羅小葉，王曉丹 ，邱樹毅

（1.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室是專門從事貴州傳統(tǒng)發(fā)酵食品及白酒釀造的省級重點實驗室，是貴州省統(tǒng)發(fā)酵工程研究中心和人才培養(yǎng)基地。依托貴州省豐富的生物資源和傳統(tǒng)發(fā)酵資源優(yōu)勢，針對貴州區(qū)域發(fā)酵產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展的需求，開展相關(guān)研究，已經(jīng)形成發(fā)酵微生物資源挖掘與利用、發(fā)酵功能生物分子分離與風味物質(zhì)解析、發(fā)酵食品工藝創(chuàng)新與現(xiàn)代食品技術(shù)應用、發(fā)酵食品安全檢測技術(shù)等研究方向，經(jīng)過多年的建設和發(fā)展，實驗室在學科建設、人才培養(yǎng)、導師隊伍的建設、科學研究上取得了很大的發(fā)展，并在加強實驗室管理、提升重點實驗室創(chuàng)新能力、促進重點實驗室“開放、流動、聯(lián)合、競爭”等方面開展了一系列的工作。在微生物學研究工作中，微生物是基本材料，也是深加工產(chǎn)品的重要生產(chǎn)原料。重點實驗室主要涉及貴州微生物資源的挖掘與利用，主要包括醬香型白酒固態(tài)釀造微生物、貴州特色米酒微生物、貴州特色果酒微生物、貴州特色酸湯微生物及其他食品微生物資源的挖掘與利用，涉及的微生物包括細菌、酵母、霉菌、放線菌及高溫放線菌等代表菌株。菌種保藏為持久而有效利用微生物資源提供了保證[1]，重點實驗室實行集中保藏、科學的育種傳代及分類管理，并負責同其他高校及科研院所相互交流，以及研究保藏菌種的科技情報工作，以使各類菌種長期滿足科研需要，更好地為科學研究和貴州產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務。

一、菌種保藏室建設與管理

（一）菌種保藏室建設的歷史追溯

世界上約有550個菌種保藏機構(gòu)，最早意識到菌種保藏意義的是捷克斯洛伐克微生物學家Frantisek Kral[2]。為了更好地將這些菌種服務于當時的微生物學研究和應用，他先后公布了菌種目錄，該目錄共63頁，有800個菌株，包括引起人或動物流行性疾病的致病菌、食品發(fā)酵生產(chǎn)的細菌，還有真菌、藻類和厭氧菌[2]。部分私立菌種保藏機構(gòu)，主要設在巴黎、倫敦、比利時和日本等有關(guān)微生物的研究所，但不幸的是現(xiàn)今無法找到這些保藏機構(gòu)的資料，對于微生物菌種保藏工作的重要性令人深思。經(jīng)過大量的篩選及微生物工作，分離篩選得到微生物菌種，因此，我們更應加以保護和利用珍貴的微生物資源。

（二）菌種保藏的目的與任務

就微生物學工作者而言，微生物保藏是一項非常重要的工作，不僅涵蓋原料菌種的分離篩選、微生物純化、理化分子鑒別及儲藏保管，還與微生物生理學、生物化學、生態(tài)學、遺傳學、形態(tài)學、分子生物學等學科有著必然聯(lián)系[3]。根據(jù)國際及國內(nèi)保藏中心的發(fā)展與任務，菌種保藏中心主要是對現(xiàn)今的各種微生物進行有效保存，保持其形態(tài)及功能特性，避免在保藏期間和生產(chǎn)過程中產(chǎn)生死亡或者變異，從而為微生物學研究提供最基本的原料[3]。

（三）國家級菌種保藏中心的概況

我國國家級菌種保藏管理中心主要負責全國微生物菌種資源的收集、鑒定、評價、保藏、供應及國際交流任務[4]，目前國家級微生物菌種保藏中心有：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）、中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ACCC）、中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）、中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心（CVCC）、中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CFCC）、中國抗生素菌種保藏管理中心（CACC）、中國醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心（CMCC）、中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）等[5]，例如目前本重點實驗室大部分教師的微生物均保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，該保藏中心是于1985年由國家知識產(chǎn)權(quán)局（原中國專利局）指定、經(jīng)教育部（原國家教委）批準建立的專利微生物保藏機構(gòu)，受理國內(nèi)外用于專利程序的微生物保藏菌種保藏，為各團隊知識產(chǎn)權(quán)保護及轉(zhuǎn)化起到保駕護航作用。

（四）重點實驗室菌種保藏室的建設與管理

1.重點實驗室菌種保藏室的建設。重點實驗室立足于貴州，面向西部，通過配套完善的實驗室儀器設備和實驗室條件，依托國家重大科技計劃專項、國家自然科學基金及地方重大科技計劃專項，開展發(fā)酵工程與生物制藥領(lǐng)域的應用基礎理論與技術(shù)研究，建設一個產(chǎn)學研緊密結(jié)合、人才培養(yǎng)和研究開發(fā)同步的技術(shù)研發(fā)平臺，以及一支具有較高創(chuàng)新能力的學術(shù)團隊。目前，實驗室在貴州從學科建設、人才培養(yǎng)、科學研究、社會服務等方面較好地發(fā)揮了技術(shù)支撐和引領(lǐng)作用優(yōu)勢，提升了貴州省發(fā)酵工程與生物制藥的水平和創(chuàng)新能力，縮短了與國內(nèi)外的科技水平差距，推進了貴州省發(fā)酵工程與生物制藥產(chǎn)業(yè)快速、穩(wěn)定、健康發(fā)展。

筆者在重點實驗室開展科研工作的同時，參與了實驗室的建設與管理工作。由于重點實驗室主要從事發(fā)酵與生物制藥科學研究，其中涉及的微生物尤其眾多，菌種微生物資源事關(guān)生物技術(shù)創(chuàng)新的未來，菌種是從事微生物學及生命科學研究的基本材料，也是與微生物有關(guān)的生產(chǎn)部門的重要生產(chǎn)資料。微生物具有生命活力，其世代時間一般很短，在傳代過程中易發(fā)生變異甚至死亡。因此，菌種保藏是進行微生物學研究和微生物育種工作的重要組成部分。

自重點實驗室成立建設至2017年11月，實驗室各類微生物菌種保藏一直存在一大問題：缺乏統(tǒng)一的保藏點及保藏方法對整個重點實驗室的微生物菌種進行保藏，重點實驗室各科研團隊出現(xiàn)各自為政的狀態(tài)，難以將整個重點實驗室的微生物資源進行挖掘與應用。為解決此問題及更好地挖掘微生物資源，2018年，在重點實驗室主任及各位教師的指導與支持下，筆者在貴州大學釀酒與食品工程學院崇德樓454實驗室籌備并建立了重點實驗室的菌種保藏室，面積約30平方米，菌種保藏室現(xiàn)有儀器設備包括普通微生物常用的培養(yǎng)基、化學試劑及檢測儀器設備，以滿足微生物培養(yǎng)、保藏及檢測。2020年下半年已經(jīng)將整個重點實驗室各個課題組的所有菌種保藏在重點實驗室，保藏的微生物類型包括酵母（218株）、霉菌（226株）、細菌（318株）、高溫放線菌（10株）、放線菌（5株）等微生物，這些微生物主要以貴州傳統(tǒng)發(fā)酵釀造食品為原料分離篩選得來，主要包括醬香型大曲、醬香型酒醅、米酒、酸湯、酸菜、果酒等原料，菌種類型十分豐富，功能特性比較多樣，微生物保藏方式包括4 ℃斜面保藏、甘油保藏、-80 ℃超低溫凍干保藏等保藏方式。為便于菌種的存取，經(jīng)過實地考量，在-80 ℃超低溫冰箱中制作菌種保藏架放入冰箱中，再將各菌株按照各課題組及各菌種類型分門別類放入保藏架內(nèi)，并在架子外側(cè)編上編號，十分便于菌種的快速搜索與存取，在節(jié)約時間的同時，減少了微生物染菌的可能。

2.重點實驗室菌種保藏室的管理。重點實驗室菌種保藏室的建設與運行為各類微生物的保藏及使用提供便捷的通道，作為重點實驗室菌種保藏室的負責人，為更好地規(guī)范管理菌種保藏室及重要菌種，制訂《貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室菌種保藏室保藏申請流程》，按照以下流程完成菌種保藏工作，具體要求如下：與保藏室負責教師取得聯(lián)系并填寫菌種保藏申請表；準備好需保藏的菌種，根據(jù)菌種選擇合適的保藏方法并告知負責教師保藏條件；菌種保藏期間如要取出菌種，需提前與負責教師聯(lián)系方可取出菌種，不得私自拿??；在保藏期間需與負責教師一起定期檢查菌種的存活率、種株純度及其有關(guān)特性；本保藏中心只接收用于發(fā)酵及食品生產(chǎn)用的有益無害菌種，具有毒性及傳染性的菌種或病毒不在保藏范圍。

其次，根據(jù)重點實驗室菌種保藏中心的實際情況，制訂《貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室菌種保藏室菌種保藏與管理辦法》，該辦法包括菌種各種保藏方法的詳細概述及菌種檢查與復壯，辦法規(guī)定的具體內(nèi)容根據(jù)本保藏室具體實際情況作出相應調(diào)整。菌種保藏分四個階段：（1）挑選特征典型的純菌菌落；（2）確定保藏的合適菌體形態(tài)；（3）選擇最適宜的保藏方法進行保藏；（4）定期對保藏的菌種進行檢查，保藏期滿應及時進行移種。保藏方法包括直接傳代保藏法、液體石蠟保存法、沙土管保藏法、麩皮保藏法、濾紙保藏法、液氮超低溫保藏法、冷凍真空干燥保藏法。具體的保藏方法在以后實際保藏工作中根據(jù)各個課題組的微生物類型而定，比如在重點實驗室中，有用于食醋釀造的醋酸菌、用于米酒釀造和醬油釀造的霉菌、用于果酒啤酒發(fā)酵的酵母、用于白酒釀造的霉菌細菌及酵母、用于酸湯和發(fā)酵辣椒醬的乳酸菌等類型，比如霉菌適合沙土保藏，酵母和細菌適合液氮或者冷凍保藏等，需要根據(jù)各個課題組的實際微生物而定保藏類型，而不能“一法通用”——這對微生物功能特性保持是非常不利的；在實際菌種保藏室管理工作中需定期對微生物進行污染檢查及特性檢查，保藏期滿后要及時進行移種，而不是保藏在載體中就是幾年不管——這對發(fā)酵工程重點實驗室特有微生物資源的損失是非常嚴重的。微生物菌種是科研工作的基礎，對于在菌株篩選、保藏、管理方面有突出貢獻的，應適當予以獎勵；由于保藏方式不妥或管理疏漏，導致菌株死亡或外泄的，需根據(jù)具體情況，報告重點實驗室主任，給予必要的懲處。

二、菌種保藏室的應用成果

（一）服務科研

重點實驗室菌種保藏室已經(jīng)投入使用兩年多，建設管理下使用效果較好，相對于之前實驗室微生物菌種各自為家、雜亂無章的狀態(tài)，實驗室各個課題組微生物都能得到有效保藏與利用；重點實驗室主要從事貴州特色發(fā)酵食品的研發(fā)，各類微生物在其中起到舉足輕重的作用。在重點實驗室發(fā)展建設中，主要以微生物為中心，開展各項科學研究，近兩年來，通過重點實驗室菌種保藏室建設，各科研團隊共計承擔國家級項目10項，省部級項目20余項，發(fā)表學術(shù)論文100余篇，獲得授權(quán)發(fā)明專利13項，省部級科學技術(shù)獎勵2項，參與制定行業(yè)標準7項，產(chǎn)學研合作經(jīng)費700余萬元。

重點實驗室菌種保藏室主要應用于各類微生物的保藏管理，這些功能微生物均在菌種保藏室及中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，大部分功能微生物各課題組均對其功能及代謝開展研究，應用這些功能微生物申請獲批一系列科研項目，如利用功能芽孢桿菌及酵母進行的研究，包括貴州醬香型白酒品質(zhì)提高與丟糟高效利用關(guān)鍵共性技術(shù)研究及示范、高品質(zhì)醬香型白酒釀造工藝優(yōu)化、利用功能微生物強化易地生產(chǎn)高品質(zhì)醬香型白酒關(guān)鍵技術(shù)研究、產(chǎn)白酒醇甜風味物質(zhì)微生物篩選及關(guān)鍵技術(shù)研究、高產(chǎn)酯化酶的紫色紅曲霉在提高濃香型青酒品質(zhì)的應用、利用醬香白酒丟糟生產(chǎn)低度果香型白酒的工藝研究及示范、利用功能乳酸菌進行濃香型白酒酒醅中耐酸乳桿菌產(chǎn)酸特性及酸脅迫應答機制研究 、利用高溫放線菌對醬香型大曲中高溫放線菌的分離篩選及搖瓶液體發(fā)酵條件優(yōu)化 ，以及研究傳統(tǒng)發(fā)酵酸湯及米酒品質(zhì)研究與新產(chǎn)品開發(fā)等項目。同時，利用重點實驗室保藏的一系列微生物開展的研究也獲得一系列國家及省獎項。重點實驗室各項科技成果也更利于進行科技成果產(chǎn)業(yè)化應用及開展與外單位的合作應用研究，將科學技術(shù)轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力，推動貴州特色產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

（二）輔以教學

雖然貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室主要以科學研究服務產(chǎn)業(yè)為主，但是在教學中，也扮演著重要角色。為了更好地將各門專業(yè)課程理論教學與實踐相互融會貫通，充分利用實驗室各項資源，重點實驗室也為本科教學中的本科生提供開放平臺，包括實驗場所、儀器設備等，使學生能在導師指導下進行SRT實驗、實驗室開放項目、大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)大賽、互聯(lián)網(wǎng)+創(chuàng)業(yè)大賽等項目的研究。重點實驗室主要以發(fā)酵產(chǎn)物為研究內(nèi)容，在課余教學過程中，學生利用菌種保藏室的功能酵母制作米酒、啤酒、櫻桃酒、蜂蜜茶酒、茶啤酒、獼猴桃酒、苦蕎酵素、藍莓酒，利用功能霉菌制作霉豆腐、特色醬油，利用功能乳酸菌發(fā)酵酸奶、特色醋等產(chǎn)品。一方面，使學生全面回到課堂、回到教室；另一方面，培養(yǎng)了學生綜合提出問題、解決問題的能力。

重點實驗室菌種保藏室的建設與管理運行為各類微生物的保藏及使用提供便捷的通道，也為了解貴州省發(fā)酵產(chǎn)業(yè)特有微生物資源提供有力支撐。今后，作為重點實驗室菌種保藏室的負責人，筆者會加強保藏室的有效利用，做好微生物菌株的分離鑒定、篩選保藏，做好為重點實驗室各位師生的服務工作，保藏好實驗室珍貴的微生物資源特性不退化，挖掘出更多的有用微生物資源，實行集中保藏、科學的育種傳代及分類管理，并積極主動和貴州省內(nèi)及全國其他高?？蒲袉挝唤涣?，將課題組的微生物資源有效利用；加強對菌種保藏工作的研究與探索，與大數(shù)據(jù)信息化相結(jié)合，使各類菌種長期滿足實驗室科研需要；將圍繞各產(chǎn)業(yè)發(fā)展需求，加快重點實驗室科研成果向生產(chǎn)力轉(zhuǎn)化，提高微生物資源的應用價值。