蔣玉娥 ，鐘兆銘 ，高艷章 ，王 偉 ，孫瑞梅 ，孫傳政

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院/云南省腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科;2）頭頸外二科，昆明 云南 650118;3）昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，昆明 云南 650032）

甲狀腺未分化癌（anaplastic thyroid carcinoma，ATC）高度惡性，發(fā)病率占全部甲狀腺癌的1%～3%，但其致死率卻占全部甲狀腺癌的35%～50%，研究發(fā)現(xiàn)ATC 高死亡率與確診時(shí)近50%的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生率關(guān)系密切[1-2]，因此，探究ATC 高侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，為ATC 的靶向治療提供更多新方案尤為關(guān)鍵。早在19 世紀(jì)臨床專家就發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者血小板（platelet，PLT）增多與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)[3-4]。最近一項(xiàng)包含17 285 例患者、中位隨訪超過(guò)5 a 的臨床研究發(fā)現(xiàn)，每日服用阿司匹林（抗PLT 聚集藥物）的患者其腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生率顯著降低[5]；筆者前期臨床回顧性研究也發(fā)現(xiàn)，一些ATC 患者外周血血小板計(jì)數(shù)增多與其更差的預(yù)后密切相關(guān)[1]，本研究擬利用人ATC 細(xì)胞為研究對(duì)象，探索PLT 促進(jìn)ATC 細(xì)胞遷移及侵襲能力的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)所用ATC 細(xì)胞系（ARO、FRO、SW579）來(lái)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（ATCC），昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院腫瘤研究所有凍存品備用。所有細(xì)胞系均在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，ARO 和FRO 細(xì)胞系在含5%胎牛血清（FBS）的1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，SW579 在含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑及來(lái)源抗體（fibronectin、snail、a-catenin、GAPDH）購(gòu)于Cell signal technology，Ecadherin 抗體購(gòu)于 Abcam 公司，細(xì)胞因 子TGFβ1 購(gòu)于Peprotech 公司。PCR 引物購(gòu)于生工生物，PCR 的mix 購(gòu)于Invitrogen 公司。使用的qPCR 設(shè)備來(lái)自羅氏公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PLT 提取抽取健康志愿者外周靜脈血5 mL 于抗凝管中（包括ACD 液），靜置30 min，室溫200 g 離心20 min，上清液即為富含PLT 的血漿。吸出上清置于EP 管中，室溫800 g 離心20 min，棄上清管底沉淀為PLT。輕輕沿管壁加入PLT 洗滌液1 mL，重復(fù)1 次。Tyrode 緩沖液（包括5 mM 葡萄糖和新鮮3% BSA）重懸PLT。提取的PLT 盡快用于實(shí)驗(yàn)以防其失活。將PLT 與ATC 細(xì)胞按照10∶1 的比例加入無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行共培養(yǎng)。

1.2.2 劃痕實(shí)驗(yàn)單細(xì)胞層、低血清（1%胎牛血清）體系培養(yǎng)。一次性10 μL Tip 頭尖端在培養(yǎng)皿中劃3～5 道平行線，于0、6、12、24 h 隨機(jī)取5 個(gè)不同視野觀察劃痕愈合并照相。

1.2.3 Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)將8 μm 孔徑的小室放入24 孔板中，ATC 細(xì)胞加入上層腔室（無(wú)血清培養(yǎng)基），下層為含10%胎牛血清培養(yǎng)基。10 h后取出培養(yǎng)小室，PBS 洗滌小室預(yù)冷甲醇固定細(xì)胞20 min 后，小心用棉簽擦拭去除室內(nèi)貼附細(xì)胞，0.5%結(jié)晶紫室溫染色5 min 計(jì)數(shù)。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）首先包被抗體4 ℃孵育過(guò)夜，然后加入100 μL 待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行孵育，室溫2 h。隨后加入TGFβ1 檢測(cè)抗體進(jìn)行孵育，室溫2 h。緊接著加入100 μL辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記溶液進(jìn)行孵育，室溫避光20 min。再加入100 μL 底物液進(jìn)行孵育，室溫避光20 min，孵育結(jié)束后加入50 μL 終止液。將孔板放入酶標(biāo)儀中，波長(zhǎng)設(shè)置為450 nm 和570 nm，測(cè)定完畢后保存光密度值（OD 值）?？v坐標(biāo)為OD 值，橫坐標(biāo)為濃度進(jìn)行作圖，計(jì)算相應(yīng)樣品的濃度。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time PCR）用TRIZOL 法抽提ATC 細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成為cDNA，設(shè)計(jì)合成磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）及TGFβ1 引物，△Ct 法計(jì)算目的基因表達(dá)差異。Real-time PCR 體系（共10 μL）組成：1 μL cDNA、1 μL 2.5 μmol 上下游引物、3 μL ddH2O、5 μL SYBR qPCR SuperMix。引物序 列：GAPDH Sense 5′-CTCCTCCTGTTCGACAGTCA GC-3′，Anti-sense 5′-CCCAATACGACCAAA TCCGTT-3′；TGFβ1 Sense 5′-GGCCAGATCCT GTCCAAGC-3′，Anti-sense 5′-GTGGGTTTCC ACCATTAGCAC-3′配置完畢后即可上機(jī)，按說(shuō)明書步驟設(shè)置程序：95 ℃預(yù)變性5 min 95 ℃變性15 s；60 ℃退火與延伸 30 s；95 ℃ 15 s；60 ℃1 min；95 ℃ 3 min.結(jié)果判定：目的基因的相對(duì)表達(dá)量（relative expression）=2-△Ct?！鰿t=目的基因Ct 值的均數(shù)-內(nèi)參基因的Ct 值。

1.2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡雜交（Western blot）首先提取總蛋白，用BCA 蛋白質(zhì)測(cè)定法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。隨后配置9%的 SDS-PAGE 凝膠，將蛋白樣品按照每孔30 μg 進(jìn)行上樣，電泳完畢后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，用250 mA 電流于冰上轉(zhuǎn)膜2.5 h。用5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉，室溫1 h，封閉完成后1×TBST 洗3 次，每次洗5 min，然后孵育一抗[fibronectin（1∶1 000）、snail（1∶1 000）、a-catenin（1∶2 000）、GAPDH（1∶4 000）、E-cadherin（1∶1 000）]，4 ℃過(guò)夜，一抗孵育完畢后用1×TBST洗3 次，每次洗10 min，然后孵育二抗，室溫1 h，二抗孵育完畢后用1×TBST 洗3 次，每次洗10 min。最后，用化學(xué)發(fā)光底物試劑盒（ECL）進(jìn)行發(fā)光成像。Image J 軟件進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS 19.0 軟件包統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。均值比較采用t檢驗(yàn)，P＜ 0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PLT 誘導(dǎo)ATC 細(xì)胞發(fā)生EMT

為了研究PLT 對(duì)ATC 細(xì)胞形態(tài)變化及功能的影響，用從健康人外周靜脈血提取的PLT 與ATC細(xì)胞（FRO、SW579）共培養(yǎng)48 h，加入10 倍數(shù)量的PLT 后，在顯微鏡下觀察ATC 細(xì)胞的形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ATC 細(xì)胞發(fā)生了EMT 樣變化，見(jiàn)圖1A。進(jìn)一步通過(guò)Western Blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EMT 相關(guān)蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PLT 可誘導(dǎo)ATC 細(xì)胞表達(dá)更多的間葉標(biāo)記蛋白（fibronectin 和snail），證實(shí)PLT 可誘導(dǎo)ATC 細(xì)胞發(fā)生EMT。

圖1 PLT 誘導(dǎo)ATC 細(xì)胞發(fā)生EMTFig. 1 Platelets induce epithelial mesenchymal transition in ATC cells

2.2 與ATC 細(xì)胞共培養(yǎng)促進(jìn)PLT 分泌TGFβ1

將PLT 與ATC 細(xì) 胞（ARO、FRO 或SW579）共培養(yǎng)36 h，Real-time PCR 檢測(cè)共培養(yǎng)液中TGFβ1 mRNA 未見(jiàn)顯著增高（ARO 細(xì)胞甚至降低）（P＜ 0.01），而Elisa 檢測(cè)發(fā) 現(xiàn)共培 養(yǎng)液中TGFβ1 蛋白水平顯著升高（P＜ 0.001）（FRO 細(xì)胞最顯著），提示TGFβ1 蛋白可能主要來(lái)源于PLT釋放，而非PLT 合成，見(jiàn)圖2。

圖2 PLT 與ATC 細(xì)胞共培養(yǎng)后TGFβ1 的表達(dá)情況Fig. 2 Expression of TGFβ1 after co-culture PLT and ATC cells

2.3 TGFβ1 促進(jìn)ATC 細(xì)胞的遷移能力

為探索TGFβ1 對(duì)ATC 細(xì)胞的影響，將SW579 細(xì)胞與PLT 共培養(yǎng)8 h，或在ATC 細(xì)胞中直接加入rhTGFβ1（1 ng/mL）8 h 后，Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)顯示，PLT 或rhTGFβ1 可使穿過(guò)小室的ATC 細(xì)胞顯 著增加（P＜ 0.001），提 示PLT 或rhTGFβ1 能顯著增強(qiáng)SW579 細(xì)胞的遷移能力（P＜ 0.001），見(jiàn)圖3A。同樣，劃痕實(shí)驗(yàn)也證實(shí)rhTGFβ1 可顯著增強(qiáng)SW579 細(xì)胞的遷移能力（P＜ 0.01），見(jiàn)圖3B。

圖3 rhTGFβ1 促進(jìn)SW579 細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)Fig. 3 rhTGFβ1 promotes the migratory ability of SW579 cells

2.4 PLT 通過(guò)TGFβ1 促進(jìn)ATC 細(xì)胞發(fā)生EMT

用PLT 或rhTGFβ1 處理SW579 細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，間葉標(biāo)記物fibronectin 增高而上皮標(biāo)記物αcatenin 下降，見(jiàn)圖4A，提示PLT 可能通過(guò)分泌TGFβ1 促進(jìn)ATC 細(xì)胞發(fā)生EMT；為了檢測(cè)PLT是否分泌其他常見(jiàn)細(xì)胞因子促進(jìn)EMT 發(fā)生，用CSF1、IL-11 和TGFβ1 分別處理ARO 細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，只有TGFβ1 誘導(dǎo)間葉標(biāo)記物fibronectin 上調(diào)和上皮標(biāo)記物E-cadherin 下調(diào)，見(jiàn)圖4B，提示PLT 可能通過(guò)釋放TGFβ1 誘導(dǎo)ATC 細(xì)胞發(fā)生EMT 最終促進(jìn)其遷移能力。

圖4 PLT 通過(guò)TGF β1 促進(jìn)ATC 細(xì)胞發(fā)生EMTFig. 4 Platelets promote epithelial-mesenchymal transition in ATC cells through TGFβ1

3 討論

ATC 惡性程度極高，近年來(lái)，盡管手術(shù)設(shè)備和技巧不斷提高，放療設(shè)備、方案不斷創(chuàng)新，化療聯(lián)用方案、靶向治療及免疫治療不斷推陳出新，但ATC 確診后中位生存期一直在3～9 個(gè)月，1 a生存率不足20%；其高度惡性和極差的預(yù)后與其高侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)[1-2]。另一方面，惡性腫瘤患者常出現(xiàn)特魯索綜合征，即腫瘤患者血栓形成增多和血液呈高凝的狀態(tài)[6]。歷史和最近的研究不斷表明，PLT 增多與神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、呼吸系統(tǒng)腫瘤、消化系統(tǒng)腫瘤以及婦科腫瘤患者更差的預(yù)后密切相關(guān)[3,4,6-8]。筆者在前期臨床研究也發(fā)現(xiàn)，ATC 患者外周血PLT 增多與臨床更差的預(yù)后相關(guān)[1]，提示PLT 可能會(huì)促進(jìn)ATC 細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛力，然而其機(jī)制遠(yuǎn)不清楚。

在其他的實(shí)體腫瘤中研究發(fā)現(xiàn)，PLT 可通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。比如，腫瘤細(xì)胞進(jìn)入外周血后可誘導(dǎo)PLT 聚集并包裹腫瘤細(xì)胞，使循環(huán)腫瘤細(xì)胞免受NK 細(xì)胞和TNFα 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡；進(jìn)一步的分子水平研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞可通過(guò)粘附分子p-選擇素、GPIIb-IIIa（αIIbβ3整合素）以及C 型凝集素樣受體（CLEC）-2 與腫瘤細(xì)胞來(lái)源的Podoplanin（平足蛋白）相互作用活化PLT，導(dǎo)致PLT 顆粒釋放高濃度細(xì)胞因子，如ATP、PDGF、TGFβ1，協(xié)助腫瘤細(xì)胞粘附和外滲，最終促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[3,7,9-12]；類似研究也證實(shí)，阻斷TGFβ1 或其受體顯著降低乳腺癌肺轉(zhuǎn)移[13-15]，提示TGFβ1 可能與PLT 促進(jìn)惡性腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)。為探索TGFβ1 是否在PLT 促進(jìn)ATC 惡性進(jìn)展中發(fā)揮作用，采用PLT 與ATC 細(xì)胞共培 養(yǎng)36 h，Real-time PCR 檢 測(cè)TGFβ1 mRNA 未見(jiàn)顯著增高，而Elisa 檢測(cè)TGFβ1 蛋白水平顯著升高，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)TGFβ1、PLT 顯著增強(qiáng)ATC 的遷移能力（圖2、圖3），因此筆者推測(cè)PLT 可能通過(guò)釋放TGFβ1 最終促進(jìn)ATC 的遷移和侵襲能力。

用PLT 處理ATC 細(xì)胞后采用Western blot 實(shí)驗(yàn)測(cè)定EMT 相關(guān)標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)，間葉標(biāo)記物（fibronectin、snail）增高，提示PLT 可能誘導(dǎo)ATC細(xì)胞EMT 發(fā)生；同樣采用TGFβ1 刺激SW579細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，上皮標(biāo)記物α-catenin 表達(dá)下降而間葉標(biāo)記物fibronectin 增高。為檢測(cè)PLT 是否也通過(guò)其常分泌的細(xì)胞因子促進(jìn)ATC 細(xì)胞發(fā)生EMT，用CSF1、IL-11 處理ARO 細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，二者均不能誘導(dǎo)上皮標(biāo)記物E-cadherin 下調(diào)和間葉標(biāo)記物fibronectin 上調(diào)，同時(shí)ATC 細(xì)胞經(jīng)與PLT 共培養(yǎng)48 h 后，ATC 細(xì)胞形態(tài)朝間葉組織方向轉(zhuǎn)化。所以，筆者認(rèn)為ATC 細(xì)胞通過(guò)刺激PLT 釋放TGFβ1，后者誘導(dǎo)ATC 細(xì)胞發(fā)生EMT 進(jìn)而促進(jìn)其侵襲和遷移能力。

綜上所述，本研究提示，PLT 活化后可通過(guò)分泌TGFβ1 促進(jìn)ATC 細(xì)胞發(fā)生EMT 進(jìn)而促進(jìn)ATC 細(xì)胞侵襲和遷移能力，提示TGFβ1 可能成為ATC 患者靶向治療的潛在靶點(diǎn)，但上述研究結(jié)果仍需要包括體內(nèi)實(shí)驗(yàn)在內(nèi)的進(jìn)一步證實(shí)。