蔡君婷，曹文紅,2*，陳忠琴,2，高加龍,2，鄭惠娜,2，林海生,2，秦小明,2

1(廣東海洋大學 食品科技學院，國家貝類加工技術研發(fā)分中心(湛江)，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東省海洋食品工程技術研究中心，廣東省海洋生物制品工程實驗室，水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，廣東 湛江，524088) 2(海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，大連工業(yè)大學，遼寧 大連，116034)

熱加工是常見的食物加工方式，不同的熱加工處理可能導致食物中蛋白質、多糖等化學成分發(fā)生顯著變化，如蛋白質變性、多糖降解等，改變蛋白質及多糖的結構，從而影響其消化吸收[1]。水產(chǎn)品常見的熱加工方式主要包括蒸制、油炸、烤制和煮制等，相關研究表明，不同熱加工對水產(chǎn)品營養(yǎng)物質的變化損失、消化吸收和生物可利用性影響顯著[2-3]。煮制熱加工可使食物中可溶性糖浸出于湯汁中，導致其含量顯著降低[4]。生鮮牡蠣經(jīng)過蒸制和烤制熱加工后，蛋白質的體外消化率均顯著提高，營養(yǎng)價值得到改善[5]。蒸制熱加工后鱘魚蛋白消化特性增強，而烤制與油炸熱加工降低其消化特性[6]。由此可見，熱加工方式對不同類型水產(chǎn)品中蛋白、多糖營養(yǎng)物質變化和吸收利用有重要影響，其影響效果與熱加工方式密切相關。

華貴櫛孔扇貝(Chlamysnobilis,C.nobilis)是一種暖水性海洋經(jīng)濟貝類，主要分布于我國南海和東部沿海[7]，富含蛋白質、必需氨基酸、多糖及硒等營養(yǎng)物質，營養(yǎng)價值高[8]。據(jù)統(tǒng)計[9]，2020年全國扇貝海水養(yǎng)殖產(chǎn)量高于174萬t，其中廣東扇貝海水養(yǎng)殖產(chǎn)量約為11萬t，而華貴櫛孔扇貝是我國南方海域扇貝養(yǎng)殖中的重要品種，產(chǎn)量巨大。在日常飲食中，華貴櫛孔扇貝主要通過烹飪加工后食用，不同的熱加工處理使食物的蛋白、多糖消化吸收受到不同程度影響[10]。目前關于熱加工處理對華貴櫛孔扇貝蛋白與多糖結構及消化特性的影響鮮有研究報道，因此本研究采用蒸制、油炸及烤制3種常見熱加工方式對華貴櫛孔扇貝進行處理，研究分析不同熱加工處理對華貴櫛孔扇貝蛋白與多糖結構及消化特性的影響，以期為華貴櫛孔扇貝的合理加工處理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

華貴櫛孔扇貝，購于廣東湛江霞山水產(chǎn)品批發(fā)市場，采集于11月，其質量為(30.51±0.23) g，殼長為(69.42±0.80) mm，殼高為(63.91±1.42) mm。

氯化鈉、硫酸銨、鹽酸、硫酸、三氯甲烷、溴化鉀，廣州化學試劑廠；氯化鋇、氫氧化鈉、正丁醇，西隴科學股份有限公司；無水乙醇，廣州光華科技股份有限公司；人工胃液、人工腸液，上海源葉生物科技有限公司；苯酚，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

LEJ-18型真空冷凍干燥機，日本EYELA公司；PS-40A超聲清洗機，濟南鑫貝西生物技術有限公司；BRUKER TENSOR27傅里葉紅外光譜儀，德國Bruker公司；N-1300真空旋轉蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；SHY-2數(shù)顯水浴恒溫振蕩器，常州普天儀器制造有限公司；UV2550紫外分光光度計，日本島津公司；Sigma 300場發(fā)射掃描電鏡，英國Zeiss公司；差示掃描量熱儀(differential scanning calorimetry,DSC)，南京大展檢測儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 扇貝前處理及熱加工

將新鮮扇貝開殼取肉，清洗表面雜質污泥，去除內臟團并擦干水分，隨機分成4組，其中3組分別進行蒸制、油炸及烤制熱加工處理，1組為生鮮樣作為對照。

蒸制處理：水加熱至沸騰，扇貝裝入器皿中置于蒸架上蒸5 min，移出備用；油炸處理：可控溫炸鍋中油溫升至(150±2) ℃，穩(wěn)定后放入扇貝炸2 min，瀝干表面油分，移出備用；烤制處理：調節(jié)烤箱上、下火檔為200 ℃，置于烤盤中烤制10 min，取出冷卻備用。將生鮮及熱加工處理后的扇貝勻漿，低溫冷凍干燥，粉碎抽真空，于-20 ℃凍藏備用。

1.3.2 扇貝蛋白的提取

稱取約5 g扇貝粉，加入125 mL超純水，4 ℃振蕩提取4 h，8 500 r/min離心15 min，取上清液，殘渣重復上述操作1次，合并上清液，加入(NH4)2SO4至飽和，4 ℃靜置10 h，離心收集沉淀，用少量超純水溶解、透析(MWCO 3.5 kDa)，直至飽和BaCl2溶液檢驗反應呈陰性，收集透析袋內的蛋白溶液，所得蛋白溶液冷凍干燥，即為水溶性蛋白。

在提取的殘渣中加入0.5 mol/L NaCl溶液，4 ℃下振蕩提取4 h，8 500 r/min離心15 min，取上清液，殘渣重復上述操作1次，合并上清液，加入(NH4)2SO4至飽和，4 ℃靜置10 h，離心收集沉淀，用0.5 mol/L NaCl溶液溶解、透析(MWCO 3.5 kDa)，收集透析袋內的蛋白溶液，所得蛋白溶液冷凍干燥，即為鹽溶性蛋白。

1.3.3 扇貝多糖的提取

參考金路等[11]的方法，并略有改動。稱取約6 g扇貝粉，加入超純水240 mL，40 ℃水浴浸提3 h，8 000 r/min 離心15 min，收集上清液，殘渣重復上述操作1次，合并上清液。上清液旋蒸濃縮，可得多糖濃縮液，按4∶1體積比采用sevag法[V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1]除蛋白，加入4倍體積無水乙醇醇沉，4 ℃ 靜置10 h，離心收集沉淀，沉淀用超純水溶解，冷凍干燥即為水溶性多糖。

在提取的殘渣中加入120 mL 1%(質量分數(shù))NaOH溶液，室溫水浴振蕩2 h，8 000 r/min離心15 min，收集上清液，殘渣重復上述操作1次，合并上清液。于上清液中加HCl，使溶液呈中性，旋蒸濃縮，可得多糖濃縮液，按4∶1體積比采用sevag法除蛋白，加入4倍體積無水乙醇醇沉，4 ℃靜置10 h，離心收集沉淀，沉淀用超純水復溶，冷凍干燥后即為堿溶性多糖。

1.3.4 蛋白質含量測定

采用考馬斯亮藍G-250染色法測定蛋白質含量。

1.3.5 多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法測多糖含量。

1.3.6 傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)分析

采用溴化鉀壓片法，取約0.2 mg冷凍干燥后的蛋白、多糖樣品與2 mg烘干后的溴化鉀混合研磨，壓成薄片，壓片后在4 000～400 cm-1內掃描，并用OPUS軟件對所得紅外光譜圖進行分析。

1.3.7 熱特性分析

稱取約5 mg冷凍干燥后的多糖樣品放入氧化鋁坩堝中，同時放入一個空坩堝作為空白對照，10 ℃/min的升溫速率，在20～400 ℃內對樣品進行差式掃描量熱法分析。

1.3.8 微觀結構分析

稱取少量冷凍干燥后的樣品均勻涂布于導電膠上，在10 mA電流下噴金后放置于掃描電鏡樣品室中,并在5 kV加速電壓下對樣品進行掃描分析。

1.3.9 體外消化特性分析

參考WU等[12]的方法測定華貴櫛孔扇貝中多糖與蛋白質的體外消化率，并略有改動。

體外模擬胃消化：稱取0.2 g樣品以質量比1∶100加入人工胃液于50 mL離心管中，37 ℃恒溫水浴以100 r/min振蕩2 h，消化后樣品置于冰浴中10 min滅酶，以4 000 r/min離心10 min，取上清液，于-20 ℃貯存，測樣品中蛋白和多糖含量；

體外模擬腸消化：基于胃消化樣品的條件上，用1% NaOH溶液調節(jié)消化液pH至7.0～7.5，添加5 mL人工腸液，混勻，37 ℃恒溫水浴以100 r/min振蕩4 h，置于冰浴中10 min滅酶，4 000 r/min離心10 min，取上清液，于-20 ℃貯存，測樣品中蛋白和多糖含量。體外消化率計算如公式(1)所示：

(1)

式中：W胃腸消化組分，胃腸消化組分多糖或蛋白質含量，mg/g；W樣品組分，樣品中多糖或蛋白質含量，mg/g。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)方差分析(One way ANOVA)和均值比較(Duncan多重比較法)，以P<0.05作為顯著性差異標準，采用Graphpad 8.0和Origin 2019作圖，所有實驗均平行重復3次。

2 結果與分析

2.1 不同熱加工處理對扇貝蛋白含量的影響

扇貝經(jīng)過不同熱加工處理后，分級提取水溶性蛋白及鹽溶性蛋白，測定熱加工后蛋白含量變化如圖1所示。與生鮮組相比，不同熱加工處理后水溶性和鹽溶性蛋白含量均顯著減少(P<0.05)。其中，相對于水溶性蛋白，經(jīng)蒸制、油炸及烤制熱加工后蛋白含量分別降低49.69%、34.01%和50.36%；相對于鹽溶性蛋白，熱加工后蛋白含量均顯著降低(P<0.05)，可能是由于在熱加工過程中蛋白發(fā)生不同程度熱變性，疏水基團暴露，使其溶解度降低[13]，此外，部分蛋白質也會隨汁液流失或溶于加工介質中導致其損失[1]。

圖1 不同熱加工處理對華貴櫛孔扇貝蛋白含量的影響Fig.1 Effects of different thermal processing on the protein content of C.nobilis注：不同字母表示同一類別組間具有顯著差異(P<0.05)(下同)

2.2 不同熱加工處理對扇貝多糖含量的影響

扇貝經(jīng)過不同熱加工處理后，分級提取水溶性多糖及堿溶性多糖，測定熱加工處理后多糖含量變化如圖2所示。由圖2可知，生鮮扇貝水溶性多糖含量為(11.47±0.17) mg/g(以干基計，下同)，其含量高于堿溶性多糖，可見扇貝中多糖以水溶性多糖為主體。熱加工處理引起水溶性多糖及堿溶性多糖含量的顯著變化(P<0.05)，經(jīng)蒸制、油炸熱加工后水溶性多糖含量相較于生鮮組顯著減少，分別下降21.07%和39.28%，烤制熱加工后水溶性多糖含量增加23.27%，在烤制過程中可能與美拉德反應有關，使其含量有所增加，更易于提取[14]；經(jīng)不同熱加工處理后堿溶性多糖含量顯著增加(P<0.05)，分別增加14.4%、22.44%和60.13%。可能是因為在熱加工處理過程中由于溫度升高促進分子的熱運動性，從而使多糖的溶解度發(fā)生變化[15]。

圖2 不同熱加工處理對華貴櫛孔多糖含量的影響Fig.2 Effects of different thermal processing on the polysaccharide content of C.nobilis

2.3 熱加工處理前后扇貝蛋白的構象變化

A-水溶性蛋白；B-鹽溶性蛋白圖3 熱加工處理前后蛋白紅外光譜Fig.3 Infrared spectra of protein before and after thermal processing

性蛋白吸收峰強度減弱；酰胺Ⅲ帶(1 330～1 220 cm-1)分別位于1 312 cm-1及1 238 cm-1、1 307 cm-1及1 238 cm-1處，主要由同相N—H彎曲振動及C—N伸縮振動引起[16]，熱加工處理后各特征吸收峰強度均顯著降低。其中蛋白質的酰胺I帶是其結構的特有峰形[17]，對主要由氫鍵維持的二級結構敏感，因此常用于分析蛋白質的二級結構[18]。

圖4為生鮮扇貝水溶性蛋白和鹽溶性蛋白經(jīng)過傅里葉去卷積處理，二階導數(shù)及Peakfit曲線擬合的酰胺I帶圖譜，結合表1可發(fā)現(xiàn)，扇貝水溶性蛋白二級結構主要以β-轉角為主，占43.29%，其次是β-折疊及α-螺旋，沒有無規(guī)卷曲結構。蒸制、油炸及烤制熱加工后β-轉角質量分數(shù)降低，分別降至40.38%、29.11%及34.48%，β-折疊質量分數(shù)增加，表明在熱加工過程中水溶性蛋白的二級結構發(fā)生變化，由β-轉角結構向β-折疊結構轉變，β-折疊結構存在于蛋白聚集體內部中，熱加工可能使水溶性蛋白產(chǎn)生聚集體，β-折疊質量分數(shù)增加與其形成有關[19]；扇貝鹽溶性蛋白二級結構主要以β-折疊為主，質量分數(shù)為37.24 %，熱加工對扇貝中鹽溶性蛋白二級結構的變化中，蒸制組和烤制組各結構的質量分數(shù)與生鮮組基本相似，而油炸組中β-轉角質量分數(shù)顯著增加至48.76%，說明在油炸熱加工過程中α-螺旋和β-折疊結構向β-轉角結構轉變，蒸制和烤制熱加工可能破壞鹽溶性蛋白中的氫鍵，使蛋白質分子去折疊展開，α-螺旋和β-折疊質量分數(shù)減少。相關研究報道，蛋白形成的熱聚集體分子間的β-折疊易轉變?yōu)棣?轉角結構，從而使β-轉角結構增加[19]。

A-生鮮狀態(tài)水溶性蛋白；B-生鮮狀態(tài)鹽溶性蛋白圖4 生鮮狀態(tài)蛋白酰胺I帶擬合曲線Fig.4 I-band curve fitting of fresh protein amide in the fresh state

2.4 熱加工處理前后扇貝多糖的構象變化

A-水溶性多糖；B-堿溶性多糖圖5 熱加工處理前后多糖紅外光譜Fig.5 Infrared spectra of the polysaccharides before and after thermal processing

紅外光譜顯示多糖官能團與化學鍵無顯著變化。DONG等[22]研究表明熱加工處理前后燕麥葡聚糖紅外光譜無明顯差異，蒸制和微波處理沒有改變其官能團。鐘潤芳等[23]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過蒸制、油炸及烤制熱加工處理后牡蠣多糖的紅外光譜沒有顯著變化，結果表明不同提熱加工處理對其官能團無顯著影響。

2.5 熱加工處理前后扇貝多糖熱特性分析

不同熱加工處理后扇貝多糖的熱特性分析結果見圖6。由圖6可知，生鮮扇貝水溶性多糖和堿溶性多糖分別在77.1、74.4 ℃出現(xiàn)吸熱峰，焓值分別為170.11、191.95 J/g，在343.8、277 ℃出現(xiàn)放熱峰，焓值分別為60.21、136.2 J/g，而堿溶性多糖在327.1 ℃出現(xiàn)第2個放熱峰，焓值為41.01 J/g。經(jīng)過不同熱加工后扇貝多糖的熱特性存在一定差異，其中水溶性多糖均出現(xiàn)2個吸熱峰，可能是由于高溫導致多糖中結合水與自由水蒸發(fā)。蒸制熱加工后水溶性和堿溶性多糖分別在84.6、215、77.3 ℃出現(xiàn)吸熱峰，焓值分別為209.49、14.11、298.08 J/g，在289.6、300.7、278.4、331 ℃出現(xiàn)放熱峰，焓值分別為5.89、7.21、113.4、36.58 J/g，其吸熱峰與放熱峰峰值均高于生鮮扇貝多糖，表明蒸制熱加工后扇貝多糖的熱穩(wěn)定性跟高。油炸熱加工后分別在67.9、66.1 ℃出現(xiàn)吸熱峰，焓值分別為289.79、312.61 J/g；在291.8、338.1、279.9、321.8 ℃出現(xiàn)放熱峰，焓值分別為62.66、85.41、141.28、43.87 J/g。經(jīng)烤制熱加工后分別在67.7、66.3 ℃出現(xiàn)吸熱峰，焓值分別為347.41、254.52 J/g；在335.9、282、326.9 ℃出現(xiàn)放熱峰，焓值分別為94.63、116.18、63.63 J/g。經(jīng)過油炸及烤制熱加工后多糖吸熱峰峰值與放熱峰峰值與生鮮組相差不大，表明其熱穩(wěn)定性較好。

a-生鮮組；b-蒸制組；c-油炸組；d-烤制組A-水溶性多糖；B-堿溶性多糖圖6 熱加工處理前后多糖DSC圖譜Fig.6 DSC spectra of the polysaccharides before and after thermal processing

2.6 不同熱加工處理對扇貝多糖和蛋白微觀結構的影響

掃描電鏡可用于觀察分析多糖和蛋白質的表面形態(tài)[24-25]。相較于生鮮扇貝，烤制熱加工后扇貝的水溶性和堿溶性多糖含量變化最顯著(P< 0.05)，而蒸制熱加工后扇貝水溶性和鹽溶性蛋白含量變化同樣顯著，因此分別選擇烤制與蒸制熱加工前后扇貝多糖、蛋白進行微觀結構分析。通過掃描電鏡觀察熱加工處理對扇貝水溶性多糖、堿溶性多糖、水溶性蛋白和鹽溶性蛋白微觀結構的影響，結果見圖7。熱加工處理對扇貝多糖與蛋白微觀結構具有一定影響，生鮮扇貝水溶性多糖表面均勻平整，呈現(xiàn)紋路規(guī)整；而堿溶性多糖表面光滑平整，無明顯的凹凸不平或不規(guī)整現(xiàn)象。經(jīng)過烤制熱加工處理后水溶性多糖呈現(xiàn)破碎的網(wǎng)狀結構，表面凹凸不平；堿溶性多糖表面變得粗糙皺折，出現(xiàn)大小不一的孔洞。表明熱加工處理可能破壞多糖結構，細胞壁破裂，從而導致營養(yǎng)物質的變性與損失。生鮮扇貝水溶性蛋白表面平整光滑，具有少許皺折，無明顯的孔洞；而鹽溶性蛋白表面較均勻，紋路規(guī)整，附著少許顆粒。經(jīng)過蒸制熱加工處理后水溶性蛋白變?yōu)樵S多小塊組成，表面粗糙，出現(xiàn)較多孔洞；而鹽溶性蛋白表面變得粗糙，坍塌破碎出現(xiàn)許多孔洞，可能由于熱加工處理導致蛋白質結構遭受破壞，分子間相互作用力減弱，并使蛋白質的表面張力增大，形成多孔狀的不規(guī)則表面[26]。

A-生鮮組水溶性多糖；B-烤制組水溶性多糖；C-生鮮組堿溶性多糖；D-烤制組堿溶性多糖；E-生鮮組水溶性蛋白；F-蒸制組水溶性蛋白；G-生鮮組鹽溶性蛋白；H-蒸制組鹽溶性蛋白圖7 熱加工處理前后華貴櫛孔扇貝多糖與蛋白掃描電鏡圖Fig.7 Scanning electron microscopy of polysaccharides and proteins of C.nobilis before and after thermal processing

2.7 不同熱加工處理對扇貝多糖和蛋白體外消化特性的影響

華貴櫛孔扇貝進行不同熱加工處理后，通過體外模擬消化實驗測定多糖與蛋白的體外消化率，結果見圖8。由圖8-A可知，蒸制、油炸及烤制熱加工處理對扇貝蛋白的體外消化率均具有顯著影響(P<0.05)，生鮮扇貝水溶性蛋白的體外消化率高于50%，經(jīng)過蒸制和烤制熱加工后體外消化率均顯著提高(P<0.05)，尤其是蒸制處理后體外消化率增幅最高，達到60%以上，在蒸制和烤制熱加工過程中通過表面受熱產(chǎn)生一層保護膜，避免蛋白質過度降解，熱加工后使其體外消化率提高[27]；相反，經(jīng)過油炸熱加工后水溶性蛋白體外消化率顯著降低，低于50%。相對于鹽溶性蛋白，未經(jīng)加工處理前蛋白的體外消化率高于50%，經(jīng)過蒸制、油炸及烤制3種熱加工后體外消化率均顯著提高(P<0.05)，其中，油炸熱加工后鹽溶性蛋白的體外消化率明顯提高，達70%以上。熱加工處理破壞蛋白質的二級結構從而影響其體外消化性[28]，且熱加工導致二硫鍵、疏水鍵、氫鍵等斷裂重排，一定程度上有利于蛋白質的消化吸收，提高蛋白質的營養(yǎng)價值[29]。

由圖8-B可知，生鮮扇貝水溶性多糖和堿溶性多糖的體外消化率分別低于30%和20%，經(jīng)過蒸制、油炸和烤制3種熱加工處理后其體外消化率均無顯著影響(P>0.05)，可能是由于水溶性多糖和堿溶性多糖為非淀粉多糖，在胃腸消化中不易被胰淀粉酶水解[1]，因此多糖的體外消化率較低，且表明熱加工處理對扇貝水溶性多糖與堿溶性多糖的體外消化影響較小。

A-扇貝蛋白；B-扇貝多糖圖8 不同熱加工處理對華貴櫛孔扇貝蛋白和多糖體外消化率的影響Fig.8 Effects of different thermal processing on in vitro digestibility of proteins and polysaccharides in C.nobilis

3 結論

本文通過蒸制、油炸及烤制熱加工對華貴櫛孔扇貝進行加工處理，探究3種熱加工處理對華貴櫛孔扇貝蛋白和多糖結構及其消化特性的影響，結果表明，本文所研究的熱加工處理均導致華貴櫛孔扇貝水溶性蛋白和鹽溶性蛋白含量顯著降低(P<0.05)，以及使堿溶性多糖含量顯著增加，蒸制和油炸熱加工使水溶性多糖含量顯著降低21.07%和39.28%，而烤制熱加工使其顯著提高23.27%(P<0.05)。紅外光譜圖顯示，3種熱加工處理對扇貝多糖的官能團與化學鍵無顯著影響，但會破壞蛋白質的二級結構；熱加工使蛋白與多糖的微觀結構由均勻規(guī)整轉變?yōu)槎嗫谞?。蒸制及烤制熱加工處理顯著提高水溶性蛋白和鹽溶性蛋白的體外消化率，其中蒸制熱加工后蛋白體外消化率分別達到68.81%和57.91%，利于水溶性蛋白和鹽溶性蛋白的消化吸收。綜上所述，蒸制熱加工方式對華貴櫛孔扇貝蛋白與多糖體外消化效果較好，有利于機體對其吸收利用，更適合華貴櫛孔扇貝的熱加工。本研究為華貴櫛孔扇貝的合理熱加工提供了參考依據(jù)。