物小麥遭受包囊線蟲(chóng)侵染后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，最終挖掘出一系列特異性的si/miRNA，這類(lèi)si/miRNA既能夠特異性沉默因線蟲(chóng)侵染引起上調(diào)的小麥內(nèi)源性mRNA，又能夠直接沉默線蟲(chóng)中與生長(zhǎng)周期、侵染效應(yīng)相關(guān)聯(lián)的基因，從而在一定程度上提升了小麥對(duì)孢囊線蟲(chóng)的抗逆性。Dutta 等[99]進(jìn)一步擴(kuò)大了對(duì)禾谷孢囊線蟲(chóng)候選靶標(biāo)基因的篩選，將其中的一些神經(jīng)肽基因、蛋白酶基因、蛋白酶抑制基因、管家基因、分泌蛋白基因、細(xì)胞壁修飾酶基因、應(yīng)激效應(yīng)基因、分泌蛋白基因、生殖適合度關(guān)聯(lián)基因和化感效應(yīng)基因等諸多功能基因分別成功構(gòu)建了能夠表達(dá)靶標(biāo)基因dsRNA 片段的質(zhì)粒載體，培育出了含有相應(yīng)基因片段對(duì)應(yīng)dsRNA的轉(zhuǎn)基因小麥，隨后對(duì)各轉(zhuǎn)基因小麥開(kāi)展抗逆試驗(yàn)檢測(cè)，最終篩選出了一批能夠顯著抵御線蟲(chóng)穿透植物組織、影響線蟲(chóng)發(fā)育和生殖的重要候選靶標(biāo)基因。隨著RNAi 技術(shù)的不斷提高，更多具有潛在抗植物寄生線蟲(chóng)功能的靶基因正被陸續(xù)篩選出來(lái)，為培育出更多可有效抗 (耐) 寄生性線蟲(chóng)的植物新品種提供了理論基礎(chǔ)[100]。

3 RNAi 技術(shù)的機(jī)遇與挑戰(zhàn)

RNAi 作為自然界普遍存在的現(xiàn)象，從發(fā)現(xiàn)至今已走過(guò)30 余年。該技術(shù)從早期的表象發(fā)現(xiàn)逐漸到深入的機(jī)理探索，從基因功能的研究到有害生物靶標(biāo)基因的挖掘篩選，從單一載體非專(zhuān)一性傳遞至借助各種先進(jìn)材料精準(zhǔn)靶向，正逐步走向現(xiàn)代農(nóng)業(yè)甚至精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。RNAi 作為21世紀(jì)初十大科學(xué)發(fā)現(xiàn)之首，在將來(lái)一段時(shí)間內(nèi)，必將得到更廣泛的研究與應(yīng)用，同時(shí)不可避免地面臨著諸多機(jī)遇和挑戰(zhàn)。

3.1 RNAi 面臨的機(jī)遇

RNAi 對(duì)于靶標(biāo)mRNA 的沉默具有高特異性和選擇性等優(yōu)點(diǎn)，因此，可以通過(guò)基因的篩選和設(shè)計(jì)，達(dá)到對(duì)靶標(biāo)物種精準(zhǔn)防控而不影響有益或非靶標(biāo)物種的目的[101]。隨著人們對(duì)RNAi 技術(shù)的深入探索，可深度挖掘的潛在基因眾多，對(duì)新農(nóng)藥靶標(biāo)篩選具有重要意義[102]。

如何借助合成生物學(xué)，開(kāi)發(fā)高效傳遞載體和挖掘特異性新靶標(biāo)等是目前研究的熱點(diǎn)[103]。RNAi技術(shù)并不排斥現(xiàn)有防控技術(shù)，既能將RNAi 產(chǎn)品延伸，形成一種新的、安全且環(huán)境友好的、與傳統(tǒng)防控優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)的防控策略[104-105]；也可將RNAi與常規(guī)殺蟲(chóng)劑組合應(yīng)用，達(dá)到環(huán)保增效的雙重效果[106]。在載體研究方面，通過(guò)質(zhì)體、納米顆粒負(fù)載dsRNA 或?qū)sRNA 與一部分穿梭多肽連接[33,107]，可以提高dsRNA 進(jìn)入生物體內(nèi)的效率，保證dsRNA 的有效性。其中，借助開(kāi)發(fā)高效的農(nóng)藥載體材料等一系列創(chuàng)新技術(shù)，是實(shí)現(xiàn)將其成功推向市場(chǎng)的最有效途徑[107-108]；或者通過(guò)對(duì)dsRNA 產(chǎn)品進(jìn)行改良，將傳統(tǒng)靶標(biāo)基因小片段進(jìn)行重復(fù)串聯(lián)，形成串聯(lián)重復(fù)dsRNA (concatemerized dsRNAs，C-dsRNAs)。與傳統(tǒng)非串聯(lián)長(zhǎng)dsRNA(non-concatemerized long dsRNA，NCL-dsRNA) 相比，C-dsRNAs 的干擾效率顯著提升，而且其使用劑量也有大幅下降[109]。此外，在靶基因的篩選和功能驗(yàn)證過(guò)程中，還可借助CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，快速、高效地開(kāi)展基因篩選工作，從而避免因傳統(tǒng)RNAi 篩選造成的脫靶效應(yīng)[110]。在對(duì)RNAi 有效靶標(biāo)基因不斷進(jìn)行挖掘的同時(shí)，提升其干擾效率的技術(shù)開(kāi)發(fā)也在穩(wěn)步推進(jìn)中，因此，基于RNAi 技術(shù)的生物農(nóng)藥有望以轉(zhuǎn)化性 (以轉(zhuǎn)基因形式) 和非轉(zhuǎn)化性 (以傳統(tǒng)農(nóng)藥使用方式，作為誘餌或陷阱、納米載體、根莖 (樹(shù)干) 注射劑、莖葉噴霧劑、種子處理劑、土壤澆灌或造粒緩釋劑，重組共生菌或病毒等) 的形式開(kāi)發(fā)出來(lái)，最終進(jìn)入市場(chǎng)[111-112]。相信隨著RNAi 技術(shù)應(yīng)用范圍的進(jìn)一步拓展，結(jié)合目前可在基因組水平上批量甚至借助人工智能手段大規(guī)模篩選藥物靶標(biāo)等技術(shù)的嵌入，將來(lái)一定會(huì)發(fā)現(xiàn)更多的潛在藥物靶標(biāo)，從而大大降低成本，顯著提升dsRNA 產(chǎn)品的殺蟲(chóng)效率，進(jìn)一步加快新農(nóng)藥的研發(fā)和應(yīng)用[113]。

3.2 RNAi 面臨的挑戰(zhàn)

事實(shí)上，RNAi 技術(shù)同樣也面臨著巨大的挑戰(zhàn)，目前其在實(shí)際研究和應(yīng)用中還存在一些突出的短板。首先，田間病蟲(chóng)害種類(lèi)繁多，且在各自發(fā)生環(huán)境中具有典型的物種多樣性，即使針對(duì)某一同源基因的不同靶標(biāo)害蟲(chóng)或同一害蟲(chóng)不同靶標(biāo)位點(diǎn)的選擇，在干擾效率上都可能存在顯著差異，這些關(guān)系到有害生物防控廣度和深度的具體問(wèn)題均值得深入思考。其次，由于不同生物體內(nèi)dsRNA 的吸收效率和傳遞方式各異，不可避免地造成干擾效率及干擾效果的差異，因此，如何提高RNAi 藥物的干擾效果亦至關(guān)重要[114-116]。另外，農(nóng)戶最為關(guān)心的就是防控成本，即如何將RNAi產(chǎn)品成本控制在用戶可接受范圍內(nèi)。最后，RNAi面臨的最大挑戰(zhàn)是抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估這一重要環(huán)節(jié)，而任何科技的發(fā)展和新技術(shù)的應(yīng)用都可能存在不可預(yù)知的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

有關(guān)RNAi 殺蟲(chóng)譜的問(wèn)題，我們需要進(jìn)一步借助基礎(chǔ)研究，以病原微生物或昆蟲(chóng)為分類(lèi)單元，分別深入挖掘不同有害生物中的共同靶標(biāo)基因，既要保證基于RNAi 技術(shù)的產(chǎn)品 (RNAi 產(chǎn)品)其殺蟲(chóng)效果在同類(lèi)有害生物中的高度特異性，同時(shí)還要避免對(duì)天敵昆蟲(chóng)或有益微生物造成的危害，保證其高度選擇性。此外，針對(duì)該產(chǎn)品面臨的吸收效率及穩(wěn)定性問(wèn)題，則可以通過(guò)對(duì)RNAi農(nóng)藥劑型的研究和改進(jìn)加以解決；同時(shí)，有效改善田間環(huán)境中由于雨水、紫外線、高溫等復(fù)雜自然條件而引起的RNAi產(chǎn)品持效期過(guò)短的現(xiàn)狀，可避免無(wú)法有效保障其防控效果的問(wèn)題[103]。至于成本問(wèn)題，相信隨著科技的發(fā)展，有望通過(guò)簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝，避免或減少RNAi 的脫靶效應(yīng)、提升干擾效果以降低使用量，從而最終降低RNAi 產(chǎn)品成本[104]。另外，抗性問(wèn)題是研究者最為關(guān)注的問(wèn)題，雖然目前田間尚未報(bào)道相關(guān)抗性事件，但在室內(nèi)模擬已有類(lèi)似結(jié)果[117]，因此，在研究開(kāi)發(fā)RNAi 產(chǎn)品的過(guò)程中，需要預(yù)先考慮到延緩或避免其抗性產(chǎn)生的應(yīng)對(duì)措施，要充分根據(jù)病蟲(chóng)害抗性機(jī)理、RNAi 作用機(jī)制及dsRNA 傳輸效果、靶標(biāo)有害生物的微環(huán)境和劑量累積效應(yīng)等方面制定合理的抗性治理策略，如選擇多個(gè)不同功能的靶基因、將化學(xué)農(nóng)藥或生物農(nóng)藥與dsRNA聯(lián)合使用、與常規(guī)轉(zhuǎn)Bt 基因優(yōu)化組合構(gòu)建新的轉(zhuǎn)基因品種等，充分發(fā)揮有害生物綜合治理策略，同時(shí)還需加強(qiáng)抗性監(jiān)測(cè)[118]。

4 展望

近年來(lái)，依托RNAi 技術(shù)開(kāi)發(fā)出的眾多產(chǎn)品，作為新興農(nóng)藥正逐步在室內(nèi)和田間展開(kāi)各種途徑的試驗(yàn)與應(yīng)用，為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展繪就了一幅新藍(lán)圖[119]。未來(lái)一段時(shí)間內(nèi)，我們既要面對(duì)各國(guó)搶占RNAi 各項(xiàng)技術(shù)新高地的激烈競(jìng)爭(zhēng)局面，又要有防范RNAi 走向市場(chǎng)化后所帶來(lái)的潛在風(fēng)險(xiǎn)意識(shí)，這就需要相關(guān)科研單位與專(zhuān)門(mén)機(jī)構(gòu)共同探討與商議，最終確定一套逐步完善的、標(biāo)準(zhǔn)化的評(píng)估方案，對(duì)樣品逐步實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化控制，將田間數(shù)據(jù)和原始數(shù)據(jù)收集整理后放置于公共開(kāi)源平臺(tái)(如：國(guó)家農(nóng)業(yè)科學(xué)數(shù)據(jù)中心)，以科學(xué)、開(kāi)放的態(tài)度將其向前推進(jìn)，確保整個(gè)行業(yè)上下游的健康發(fā)展。未來(lái)，相信基于RNAi 技術(shù)的病蟲(chóng)害防控應(yīng)用策略將繼續(xù)煥發(fā)新的活力，為植保綜合防控提供新理念。

致謝：感謝河南農(nóng)業(yè)大學(xué)關(guān)若冰老師在文章修改過(guò)程中的大力幫助與指導(dǎo)。