張單華，陳凱麗，鄧 偉，季東方，王玉娟，閆文君

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 鄭州 450000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 鄭州 450000）

尿酸性腎?。╱ric acid nephropathy，UAN）又稱(chēng)痛風(fēng)性腎病、高尿酸血癥腎病，是由嘌呤代謝異常而引起的腎臟損傷性疾病[1]。研究表明，尿酸可經(jīng)炎癥機(jī)制、損傷內(nèi)皮功能、氧化應(yīng)激(OS)、激活RAS系統(tǒng)等途徑損傷腎臟[2-3]。近年來(lái)隨著人們生活質(zhì)量的提高，飲食結(jié)構(gòu)逐漸發(fā)生變化，高尿酸血癥的患病率在全球范圍內(nèi)迅速上升，導(dǎo)致UAN的發(fā)病率也隨之不斷升高，而UAN起病隱匿，早期無(wú)明顯的癥狀，往往被忽視而錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)期，對(duì)國(guó)民健康來(lái)說(shuō)，是一種重要威脅[4-6]。目前，西醫(yī)在降尿酸方面臨床療效顯著，但具有一定的副作用和禁忌癥[7-8]，如常用的抑制尿酸排泄藥物別嘌醇和非布司他具有引起過(guò)敏反應(yīng)和損傷肝腎功能的可能；促進(jìn)尿酸排泄藥物苯溴馬隆禁用于嚴(yán)重腎功能損傷、嚴(yán)重腎結(jié)石等患者[5]。近年來(lái)，中醫(yī)藥在防治UAN及改善腎損傷方面取得了良好的療效[9-12]。因此，從中醫(yī)藥方面尋求治療UAN方案多樣化，了解其治療機(jī)制，對(duì)防治UAN意義重大。

中醫(yī)古籍中無(wú)尿酸性腎病對(duì)應(yīng)病名，現(xiàn)將其歸屬于祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)＂痹證＂、“水腫”、“尿濁”等范疇。本病屬本虛標(biāo)實(shí)之證，以氣虛腎虧為本，濕熱、痰濁、瘀血為標(biāo)，其中又以瘀血為重[5,13]。故本課題組在長(zhǎng)期臨床經(jīng)驗(yàn)及疾病病因病機(jī)的基礎(chǔ)上，總結(jié)歸納出補(bǔ)腎活血方，由黃芪、丹參、菟絲子、莪術(shù)、大黃五味中藥組成。前期研究已表明[14-15]，補(bǔ)腎活血方在治療UAN，改善腎功能，防治腎間質(zhì)纖維化等方面有較好的療效。但其治療UAN，改善腎損傷的具體作用機(jī)制及靶標(biāo)尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是將藥物靶標(biāo)和病證相關(guān)分子共同映射于生物分子網(wǎng)絡(luò)，強(qiáng)調(diào)從系統(tǒng)層次和生物網(wǎng)絡(luò)的整體角度出發(fā)，與中醫(yī)藥學(xué)的整體論思想一致，為中醫(yī)從經(jīng)驗(yàn)醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化為循證醫(yī)學(xué)體系提供了新的研究范式[16-17]。因此，本研究在前期基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和課題資金的資助下，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討補(bǔ)腎活血方治療UAN的可能調(diào)控機(jī)制。并采用分子對(duì)接技術(shù)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，旨在探明補(bǔ)腎活血方治療UAN的潛在價(jià)值，并對(duì)藥物作用機(jī)制進(jìn)行探討，以期為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 補(bǔ)腎活血方活性成分及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

基于TCMSP系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)，設(shè)定口服生物利用度（OB）≥30，類(lèi)藥性（DL）≥0.18，獲得補(bǔ)腎活血方的活性成分[18-20]。然后利用PubChem、DrugBank、SymMap和SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)中藥進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)。最后利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶點(diǎn)蛋白名稱(chēng)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.2 尿酸性腎病的疾病靶點(diǎn)獲取

通過(guò)GeneCards、DisGenet、malaCards和OMIN數(shù)據(jù)庫(kù)，以“Uric acid nephropathy”為關(guān)鍵詞進(jìn)行篩選，其中GeneCards相關(guān)度評(píng)分Score＞20為條件，獲取尿酸性腎病相關(guān)的疾病靶點(diǎn)。

1.3 補(bǔ)腎活血方與UAN疾病共同靶點(diǎn)Venn圖構(gòu)建

采用Venn diagrams在線(xiàn)繪圖工具將UAN疾病相關(guān)靶點(diǎn)和補(bǔ)腎活血方靶點(diǎn)取交集，繪制靶蛋白韋恩圖，篩選中藥-疾病點(diǎn)共同靶靶點(diǎn)。

1.4 “藥物-活性成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將篩選獲得的補(bǔ)腎活血方和疾病的交集靶點(diǎn)和其對(duì)應(yīng)的活性成分、中藥導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0軟件，構(gòu)建中藥-活性成分-交集靶點(diǎn)-疾病圖。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治黾昂诵陌悬c(diǎn)的篩選

首先，將中藥-疾病共同靶點(diǎn)導(dǎo)入在線(xiàn)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)得到擴(kuò)展的蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)信息，下載PPI網(wǎng)絡(luò)互作信息。并采用Cytoscape3.9.0構(gòu)建PPI互作圖。其次，使用CytoNCA[21]插件計(jì)算每個(gè)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的DC值，篩選出DC＞2倍DC中位數(shù)（54）的節(jié)點(diǎn)。最后，按照特征向量中心性（EC）、信息中心性（IC）、局部平均連通性法（LAC）、介數(shù)中心性（BC）、接近中心性（CC）[22]等拓?fù)鋵W(xué)屬性的中位數(shù)篩選核心靶點(diǎn)。

1.6 中藥有效成份GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)獲取的核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路功能富集分析。利用RStudio對(duì)分析結(jié)果按照P值＜0.05的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，選擇排名前10的GO富集分析和排名前20的KEGG富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理，閾值P＜0.05。

1.7 分子對(duì)接

選擇補(bǔ)腎活血方排名前6的活性成分與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。①通Pub Chem網(wǎng)站檢索和下載主要活性成分的SDF結(jié)構(gòu)（2D結(jié)構(gòu)）文件，并運(yùn)用Open Babel 2.3.2軟件轉(zhuǎn)化SDF文件，將其保存為PDB文件。②利用PYMOL 2.3.4軟件對(duì)核心靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行去除水分子、去除配體等操作。并采用AutoDock Tools軟件進(jìn)行加氫、平衡電荷等修飾，最后將受體蛋白和配體小分子分別轉(zhuǎn)化為BQTPD格式。③利用AutoDock Vina軟件對(duì)受體蛋白與配體小分子進(jìn)行分子對(duì)接，最后獲取其構(gòu)象。

1.8 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.8.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康8周齡SPF級(jí)雄 性SD大鼠34只，體質(zhì) 量（200±20）g，鄭州惠濟(jì)區(qū)華興動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供，合格證號(hào)SCXK（豫）2019-0002。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，編號(hào)YFYDW2018026。

1.8.2主要試劑儀器

補(bǔ)腎活血方組成：黃芪30 g，丹參30 g，菟絲子15 g，莪術(shù)10 g，制大黃10 g，共計(jì)40 g，其中黃芪、菟絲子、莪術(shù)、制大黃顆粒劑與生藥換算比值分別為：3∶20，1∶20，1∶20，1∶6（江陰天江藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為20116104、19126014、20036464、19126634）；丹參顆粒劑與生藥比例9∶50（廣東一方制藥有限公司，批號(hào)：0070722）；非布司他片（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：200819JA）；鹽酸乙胺丁醇片（沈陽(yáng)紅旗制藥有限公司，批號(hào)：H21021909）；MMP9試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號(hào)：E-ELR3021）；ALB試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號(hào)：E-EL-R0362c）；TLR4抗體（GeneTex，批號(hào)：GTX64330）；NF-κB p65抗體（GeneTex，批號(hào)：GTX102090）；二抗：HRP標(biāo)記的山羊抗兔（Servicebio，批號(hào)：GB23303）；組化試劑盒DAB顯色劑（Servicebio，批號(hào)：G1211）。

1.8.3主要儀器

DK-8D電熱恒溫水槽（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；Mili-Q Advantage A10超純水制備儀（美國(guó)Milli Pore公司）；Centrifuge 5804R臺(tái)式高速低溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；905立式超低溫冰箱（美國(guó)Thermo公司）；JA2003N萬(wàn)分之一分析天平（上海佑科有限公司）；BT125D十萬(wàn)分之一分析天平（瑞士梅特勒托利公司）；DDY-6C垂直/水平電泳儀（北京市六一儀器廠(chǎng)）；Scientz-192高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.8.4造模制備及取材

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)10天后，按照體重隨機(jī)分為空白組（11只）和造模組（23只）。造模組予腺嘌呤100 mg/kg加乙胺丁醇250 mg/kg灌胃。連續(xù)21天后兩組各取5只腹主動(dòng)脈取血，測(cè)定血尿酸水平。取腎組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，制成切片，HE染色，觀(guān)察腎臟組織。若空白組和造模組血尿酸水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且造模組腎臟組織病理改變，提示造模成功。

將成模大鼠隨機(jī)分為模型組、非布司他組、補(bǔ)腎活血方組3組，每組6只，剩余6只正常鼠作為空白組。補(bǔ)腎活血方組予補(bǔ)腎活血方綠色顆粒劑水溶液4 g/kg，陽(yáng)性藥物組予非布司他水溶液3.6 mg/kg，補(bǔ)腎活血方加非布司他組予補(bǔ)腎活血方顆粒劑4 g/kg加非布司他3.6 mg/kg混合水溶液，空白組和模型組予等量生理鹽水灌胃。各組大鼠每日干預(yù)給藥1次，灌胃體積為1 ml/100 g，連續(xù)干預(yù)4周。

于灌胃治療第4周麻醉處死各組大鼠，腹主動(dòng)脈取血，分離血清（4℃，3000 r min-1，10 min），送至河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科測(cè)定大鼠血尿酸（SUA）、肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）等腎功能相關(guān)的生化指標(biāo)，ELISA法檢測(cè)大鼠血清MMP9和ALB水平。取右腎置于4%多聚甲醛中固定，左腎外緣縱切，將腎組織放入液氮中冷凍以備RT-PCR、WB方法檢測(cè)。

1.8.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR（PT-PCR）分析

使用RNA-easyTM Isolation Reagent試劑提取腎組織中總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min 1個(gè)循環(huán);循環(huán)反應(yīng)95℃、10 s，60℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)；溶解曲線(xiàn)95℃、15 s，60℃、1min，95℃、15 s。根據(jù)儀器自帶軟件計(jì)算出各孔cq值，通過(guò)內(nèi)參GAPDH校正，利用公式2-ΔΔct計(jì)算各處理組相對(duì)的基因轉(zhuǎn)錄水平。引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列

1.8.6蛋白免疫印跡法（Western blot）分析

采用Western blot檢測(cè)補(bǔ)腎活血方對(duì)TLR4和NFκB蛋白表達(dá)的影響。將腎組織研磨成勻漿，置于冰上裂解30 min。低溫高速離心機(jī)中離心（12000 rpm）10 min，取上清，按照BCA試劑盒的步驟測(cè)定總蛋白濃度，每個(gè)樣品分裝成2管，標(biāo)記后分別于-20℃和-80℃冰箱備用。聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，牛奶封閉，用PBST配制一抗稀釋液（1∶1000），4℃孵育過(guò)夜，PBST洗3次；將NC膜置PBST配制的二抗（1∶10000）孵育2 h，PBST洗3次。曝光，用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。

1.8.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以xˉ±s表示，使用單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 補(bǔ)腎活血方有效活性成分篩選

通過(guò)TCMSP檢索得到補(bǔ)腎活血方中5味中藥的113種活性成分，其中黃芪20種，丹參64種，菟絲子11種，莪術(shù)3種，大黃15種，有5種成分為2種中藥所共有，見(jiàn)表2（僅列出黃芪、丹參、菟絲子、大黃前5種活性成分，莪術(shù)3種活性成分）。

2.2 篩選中藥靶點(diǎn)和疾病共同靶點(diǎn)Venn圖

檢索篩選共得到UAN治療靶點(diǎn)882個(gè)，與得到的1160個(gè)補(bǔ)腎活血方對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)取交集，共得到個(gè)234補(bǔ)腎活血方相關(guān)靶點(diǎn)作用于UAN的靶蛋白。利用在線(xiàn)韋恩圖繪制工具（Venn diagrams）繪制靶蛋白韋恩圖，見(jiàn)圖1。

圖1 交集靶點(diǎn)Venn圖

2.3 “藥物-活性成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將補(bǔ)腎活血方和疾病共同靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.9.0軟件進(jìn)行可視化處理。得到的網(wǎng)絡(luò)共有1種疾病、5味中藥、113個(gè)活性成分（包含5種共有成分，其中MOL000296為黃芪與莪術(shù)共有成分，MOL000422、MOL000098、MOL000354為黃芪與菟絲子共有成分，MOL000358為大黃與菟絲子共有成分，）、234個(gè)共同靶點(diǎn)?！爸兴?活性成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖2。

圖2 中藥-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治黾昂诵陌悬c(diǎn)的篩選

PPI網(wǎng)絡(luò)圖分析可知，初始PPI網(wǎng)絡(luò)，共233個(gè)節(jié)點(diǎn)，4175條邊；DC＞2倍DC中位數(shù)（54）PPI網(wǎng)絡(luò)，共44個(gè)節(jié)點(diǎn)，777條邊；最終篩選出的核心靶點(diǎn)PPI，共19個(gè)節(jié)點(diǎn)，171條邊。其核心靶點(diǎn)分別為T(mén)oll樣受體4（TLR4）；纖維連接蛋白基因(FN1)；信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄 激 活 因 子-3（STAT3）；白 蛋 白(ALB)；胱 冬 酶3（CASP3）；JUN基因(JUN)；絲裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)；前 列腺 素G/H合酶2（PTGS2）；FOS基 因（FOS）；MYC基因(MYC)；白細(xì)胞介素-8(CXCL8)；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)；絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK)；SRC基因（RSC）；腫瘤壞死因子（TNF）；基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)；白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）；TP53基因（TP53）；白細(xì)胞介素-6（IL-6)。提示得到的上述19個(gè)核心靶點(diǎn)可能是補(bǔ)腎活血方治療UAN的關(guān)鍵靶點(diǎn)。PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選過(guò)程圖

2.5 補(bǔ)腎活血方核心靶點(diǎn)GO功能富集和KEGG通路富集

GO富集分析共得到基因功能信息925個(gè)。其中，基因功能信息生物過(guò)程（BP）富集了698個(gè)GO功能，主要參與炎癥反應(yīng)（inflammatory response），信號(hào)傳導(dǎo)（signal trnsduction），氧 化 還 原 過(guò) 程（oxidationreduction process），細(xì)胞增殖（cell proliferation），調(diào)控凋 亡 過(guò) 程（regulation of apoptotic process），老 化（aging），對(duì) 脂 多 糖 的 反 應(yīng)（response to lipopolysaccharide）等生物過(guò)程。細(xì)胞組成（CC）富集了71個(gè)GO功能，主要集中于細(xì)胞質(zhì)膜（plasma membrane），細(xì)胞質(zhì)（cytoplsm），細(xì)胞核（nucleus）中。分子功能（MF）富集了156個(gè)GO功能，主要參與蛋白質(zhì)結(jié)合（protein binding），受體結(jié)合（receptor binding），酶 結(jié) 合（enzyme binding），蛋 白 激 酶 結(jié) 合（protein kinase binding）等，見(jiàn)圖4。

圖4 補(bǔ)腎活血方核心靶點(diǎn)GO富集分析

通過(guò)KEGG富集分析，共得到核心靶點(diǎn)參與的通路112條，主要包括NF-κB信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、p53信號(hào)通路等，見(jiàn)圖5。此外，結(jié)果還顯示補(bǔ)腎活血方活性成分的靶基因還涉及其他疾病，如肝炎、腫瘤、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、感染性疾病、內(nèi)分泌疾病和免疫性疾病等，提示了補(bǔ)腎活血方治療這些疾病的潛在優(yōu)勢(shì)。

圖5 補(bǔ)腎活血方核心作用靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

2.6 分子對(duì)接

由2.1可知，補(bǔ)腎活血方前6的活性化合物為MOL007064、MOL000398、MOL007132、MOL007140、MOL000471、MOL000940，將其與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，分子對(duì)接結(jié)合能打分及對(duì)接參數(shù)，見(jiàn)表3。一般認(rèn)為，結(jié)合能越低說(shuō)明分子對(duì)接越穩(wěn)定，結(jié)合能小于0說(shuō)明結(jié)合具有一定的活性，結(jié)合能小于負(fù)7說(shuō)明結(jié)合活性較好，結(jié)合能小于負(fù)9說(shuō)明結(jié)合活性非常強(qiáng)[23-26]。根據(jù)結(jié)合能，分別取小分子MOL000940與大分子蛋白ALB、MMP9、TLR4（結(jié) 合 能 分 別 為：-9.9、-9.8、-8.0 kcal·mol-1）、小分子MOL000398與大分子蛋白MMP9（結(jié)合能為：-10.1 kcal·mol-1）進(jìn)行分子對(duì)接，由表2可知MOL000940、MOL000398所對(duì)應(yīng)的分子活性分別為雙脫甲氧基姜黃素（bisdemethoxycurcumin）、異黃酮（isoflavanone）。將分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化處理，見(jiàn)圖6。

圖6 補(bǔ)腎活血方核心化合物治療UAN的4個(gè)核心靶點(diǎn)的對(duì)接結(jié)果

表3 關(guān)鍵化合物與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)合能打分及對(duì)接參數(shù)

2.7 補(bǔ)腎活血方對(duì)大鼠腎功能的影響

大鼠腎功能結(jié)果顯示，與對(duì)空白組相比，模型組大鼠SUA、Scr明顯上升（P＜0.01，P＜0.05）。與模型組相比，各給藥組SUA均明顯下降（P＜0.01），補(bǔ)腎活血方組Scr明顯下降（P＜0.01），見(jiàn)表4。

表4 補(bǔ)腎活血方對(duì)大鼠腎功能的影響

2.8 補(bǔ)腎活血方對(duì)大鼠血清MMP-9和ALB的影響

Elisa結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組MMP-9明顯上升（P＜0.01），ALB均明顯下降（P＜0.05）。與模型組相比，補(bǔ)腎活血方組和非布司他組MMP-9均明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）；各給藥組ALB均明顯上升（P＜0.01），見(jiàn)表5。

表5 補(bǔ)腎活血方對(duì)大鼠血清MMP-9和ALB的影響

2.9 補(bǔ)腎活血方對(duì)大鼠腎臟TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平的影響

定量PCR結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組TLR4、NF-κB mRNA在腎組織中的表達(dá)水平明顯上升（P＜0.01），補(bǔ)腎活血方組NF-κB mRNA在腎組織中表達(dá)上升（P＜0.05）；與模型組相比，非布司他組和補(bǔ)腎活血方組TLR4 mRNA在腎組織中的表達(dá)水平明顯下降（P＜0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表6。Western blot結(jié)果與定量PCR結(jié)果趨勢(shì)一樣，兩個(gè)靶基因在大鼠腎臟的蛋白表達(dá)水平與mRNA水平變化趨勢(shì)一致，見(jiàn)表7、圖7。

表6 補(bǔ)腎活血方對(duì)大鼠腎組織TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)水平的影響（xˉ±s，n＝3）

表7 補(bǔ)腎活血方對(duì)大鼠腎組織TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平的影響（xˉ±s，n＝3）

圖7 各組大鼠腎TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)電泳

3 討論

近年高尿酸被認(rèn)為是慢性腎臟?。–KD）發(fā)生發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,持續(xù)的高尿酸狀態(tài)促使腎臟微血管及小動(dòng)脈發(fā)生病變，致使腎小管間質(zhì)炎癥和纖維化形成[27-28]。隨著腎臟損傷過(guò)程的延長(zhǎng)，損傷部位會(huì)出現(xiàn)明顯的腎間質(zhì)纖維化的病理改變，并最終走向腎衰竭，導(dǎo)致不可逆的腎臟結(jié)構(gòu)改變[29]。因此，早期干預(yù)尿酸性腎病，減少腎損傷，是治療UAN必不可少的步驟。

3.1 補(bǔ)腎活血方成分分析

通過(guò)中藥-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，共篩選得到雙脫甲氧基姜黃素、異黃酮、槲皮素、異鼠李素等113種治療UAN的潛在活性成分。有研究證明[30-32]，雙脫甲氧基姜黃素、異黃醇、異鼠李素能夠減輕炎癥反應(yīng)，進(jìn)而達(dá)到治療UNA的作用。雙脫甲氧基姜黃素能夠抑制MAPK和NF-κB信號(hào)通路的活化，進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用。槲皮素具有抗氧化應(yīng)激和保護(hù)腎臟的作用，可以有效抑制黃嘌呤氧化還原酶活性，進(jìn)而抑制黃嘌呤轉(zhuǎn)化為尿酸，達(dá)到降低尿酸的作用，還可通過(guò)抑制TGFβ積累來(lái)保護(hù)腎組織，延緩腎臟纖維化進(jìn)程[33-35]。槲皮素的代謝產(chǎn)物異鼠李素具有抗炎、抗細(xì)胞凋亡的作用，能夠調(diào)節(jié)NF-κB、PI3K/Akt、MAPK通路，減少NFκB、TNF-α、IL-1及IL-6等因子的表達(dá)，保護(hù)腎臟[32,36]。以上研究提示，補(bǔ)腎活血方可通過(guò)此次篩選的雙脫甲氧基姜黃素、異黃酮、槲皮素、異鼠李素等有效成分通過(guò)NF-κB、PI3K/Akt、MAPK等信號(hào)通路作用于NFκB、TNF-α、IL-1、IL-6及TGF-β等多個(gè)靶點(diǎn)來(lái)發(fā)揮抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等作用，達(dá)到治療UAN的目的。

3.2 補(bǔ)腎活血方主要靶點(diǎn)分析

GO富集分析結(jié)果表示，補(bǔ)腎活血方可能通過(guò)炎癥反應(yīng)、氧化還原過(guò)程、對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡和老化等途徑治療UNA。通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊笞罱K篩選預(yù)測(cè)到TLR4、MMP9、ALB、FN1、STAT3、CASP3、JUN、PTGS2、MAPK8、FOS、CXCL8、VEGFA、MAPK、RSC、TNF、IL-1β、TP53、IL-6等19個(gè)核心靶點(diǎn)?；|(zhì)金屬白酶MMP9主要具有維持和降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用，可參與巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，在腎臟相關(guān)疾病炎癥反應(yīng)中活性明顯增加，可導(dǎo)致腎小球基底膜的破壞，其含量與腎損傷呈正相關(guān)[37-41]。TLR4是參與機(jī)體非特異性免疫過(guò)程的重要蛋白質(zhì)，可通過(guò)上調(diào)IL-1β、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子，而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腎臟損傷[42-44]。根據(jù)以上研究可推測(cè)，靶點(diǎn)MMP9、TLR4可能為治療UAN的關(guān)鍵核心靶點(diǎn)，可作為防治UAN的靶向分子機(jī)制進(jìn)一步的深入研究。根據(jù)分子對(duì)接結(jié)合能打分及對(duì)接參數(shù)推測(cè)補(bǔ)腎活血方治療UAN的關(guān)鍵靶點(diǎn)還可能涉及ALB靶點(diǎn)。

3.3 補(bǔ)腎活血方主要通路分析

KEGG富集分析表示，PPI的核心靶點(diǎn)主要通過(guò)NF-κB信號(hào)通路、TLR4信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等信號(hào)通路。高建東等[45]研究表明，降糖方通過(guò)降低TLR4/NFκB信號(hào)通路的活化水平，抑制TNF-α、IL-6等炎癥因子的生成，減少尿酸鹽結(jié)晶，減輕尿酸引起的腎臟炎癥。PI3K-Akt信號(hào)通路可調(diào)控mTOR激酶，發(fā)揮調(diào)解多數(shù)慢性纖維化性疾病的作用[46]。韓亞瓊等[47]研究表明，紅景天可能通過(guò)抑制cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路，降低IL-1β、IL-6、TNF-α等含量，增加cAMP含量，進(jìn)而抑制大鼠的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞的凋亡。由以上研究可知，補(bǔ)腎活血方可能通過(guò)抑制NF-κB、TLR4、PI3K-Akt、TNF等信號(hào)通路來(lái)減輕炎癥反應(yīng)，延緩腎臟纖維化，發(fā)揮保護(hù)腎臟的作用。

3.4 分子對(duì)接及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證分析

分子對(duì)接結(jié)果表明，ALB與雙脫甲氧基姜黃素，MMP9與雙脫甲氧基姜黃素、異黃酮對(duì)接構(gòu)圖，TLR4與雙脫甲氧基姜黃素的對(duì)接結(jié)合能均＜-7 kcal·mol-1，提示篩選出的活性成分與核心靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合活性?；A(chǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，補(bǔ)腎活血方可以降低UAN模型大鼠腎組織中TLR4和NF-κB基因及蛋白表達(dá)水平，降低血清MMP-9水平，增加ALB含量，提示補(bǔ)腎活血方減輕腎臟病理?yè)p傷的作用機(jī)制可能與抑制TLR4/NF-κB炎性通路有關(guān)，進(jìn)而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

綜上所述，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)提示，補(bǔ)腎活血方通過(guò)多成分，多靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)多通路的特點(diǎn)治療UAN，其在炎癥反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)、細(xì)胞的增殖與凋亡等生物過(guò)程方面發(fā)揮作用。分子對(duì)接證實(shí)補(bǔ)腎活血方的有效成分與疾病關(guān)鍵核心靶點(diǎn)對(duì)接良好，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)補(bǔ)腎活血方能夠降低UAN模型大鼠腎組織中TLR4和NF-κB基因及蛋白表達(dá)水平，可通過(guò)抑制NLRP3/NF-κB信號(hào)途徑，抑制炎癥反應(yīng)，降低MMP-9水平，發(fā)揮保護(hù)腎臟作用，減少ALB漏出，增加ALB含量，但UAN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，且實(shí)驗(yàn)仍有不足，本實(shí)驗(yàn)樣本量較小，未對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行更完善的驗(yàn)證，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接結(jié)果可為后續(xù)深入進(jìn)行機(jī)制研究提供科學(xué)的理論依據(jù)。