黃中善 黃文炳 梁家綏

（1.南寧市賓陽(yáng)縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西 南寧 530400；2. 廣西悅牧生物科技有限公司，廣西 南寧 530007）

鏈球菌（Streptococcus）是重要的人畜共患傳染病病原菌，可感染人以及豬、牛、羊等多種動(dòng)物，其主要傳播方式為經(jīng)口、呼吸道及破損的皮膚傷口感染，也可垂直傳播。［1］鏈球菌屬球菌科、鏈球菌屬、革蘭氏陽(yáng)性兼性厭氧菌。豬鏈球菌（Streptococcus suis）對(duì)各種品種豬群、不同年齡及性別的豬均易感，可引起腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥、多發(fā)性漿膜炎、肺炎和急性死亡等［2，3］，是世界范圍內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)最常見(jiàn)的細(xì)菌性疾病之一，危害著生豬養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。更為重要的是，豬鏈球菌能夠通過(guò)傷口或豬產(chǎn)品感染人，引起人腦膜炎、敗血癥等重要的疾?。?］，對(duì)相關(guān)從業(yè)人員的身體健康和公共衛(wèi)生構(gòu)成嚴(yán)重威脅。

目前，根據(jù)鏈球菌莢膜多糖抗原的差異，可將其分為35個(gè)血清型，即1~34及1/2型。［5］對(duì)豬具有較強(qiáng)致病性的主要血清型有1型、2型、7型和9型，其中血清2型致病力最強(qiáng)［6］，危害最為突出。本試驗(yàn)采集廣西賓陽(yáng)縣某規(guī)模化豬場(chǎng)2021年6月發(fā)生的疑似豬鏈球菌的組織病料，通過(guò)細(xì)菌分離、生化鑒定、PCR診斷及藥敏試驗(yàn)，鑒定為血清2型豬鏈球菌，為2型豬鏈球菌的診斷與治療提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 發(fā)病情況及病料采集

2021年5月18日廣西賓陽(yáng)縣某規(guī)?；i場(chǎng)外購(gòu)963頭體重15 kg左右的保育豬苗回來(lái)飼養(yǎng)，至5月31日起陸續(xù)出現(xiàn)豬只突然倒地、四肢劃水及急性死亡的病情，每天死亡2~3頭豬；用藥可以暫時(shí)控制病情，停藥后又出現(xiàn)反彈。6月11日解剖并采集了2頭病死豬的肺臟、脾臟、腎臟、腦組織及淋巴結(jié)等組織器官分別進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

1.1.2 主要試劑

普通營(yíng)養(yǎng)肉湯，胰蛋白大豆瓊脂（TSA）和胰蛋白大豆肉湯（TSB）均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；DNA提取試劑盒以及PCR相關(guān)試劑、DNA Ladder Marker等均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；微生物微量生化鑒定管和抗生素藥敏紙片均購(gòu)自于杭州天和微生物試劑有限公司；革蘭氏染液試劑盒為珠海貝索生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；其他常規(guī)試劑均為分析純；相關(guān)引物由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 病原分離純化

無(wú)菌操作采集的肺臟、脾臟、腎臟、腦和淋巴結(jié)等病料分別劃線接種于TSA平板（含5%的新生牛血清），置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，觀察菌落生長(zhǎng)形態(tài)特征，挑選形態(tài)一致的優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢及挑單菌落進(jìn)一步分離純化。

1.2.2 生化試驗(yàn)

按生化試驗(yàn)的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將分離純化的菌株分別接種于甘露醇、甘露糖、棉籽糖、山露醇、阿拉伯糖、山梨醇、水楊素、β半乳糖苷、馬尿酸鹽、松三糖、乳糖、核糖、七葉苷、精氨酸雙水解酶和精氨酸脫羥酶等細(xì)菌生化反應(yīng)管，依據(jù)伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)對(duì)各生化反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行判定。［7］

1.2.3 血清型的PCR鑒定檢測(cè)

用分離純化的細(xì)菌提取的基因組DNA做為模板，參照文獻(xiàn)［8］根據(jù)豬鏈球菌不同血清型菌株莢膜多糖基因的特異性設(shè)計(jì)引物，分別用于豬鏈球菌血清1、2、7和9型的鑒定（表1）。PCR擴(kuò)增反應(yīng)為25 μL體系，分別為2×PCR pre-Mix 12.5 μL、ddH2O 9.0 μL、上下游引物各0.5 μL、模板2.5 μL。PCR反應(yīng)條件為95℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 50 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min；最后4℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳并觀察記錄結(jié)果。

表1 豬鏈球菌血清1、2、7、9型鑒定的引物

1.2.4 藥物敏感性試驗(yàn)

選取紅霉素、氟苯尼考、阿莫西林、多黏菌素B、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、林可霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、卡那霉素等28種常用藥物對(duì)分離純化的細(xì)菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，參照文獻(xiàn)采用瓊脂擴(kuò)散法（K-B法）進(jìn)行。

1.3 綜合防治措施

根據(jù)豬場(chǎng)發(fā)病特征、實(shí)驗(yàn)室診斷的結(jié)果以及豬場(chǎng)用藥時(shí)能夠控制病情而停藥后出現(xiàn)反彈的實(shí)際情況，建議豬場(chǎng)主要用豬鏈球菌滅活疫苗進(jìn)行緊急免疫，同時(shí)再用敏感藥物進(jìn)行控制。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離純化及形態(tài)特征

將組織病料接種的TSA平板置37℃溫箱，經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)其中一頭病死豬的肺臟、淋巴結(jié)和腦組織接種的平板均有細(xì)菌生長(zhǎng)；而另外一頭豬的肺、脾、腎和淋巴結(jié)也能培養(yǎng)出細(xì)菌，但腦組織沒(méi)分離出細(xì)菌，送檢病料樣品各器官細(xì)菌分離結(jié)果如表2所示。在TSA平板上均可觀察到形態(tài)一致，針尖大小、灰白透明、表面光滑的近圓形的菌落。

表2 送檢病料樣品各器官細(xì)菌分離結(jié)果

挑取單菌落涂片后進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢為G+菌，且以多個(gè)圓形或卵圓形組成的短鏈形式存在，符合豬鏈球菌的形態(tài)特征，具體鏡檢形態(tài)特征如圖1所示。

圖1 分離菌株革蘭氏染色鏡檢形態(tài)特征

2.2 生化特性的鑒定

取分離純化后菌株開(kāi)展各種生化試驗(yàn)檢測(cè)。分離菌株的生理生化特征如表3所示，結(jié)果顯示，分離菌株糖、醇發(fā)酵能力以及各種生化試驗(yàn)的鑒定結(jié)果與豬鏈球菌的生化特性完全相符。

表3 分離菌株的生理生化特征

2.3 豬鏈球菌的分型鑒定

用豬鏈球菌的特異性分型引物來(lái)進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。PCR鑒定結(jié)果如圖2所示，結(jié)果顯示，豬鏈球菌血清1、7和9型的特異性引物均未擴(kuò)出目的條帶，而豬鏈球菌血清2型的引物擴(kuò)增出450 bp的特異性目的條帶，表明該分離株為豬鏈球菌血清 2型。

圖2 豬鏈球菌血清1型、2型、7型、9型的PCR鑒定結(jié)果

2.4 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

采用常用28種抗生素對(duì)分離菌株進(jìn)行藥物敏感性測(cè)定，結(jié)果詳見(jiàn)表4。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，該鏈球菌對(duì)頭孢哌酮、頭孢克肟、頭孢噻肟、米諾環(huán)素、萬(wàn)古霉素、壯觀霉素6種藥物高度敏感；對(duì)頭孢西丁、頭孢拉定、頭孢呋辛、紅霉素、強(qiáng)力霉素、阿奇霉素、亞胺培南、氟苯尼考、阿莫西林、多黏菌素B、呋喃妥因11種藥物中度敏感；對(duì)鏈霉素、苯唑西林、氨曲南、左氟沙星、卡那霉素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、林可霉素、青霉素、氧氟沙星、泰樂(lè)菌素11種藥物低度敏感或者耐藥。

表4 分離菌株的藥物敏感性結(jié)果 單位：mm

2.5 防控效果反饋

從5月31日豬場(chǎng)發(fā)生鏈球菌病例以來(lái)，至6月13日累計(jì)死亡28頭豬。6月14日采取豬鏈球菌滅活疫苗的緊急免疫，同時(shí)用敏感藥物進(jìn)行控制，隨后4天總共死亡3頭，第5天之后就沒(méi)有再出現(xiàn)鏈球菌病例，病情得到了完全控制。

3 討論

豬鏈球菌是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要病原菌之一，世界上幾乎所有養(yǎng)豬國(guó)家都廣泛存在該菌。豬鏈球菌血清型眾多，以血清2型危害最為嚴(yán)重。1990年在我國(guó)廣東省豬群中首次發(fā)現(xiàn)血清2型豬鏈球菌［9］，歷史上我國(guó)出現(xiàn)過(guò)2次由2型豬鏈球菌感染引起人死亡的事件。其一是1998年江蘇省豬場(chǎng)暴發(fā)的急性敗血型豬鏈球菌血清2型疫情，造成14人死亡［10］；其二是2005年夏天豬鏈球菌血清2型疫情在四川再次暴發(fā)，疫情殃及養(yǎng)豬從業(yè)者及生豬屠宰人員等，造成38人死亡，引起了世界范圍內(nèi)的高度關(guān)注。［11］除血清2型豬鏈球菌以外，血清1、7和9型等也是常見(jiàn)的引起豬感染發(fā)病的重要血清型，備受獸醫(yī)工作者的重視。

豬鏈球菌病在臨床上表現(xiàn)主要分為關(guān)節(jié)炎型、敗血癥型、腦膜炎型三種［12］。腦膜炎型通常表現(xiàn)為豬只突然倒地、站立不起、四肢劃水、眼瞼腫大和眼球突出的發(fā)病特征，及早發(fā)現(xiàn)及早救治的豬只一般能夠康復(fù)，若發(fā)病超過(guò)2小時(shí)沒(méi)有采取治療措施，基本上以死亡告終。本試驗(yàn)從疑似豬鏈球菌感染的患病死亡豬體內(nèi)分離到病原菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)和生化鑒定確定該菌株為鏈球菌，結(jié)合臨床發(fā)病癥狀，初步判斷為本次疫情為腦膜炎型鏈球菌病。由于鏈球菌莢膜多糖抗原性是確定其血清型的重要依據(jù)，基于莢膜多糖抗原基因的差異設(shè)計(jì)血清型特異引物可以對(duì)鏈球菌分離菌株進(jìn)行精確的鑒定。王花茹［13］等建立的主要致病血清型多重PCR檢測(cè)方法對(duì)豬鏈球菌血清1型、2型、1/2型、7型、9型、14型等6種主要致病血清型檢出率可達(dá)100%。本試驗(yàn)中通過(guò)特異性的PCR引物對(duì)莢膜多糖基因進(jìn)行檢測(cè)，確定所分離的菌株為豬鏈球菌血清2型，為科學(xué)精準(zhǔn)的制定防控措施提供了重要依據(jù)。

為能夠提供可靠的治療方法，本試驗(yàn)對(duì)分離菌株進(jìn)行藥敏測(cè)定。從藥敏試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，分離菌株對(duì)鏈霉素等11種藥物低度敏感或者耐藥，對(duì)頭孢西丁等11種藥物中度敏感，對(duì)頭孢哌酮等6種藥物高度敏感。由于豬場(chǎng)投藥能夠較好的控制病情，但停藥后病情反彈，結(jié)合臨床治療經(jīng)驗(yàn)，建議其配合采取疫苗免疫的策略。據(jù)豬場(chǎng)主反饋，在緊急免疫豬鏈球菌滅活疫苗5天后，就沒(méi)有再出現(xiàn)腦膜炎型鏈球菌的病例，收到了良好的防控效果。