袁 夢，袁月明，陳 輝，俞慕華，段永翔，胡鵬威

沙門氏菌是引起細(xì)菌性食物中毒的主要食源性病原菌，腸炎沙門氏菌(SalmonellaEnteritidisS.Enteritidis) 是沙門氏菌在臨床上最常見的一種血清型，是重要的人獸共患病的病原體，引起人類的胃腸炎和食物中毒[1]，據(jù)統(tǒng)計，約17%沙門氏菌食物中毒事件是由S.Enteritidis引起的[2]。2018-2021年，南山區(qū)由沙門氏菌引起的食物中毒事件中，除了常見S.Enteritidis外還有布利丹沙門氏菌(SalmonellaBlegdamS.Blegdam)，在我區(qū)以往的食物中毒檢測中首次檢測出S.Blegdam。S.Enteritidis與S.Blegdam同屬于D群，均有O9、O12、Hg、Hm抗原，Hq抗原是兩血清型別的唯一區(qū)別。因此本文將33株沙門氏菌進行PFGE溯源分型、全基因組序列以及耐藥表型分析。了解此兩型沙門氏菌的親緣關(guān)系，導(dǎo)致食物中毒之間是否存在關(guān)聯(lián)性，查找源頭；CLC軟件查找MLST管家基因與耐藥基因，分析耐藥基因與耐藥表型之間的關(guān)系，為指導(dǎo)臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2018-2021年33株分離自食物中毒樣品的沙門氏菌，經(jīng)血清學(xué)鑒定為11株為S.Enteritidis，22株為S.Blegdam。藥敏試驗質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC25922。

1.2 主要儀器與試劑 全自動生化鑒定系統(tǒng)(法國生物梅里埃公司)、脈沖場凝膠電泳儀及凝膠成像儀(美國Bio-rad公司)、水浴搖床(美國賽默飛公司)；血清相關(guān)試劑(丹麥SSI)、SeaKem Gold Agarose(美國Cambrex公司)、XbaⅠ限制性內(nèi)切酶與蛋白酶K(日本TaKaRa公司)、藥敏試驗相關(guān)試劑A-3與A-4腸道菌群藥敏板(上海星佰生物技術(shù)有限公司)、全基因組提取試劑盒(美國Promega公司)。全基因組測序由華大基因股份有限公司完成。

1.3 菌株的分離鑒定 所有菌株經(jīng)全自動生化系統(tǒng)鑒定為沙門氏菌。

1.4 PFGE分型試驗 按照國家致病菌識別網(wǎng)技術(shù)規(guī)范—非傷寒沙門菌PFGE分型程序操作說明對菌株進行分型。

1.5 沙門氏菌全基因組提取 按照Promega試劑說明進行。

1.6 序列結(jié)果分析 采用The CLC Genomic Workbench (12.0 version)軟件進行MLST管家基因、耐藥基因查找以及K-mer進化樹分析。

1.7 藥敏試驗 采用微孔稀釋板法，按照試劑說明將稀釋好的菌懸液加入A-3與A-4腸道菌群藥敏板。所得MIC結(jié)果,根據(jù)美國臨床實驗標(biāo)準(zhǔn)委員會NCCLS(2012 年版)的判定標(biāo)準(zhǔn)，對實驗結(jié)果進行敏感(S)、中度敏感(I)與耐藥(R) 的最終判定。30種抗菌藥物分別為：氨芐西林(AMP)、氨芐西林/舒巴坦(AMS)、四環(huán)素(TET)、氯霉素(CHL)、復(fù)方新諾明(SXT)、頭孢唑啉(CFZ)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢西丁(CFX)、慶大霉素(GEN)、亞胺培南(IMI)、萘啶酸(NAL)、阿奇霉素(AZI)、磺胺異噁唑(Sul)、環(huán)丙沙星(CIP)、阿莫西林/克拉維酸(AMC)、頭孢噻肟/克拉維酸(CTX-C)、頭孢他啶/克拉維酸(CAZ-C)、多粘菌素E(CT)、多粘菌素B(PB)、米諾環(huán)素(MIN)、阿米卡星(AMI)、氨曲南(AZM)、頭孢吡肟(FEP)、美羅培南(MEM)、左氧沙星(LEV)、多西環(huán)素(DOX)、卡那霉素(KAN)、鏈霉素(STR)、吉米沙星(GEM)。

2 結(jié) 果

2.1 2018-2021年食物中毒病原檢測結(jié)果

2.1.1 2018-2021年食物中毒事件 2018-2021年食物中毒起數(shù)分別是17、8、6、5起。每年細(xì)菌或病毒所致食物中毒分布見圖1，僅2018年檢測到由沙門氏菌引起的食物中毒事件。2018年由沙門氏菌引起的食物中毒事件共有6起，經(jīng)實驗室血清學(xué)檢測鑒定為D群。3起血清學(xué)鑒定結(jié)果均為S.Enteritidis(O9、O10、Hg、Hm)；3起血清學(xué)鑒定結(jié)果為S.Blegdam(O9、O10、Hg、Hm、Hq)。

圖1 2018-2021年引起食物中毒細(xì)菌及病毒分布圖Fig.1 Map of pathogens causing food poisoning in 2018 to 2021

2.1.2 2018年D群沙門氏菌具體信息 2018年6起由D群沙門氏菌引起食物中毒發(fā)生的時間以及每起對應(yīng)的編號及血清型別，見表1。

表1 D群沙門氏菌引起食物中毒的時間對應(yīng)編號及血清型別Tab.1 Numbers and serotypes of group D Salmonella

2.2 PFGE分型結(jié)果 33株沙門氏菌(22株分離自肛拭子，11株分離自食品)分為8個PFGE型別，見圖2。1～5起，每一起菌株間PFGE型別均一致。第6起的12株菌PFGE型別較為分散，分為6個型別，肛拭子與食品來源的菌株屬于不同的型別，肛拭子與肛拭子之間，食品與食品之間的聚類結(jié)果均不同。PFGEⅠ型包含第6起的4株；PFGEⅡ型包含第5起3株，第6起2株；PFGEⅢ型均為第3起8株；PFGEⅣ型包含第6起3株，第1起2株；PFGEⅤ型與PFGEⅥ型均為第6起各1株；PFGEⅦ包含第2起7株；PFGEⅧ包含第6起與第4起各1株。

圖2 33株菌PFGE聚類圖譜Fig.2 PFGE cluster map of 33 strains

2.3 全基因組序列分析 33株菌全基因組測序后，測序結(jié)果用CLC軟件進行分析(全基因組分析滿足質(zhì)控，Contig N50>20 kb，與參考菌株的覆蓋度>99.0%以及匹配度>96.0%)。該軟件數(shù)據(jù)庫沙門氏菌共有766株菌，從K-mer進化樹關(guān)系來看，見圖3，33株沙門氏菌與數(shù)據(jù)庫其它沙門氏菌比對為獨立的一簇。33株菌的MLST型別均為ST11型， K-mer進化樹、每株菌的血清型、PFGE型別、耐藥基因譜、表型耐藥譜、樣品來源等分布詳見圖4。

圖3 33株菌與CLC數(shù)據(jù)庫沙門氏菌比對結(jié)果Fig.3 Comparison of 33 strains in the CLC Salmonella database

圖4 K-mer進化樹與各菌樣品來源、血清型、耐藥譜與耐藥基因譜Fig.4 K-mer evolutionary tree, sample origin, serotype, drug resistance spectrum and drug resistance gene spectrum of each bacterium

2.4 32株菌基于SNP的系統(tǒng)發(fā)育樹1～5起食物中毒，每起SNP差異數(shù)為1～4，見表2。不同起數(shù)之間SNP平均差異為17.8(標(biāo)準(zhǔn)偏差=5.4，10～27)，第6起食物中毒SNP之間差異較大。32株菌SNP的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖5。

表2 每起食物中毒菌株SNP差異Tab.2 Differencesin SNPs among food poisoning cases

圖5 32株菌SNP的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 SNP phylogenetic tree of 32 strains

2.5 15種表型耐藥檢出情況 33株沙門氏菌進行30種抗菌藥物檢測，共檢出15種抗菌藥物，15種抗菌藥物的具體檢出率見圖6。4種抗菌藥物NAL、AMP、CFZ的檢出率較高，分別為100.00%、57.58%、54.55%，均大于 50%。15種抗菌藥物按照耐藥的種類來分，分屬于十大類耐藥：β-內(nèi)酰胺類(AMP、AMS、AZM)檢出率為57.58%(19/33)；頭孢菌素類(CFZ、CTX、CAZ、FEP)檢出率為54.55%；四環(huán)素類(TET、DOX、MIN)檢出率為15.15%；碳青霉烯類(IMI)檢出率為3.03%；喹諾酮類(NAL)檢出率為100%；磺胺類(Sul)檢出率為66.67%；多肽類(CT)檢出率為3.03%；鏈霉素類(STR)檢出率為39.39%。僅1株來源于肛拭子(S-181)的沙門氏菌對IMI耐藥，此菌耐6類抗菌藥物(見表3)。

注：每種抗菌藥物上方數(shù)字為相應(yīng)的檢出率圖6 33株菌15種抗菌藥物檢出率Fig.6 Detection rates of 15 types of antibiotics in 33 strains

耐藥3類以上屬于多重耐藥，20株菌耐藥大于3類以上(60.60%)，11株菌(33.33%)耐1類藥，2株菌(6.06%)耐2類藥，8株菌(24.24%)耐3類藥，2株菌(6.06%)耐4類藥，7株菌(21.21%)耐5類藥，3株菌(9.09%)耐6類藥，每株菌耐藥譜見表3。β內(nèi)酰胺類-頭孢類-磺胺類-氨基糖苷類-喹諾酮類與β內(nèi)酰胺類-頭孢類-喹諾酮類為優(yōu)勢耐藥譜，檢出率分別為21.21%與18.18%。其中7株(21.21%)菌產(chǎn)ESBL酶(S-182、S-185、S-187、S-188、S-189、S-190、S-191)，均來源于肛拭子，6株攜帶blaCTX-M-14基因。4株僅攜帶blaCTX-M-14基因，1株攜帶blaTEM-1B、aph(3″)-Ib、aph(6)-Id、sul2，1株攜帶blaCTX-M-14、aph(3″)-Ib，1株攜帶blaCTX-M-14、blaTEM-1B、aph(3″)-Ib、aph(6)-Id。

表3 菌株耐藥譜及耐藥種類分布Tab.3 Drug resistance spectrum and species distribution

2.6 耐藥基因與耐藥表型異同 15株菌的耐藥基因與耐藥表型完全符合。S-187、S-190、S-213檢出氨基糖苷類耐藥基因但是未檢出耐藥表型。S-197檢出氯霉素catA1耐藥基因，但耐藥表型為耐氨曲南。S-199、S-200、S-210未檢出耐藥基因，但耐藥表型均對β-內(nèi)酰胺類與喹諾酮類耐藥。S-201、S-202、S-204檢出大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因，但耐藥表型僅表現(xiàn)喹諾酮類耐藥。S-186、S-198、S-203、S-217、S-219、S-220、S-222未檢出耐藥基因，表型僅為喹諾酮類耐藥。S-221檢出β-內(nèi)酰胺類耐藥基因，但表型僅為喹諾酮類耐藥。

3 討 論

2018-2021年南山區(qū)由沙門氏菌引起食物中毒事情有6起，都發(fā)生在2018年均與D群沙門氏菌有關(guān)，血清學(xué)檢測分別為S.Enteritidis與S.Blegdam。從血清學(xué)的角度，每一起食物中毒暴發(fā)事件之間血清型都吻合，但從食物中毒溯源角度，血清分型還不能說明相應(yīng)的問題[3]。

PFGE作為沙門氏菌分型的金標(biāo)準(zhǔn)方法，對于溯源起到重要作用。4月份以來的食物中毒事件中，陸續(xù)分離出S.Enteritidis與S.Blegdam，第1、2、4、5起食物中毒因為采樣等各種原因，僅有肛拭子樣品，未進行食品及其它樣品采集。第3和第6起鏈條相對完整，可以進行溯源研究。PFGE分型結(jié)果來看，D群沙門氏菌分為8個PFGE型別，Ⅰ-Ⅲ、Ⅳ-Ⅵ與Ⅶ-Ⅷ之間都有90%的相似度，分別來源于同一克隆。第3起的PFGE圖譜一致，說明是食用相應(yīng)的食品引起這起食物中毒；第6起食物中毒菌株，6份食品樣品分屬2個克隆4個型別(Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ型)，6份肛拭子為同一克隆2個型別(Ⅰ、Ⅱ型)，食品與肛拭子分離菌株之間PFGE型別存在較大差異，鑒于此方法分辨能力有限[4-5]，故采用WGS對菌株進行進一步分析。

經(jīng)全基因組測序，軟件與數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)33株菌的MLST型別均為ST11型。WGS作為基因分析方法比MLST分型技術(shù)具有更高的分辨率[6]。僅靠MLST分型技術(shù)不能作為溯源研究。從圖3，K-mer進化樹關(guān)系分析可以看出，33株菌自成一簇，與數(shù)據(jù)庫的其它D群沙門氏菌相差較遠(yuǎn)，屬于新的克隆分支。通過WGS序列分析發(fā)現(xiàn)，第3起的S-202(腌制食品)與S-222(蛋黃液)的親緣關(guān)系接近，S-200(腌制食品)與S-197、S-198與S-199(肛拭子)為一簇，而S-201、S-203、S-204(腌制食品)這幾株形成另一簇，均由S-202進化而來，而S-202則由S-222與S-210(肛拭子)進化而來。

從SNP的系統(tǒng)發(fā)育樹來看，可以進一步明確各暴發(fā)之間的關(guān)系。有文獻(xiàn)報道，SNP差值小于3為劃定暴發(fā)聚集的共同閾值[7]，因此1-5起食物中毒分離菌株，每起之間SNP差異小于3，均為同一暴發(fā)來源。由于第4起S-210與其它32株菌不在同一參考株下，故不參與SNP分析。第6起為多點暴發(fā)，SNP差異較大為0-42，SNP進化關(guān)系分為3種，肛拭子的來源為兩種，食品為一種，單從暴發(fā)需SNP小于3的定義來看，導(dǎo)致食物中毒的關(guān)聯(lián)較小，但從序列研究發(fā)現(xiàn)，S-223(蛋清液)與S-224、S-225、S-226(蛋糕)完全一致，提示該起為多點暴發(fā)，重點關(guān)注雞蛋源頭。推斷該源頭的沙門氏菌序列較散，由于沒有挑取所有可疑菌落，因此造成食品分離株與肛拭子分離株序列差異較大。

所有菌株對抗菌藥物100%耐藥，均對喹諾酮耐藥，與文獻(xiàn)報道一致[8]。據(jù)文獻(xiàn)報道，對喹諾酮類抗生素耐藥的基因有部分為質(zhì)粒介導(dǎo)[9]，本研究中對喹諾酮表型耐藥，但全基因組測序中沒有檢測到相應(yīng)質(zhì)粒的耐藥基因，因此需要進一步研究相應(yīng)的質(zhì)粒耐藥基因。本研究中，15株耐藥表型與耐藥基因之間是完全吻合，其余菌株存在有耐藥基因，但耐藥表型未檢出或者是耐藥表型檢出，未檢出耐藥基因，除了與質(zhì)粒攜帶耐藥基因外，其余有待進一步研究。環(huán)丙沙星為世衛(wèi)組織推薦的沙門氏菌一線類用藥[10]，本研究中雖沒有檢出環(huán)丙沙星耐藥，但97%(32/33)的菌株為環(huán)丙沙星中介，對此藥的敏感性降低與我國其它城市一致[11-12]，而中國西部、泰國以及伊朗報道此藥的檢出率分別為20%、51.1%與90.9%[13-15]。喹諾酮的高耐藥性與環(huán)丙沙星敏感性降低有關(guān)，因此在用藥方面需要一起考慮[16]。

菌株多重耐藥較高，達(dá)到60.60%，低于我國其它8個省份沙門氏菌的多重耐藥(70.2%)[17]。除了喹諾酮類，本研究對常用抗生素耐藥排在前3位的分別為磺胺類(66.67%)、β-內(nèi)酰胺類(57.58%)、頭孢菌素類(54.55%)。我國，三代頭孢作為禽畜類處理治療沙門氏菌病的常用藥物[8]，本文7株對三四代頭孢類藥物同時產(chǎn)生耐藥，為ESBLs表型陽性的菌株。沙門氏菌能夠產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectum β-lactamases，ESBLs)，編碼該類水解酶的基因為CTX-M、TEM、SHV、PER、VEB、BES、GES、TLA、SFO 和OXA 等[18]。7株菌中，1株攜帶blaTEM-1B、1株攜帶blaCTX-M-14與blaTEM-1B、 5株攜帶blaCTX-M-14，ESBLs耐藥基因型別不同存在地區(qū)差異[19-21]。產(chǎn)ESBLs的菌株，在治療時應(yīng)避免使用青霉素類、頭孢菌素類和氨曲南類藥物。第6起食物中毒大部分分離株屬多重耐藥，5株食品分離株(S-223、S-224、S-225、S-226、S-227)耐藥大于四類，2株肛拭子分離株(S-216、S-218)耐藥大于六類。肛拭子分離的菌株中，對四環(huán)素類的3種均耐藥(DOX、MIN、TET)，食品分離菌株未檢測到四環(huán)素類耐藥，兩者不一致的原因有可能是與上所述未挑取到所有可疑菌有關(guān)。

本研究對2018-2021年由D群沙門氏菌(S.Enteritidis與S.Blegdam)引起的食物中毒暴發(fā)菌株從PFGE與WGS遞進角度進行分析。從WGS分析來看，2018年全年菌株遺傳特征相近，與數(shù)據(jù)庫其它菌株相差較遠(yuǎn)，進化出另一克隆分支。菌株存在多重耐藥，一方面說明飼養(yǎng)方面抗生素濫用較為嚴(yán)重(蛋類檢出多重耐藥菌株)，另一方面在臨床用藥方面需多加考慮。

利益沖突：無