汪婭妮，姜琦，張雨晨，諸海燕

卵巢癌是致死率最高的婦科惡性腫瘤，國際癌癥研究所（International Agency for Research on Cancer，IARC）統(tǒng)計(jì)顯示，2020 年全球卵巢癌新增病例313 959 例，死亡207 252 例[1]。卵巢癌有多種病理類型，最常見的是上皮性卵巢癌，約占90%以上，性索間質(zhì)腫瘤占5%～6%，生殖細(xì)胞腫瘤占2%～3%。卵巢癌的初始治療為全面分期手術(shù)或腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)，術(shù)后輔助紫杉醇聯(lián)合鉑類的化療，而標(biāo)準(zhǔn)的初始治療后約70%的患者會(huì)復(fù)發(fā)[2]。復(fù)發(fā)性卵巢癌主要采用化療、靶向藥物等治療。近些年，新的靶向藥物在卵巢癌中的應(yīng)用使卵巢癌治療模式發(fā)生了改變，但由于卵巢癌的異質(zhì)性和多態(tài)性，這些藥物的總有效率約為20%[3]，同時(shí)醫(yī)師基于臨床指南和以往經(jīng)驗(yàn)選擇的藥物無法做到個(gè)體化的精準(zhǔn)治療。因此，構(gòu)建一個(gè)精準(zhǔn)預(yù)測(cè)卵巢癌治療效果的臨床前模型，指導(dǎo)卵巢癌的個(gè)體化治療，一直是卵巢癌的研究重點(diǎn)。

現(xiàn)有的臨床前模型包括細(xì)胞系、動(dòng)物模型以及患者來源的腫瘤異種移植（patient-derived xenograft，PDX）模型和類器官（patient-derived organoid）等。類器官是一種新型體外3D 培養(yǎng)技術(shù)，其以干細(xì)胞或器官祖細(xì)胞為原料，在添加多種生長因子、抑制因子和激素的基質(zhì)膠中進(jìn)行培養(yǎng)，自組裝為器官樣結(jié)構(gòu)的細(xì)胞群。由于其能很好地維持腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，因此基于類器官的藥物篩選結(jié)果與臨床實(shí)際治療效果有較高的符合度；同時(shí)類器官培養(yǎng)技術(shù)具有方便、快捷、易于制備和成功率高等優(yōu)點(diǎn)，使得其在腫瘤藥物研究方面有著巨大的潛能。近年的類器官熱度起源于荷蘭的Hans Clevers 教授，2009 年Clevers 團(tuán)隊(duì)首次在培養(yǎng)基中添加表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、Wnt 信號(hào)激動(dòng)劑、R-脊椎蛋白1（roof plate-specific spondin 1）和骨形成蛋白信號(hào)抑制劑頭蛋白（Noggin）等，在體外成功培養(yǎng)出小腸類器官[4]。2011 年，該團(tuán)隊(duì)又引入煙酰胺、p38 抑制劑和Alk 抑制劑A83-01，成功培養(yǎng)出結(jié)腸的多種疾病類器官模型[5]，此后，肝癌[6]、乳腺癌[7]等惡性腫瘤類器官均成功培養(yǎng)并初步應(yīng)用于臨床。研究表明這些類器官的組織病理學(xué)特征、基因突變類型和藥敏測(cè)試結(jié)果與在體腫瘤高度一致，是目前腫瘤研究最有效的手段，但同時(shí)類器官因具有器官限制性及缺乏免疫細(xì)胞等缺點(diǎn)而暫時(shí)無法得到廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)介紹卵巢癌類器官的起源發(fā)展及其在卵巢癌藥物治療中的研究進(jìn)展。

1 卵巢癌類器官的建立

2018 年，Hill 等[8]首次將22 個(gè)卵巢癌患者的實(shí)體瘤與胸腔穿刺液作為祖細(xì)胞，制成腫瘤細(xì)胞顆粒，用緩沖液進(jìn)行洗滌，將其與Matrigel 基質(zhì)膠混合成細(xì)胞懸液，再向其中加入含有青霉素、EGF、成纖維細(xì)胞生長因子2（fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2）和煙酰胺等的普通培養(yǎng)基液，最終培養(yǎng)出33 個(gè)高級(jí)別漿液性卵巢癌（high-grade serous ovarian carcinoma，HGSOC）類器官模型，培養(yǎng)成功率接近100%。HE 染色和免疫組織化學(xué)分析顯示，類器官保留了原腫瘤的核多形性、致密染色質(zhì)等所有特征。經(jīng)過全外顯子組測(cè)序，Hill 等[8]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)7～10 d 的類器官中的基因突變有98.8%也存在于母體腫瘤中，初步證明培養(yǎng)7～10 d 的類器官可以作為患者臨床反應(yīng)的預(yù)測(cè)工具。2019 年，Kopper 等[9]成功培養(yǎng)了來自32 例卵巢癌患者的56 個(gè)類器官，建立了首個(gè)卵巢癌活體生物庫，其中包含了漿液性交界性腫瘤、HGSOC、低級(jí)別漿液性癌和透明細(xì)胞癌等上皮性卵巢癌的所有亞型，且保留了原發(fā)腫瘤的基因特征，使卵巢癌類器官研究取得重大突破。同年，Phan 等[10]首次嘗試將類器官用于高通量藥物篩選。后來Hart 等[11]成功利用卵巢癌類器官模型模擬卵巢癌的早期腹膜轉(zhuǎn)移，研究發(fā)現(xiàn)腹膜中的間皮細(xì)胞與卵巢癌細(xì)胞直接接觸有利于癌細(xì)胞的黏附與轉(zhuǎn)移。2020 年，Maenhoudt 等[12]分別利用新鮮的腫瘤組織和冷凍保存的活檢組織在添加了神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1（neuregulin-1，NRG1）的培養(yǎng)基中成功培養(yǎng)出卵巢癌類器官，2 種組織培養(yǎng)的成功率都是44%，從而提出了在類器官建立之前儲(chǔ)存臨床樣本的可能性。

2 類器官在卵巢癌藥物篩選中的應(yīng)用

自Hill 等[8]2018 年成功構(gòu)建了卵巢癌類器官之后，類器官培養(yǎng)技術(shù)在卵巢癌發(fā)病機(jī)制與藥物研究方面得到廣泛應(yīng)用。Maenhoudt 等[12]利用類器官模型發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激和腫瘤蛋白p53（tumorproteinp53，TP53）、磷脂酰肌醇3 激酶催化亞單位α（phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit alpha，PIK3CA）等基因參與了卵巢癌的發(fā)生。Jabs 等[13]通過建立同源重組缺陷評(píng)分模型對(duì)類器官和細(xì)胞系培養(yǎng)進(jìn)行高通量藥物篩選，結(jié)果顯示卵巢癌類器官模型對(duì)卡鉑和地西他濱的反應(yīng)性更加多元化。最近的氣液界面（air-liquid interface）培養(yǎng)成功建立了腫瘤免疫微環(huán)境[14]，氣液界面培養(yǎng)與微流體技術(shù)（microfluidic technology）使類器官在免疫治療領(lǐng)域的應(yīng)用成為可能。

目前，類器官技術(shù)在惡性腫瘤藥物研究中主要應(yīng)用于以下4 個(gè)方面：①探索腫瘤的耐藥性；②研究藥物的聯(lián)合作用以尋找最優(yōu)的藥物組合方案；③找到藥物對(duì)腫瘤的特定靶點(diǎn)，為新藥研發(fā)提供依據(jù)；④進(jìn)行高通量藥物篩選，達(dá)到個(gè)體化治療的目的。目前，類器官技術(shù)已被應(yīng)用于多種惡性腫瘤的藥物篩選，如利用人腎癌類器官進(jìn)行順鉑療效的評(píng)估[15]、利用結(jié)腸癌類器官評(píng)估伊立替康在患者體內(nèi)的分布情況[16]。但是，類器官技術(shù)在卵巢癌診斷和治療中應(yīng)用的研究尚不多見。2020 年，Maenhoudt 等[12]分別利用新鮮的腫瘤組織和冷凍保存的活檢組織成功培養(yǎng)出卵巢癌類器官，隨后，該團(tuán)隊(duì)根據(jù)類器官是否經(jīng)過冷凍保存、卵巢癌病理類型以及是否接受過化療將其分類，并對(duì)分類后的類器官進(jìn)行常用化療藥物的敏感性檢測(cè)，研究發(fā)現(xiàn)野生型TP53 卵巢癌類器官對(duì)Nutlin-3 的敏感性高于突變型TP53 卵巢癌類器官。同年，Nanki 等[17]利用含有Wnt-3A 和R-脊椎蛋白等的雞尾酒培養(yǎng)基建立了7 對(duì)卵巢癌類器官，其中3 對(duì)來自漿液性癌，3 對(duì)來自子宮內(nèi)膜樣癌，1 對(duì)來自透明細(xì)胞癌，類器官培養(yǎng)的總成功率為80%（28/35）。Nanki 等[17]用順鉑、卡鉑、紫杉醇、多西他賽、去甲長春堿和托泊替康等23 種美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)的藥物，對(duì)這7 對(duì)卵巢癌類器官進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，根據(jù)藥物的劑量-反應(yīng)曲線判定結(jié)果，結(jié)果顯示含有乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）突變的類器官對(duì)多腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly（ADP－ribose）polymerase，PARP]抑制劑、奧拉帕尼和鉑類藥物更敏感，而來自透明細(xì)胞癌的類器官則對(duì)鉑類藥物、紫杉醇和奧拉帕尼顯示抵抗性。2018 年，Hill 等[8]發(fā)現(xiàn)大約有50%的HGSOC 患者存在DNA損傷修復(fù)缺陷，類器官中DNA 損傷修復(fù)缺陷都與PARP 抑制劑的敏感性相關(guān)，因此PARP 抑制劑可能是這些患者的潛在治療藥物。由于類器官模型具有培養(yǎng)快速、方便的特點(diǎn)，目前已有學(xué)者將其用于高通量藥物篩選，以提高藥物篩選的效率。2019 年，Phan等[10]首次嘗試?yán)寐殉舶┗颊邅碓搭惼鞴龠M(jìn)行高通量藥物篩選，結(jié)果提示基于類器官技術(shù)的高通量藥物篩選在卵巢癌的治療中有一定的應(yīng)用價(jià)值。近年來的研究都顯示使用類器官進(jìn)行藥敏試驗(yàn)可以篩選出具有治療潛力的藥物，能夠?yàn)樾滤幍膽?yīng)用奠定基礎(chǔ)，也有助于為患者提供個(gè)性化的治療方案。

3 類器官在腫瘤藥敏檢測(cè)應(yīng)用中的優(yōu)點(diǎn)

卵巢癌藥敏檢測(cè)對(duì)傳統(tǒng)化療藥物或新型靶向藥物的有效性篩選具有重要作用。細(xì)胞系是卵巢癌最常用的臨床前模型，因其技術(shù)簡單、成本低且成功率高，已廣泛用于高通量藥物的篩選；但在長期培養(yǎng)過程中無法維持其腫瘤異質(zhì)性，最終細(xì)胞系的藥敏結(jié)果與臨床實(shí)際療效呈現(xiàn)較大差異[18]。目前常用的體內(nèi)動(dòng)物模型包括細(xì)胞系異體移植模型和PDX。細(xì)胞系異體移植模型是將腫瘤細(xì)胞注射到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，相比于細(xì)胞系培養(yǎng)能更好地模擬腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程，并且其藥物篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床試驗(yàn)結(jié)果較為一致，但動(dòng)物模型存在一定的倫理爭(zhēng)議，昂貴且耗時(shí)長，這限制了動(dòng)物模型的運(yùn)用。PDX 是將患者新鮮的腫瘤組織直接移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，使腫瘤組織在小鼠體內(nèi)生長而構(gòu)建成的腫瘤模型，此類模型保持了與患者相似的遺傳特性和腫瘤異質(zhì)性[19]，但其受限于建模率低（20%～50%）、周期長（4～8個(gè)月）和成本高等問題，不適合高通量藥物篩選。而類器官具有維持腫瘤異質(zhì)性和模擬腫瘤微環(huán)境的優(yōu)點(diǎn)，使其在腫瘤藥敏檢測(cè)中有較大應(yīng)用優(yōu)勢(shì)和潛力。

類器官可以維持腫瘤的異質(zhì)性。類器官是以干細(xì)胞或器官祖細(xì)胞為原料，添加細(xì)胞外基質(zhì)替代物Matrigel 膠作為立體支架，最終培養(yǎng)形成的三維細(xì)胞團(tuán)，具有和原位組織相似的結(jié)構(gòu)和功能特性[20]。相較于傳統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞和動(dòng)物模型，類器官不僅較好地保留了腫瘤原有的組織學(xué)形態(tài)、遺傳信息和腫瘤異質(zhì)性，還具有傳代穩(wěn)定、培養(yǎng)周期短和取材靈活等特點(diǎn)。腫瘤異質(zhì)性是惡性腫瘤的重要特征，也是造成腫瘤藥物治療失敗的主要原因。卵巢癌具有較高的異質(zhì)性：上皮性卵巢癌主要包含漿液性癌、子宮內(nèi)膜樣癌、透明細(xì)胞癌和黏液癌這幾種亞型，其致癌基因、預(yù)后等均存在較大差異。類器官可以培育出各種類型的卵巢癌，同時(shí)相較于其他培養(yǎng)體系，類器官能夠維持卵巢癌的異質(zhì)性[21]。Kopper 等[9]對(duì)原發(fā)病灶和轉(zhuǎn)移病灶的類器官進(jìn)行全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)類器官與原癌組織的拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）數(shù)據(jù)與癌細(xì)胞比例相同。Nanki 等[17]用23 種FDA 批準(zhǔn)的藥物對(duì)7 對(duì)卵巢癌類器官進(jìn)行藥敏試驗(yàn)顯示，約59.5%的原腫瘤與相應(yīng)類器官的試驗(yàn)結(jié)果相同。

類器官可以較好模擬腫瘤微環(huán)境。類器官培養(yǎng)系統(tǒng)主要由來自于特定組織的祖細(xì)胞和人工基底膜或其他適宜的細(xì)胞外基質(zhì)組成。細(xì)胞外基質(zhì)是信號(hào)在不同細(xì)胞間傳輸?shù)闹虚g媒介，通過合成、降解、排列和交聯(lián)來改變組成和結(jié)構(gòu)，細(xì)胞外基質(zhì)的改變反過來作用于細(xì)胞基質(zhì)黏附受體的信號(hào)傳導(dǎo)，最終影響組織極性、結(jié)構(gòu)、血管生成和癌細(xì)胞侵襲等[22]。類器官培養(yǎng)系統(tǒng)中的細(xì)胞外基質(zhì)是一種富含多糖修飾的帶電蛋白網(wǎng)絡(luò)，能與多種生長因子結(jié)合。同時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)還包含大量的糖蛋白、蛋白多糖和多聚糖等具有不同生化和物理特性的成分[23]。細(xì)胞系培養(yǎng)僅僅將祖細(xì)胞在含有營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基內(nèi)并沒有腫瘤生長所必需的生長因子，缺少基質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞間的信息傳遞以及細(xì)胞外基質(zhì)[24]。體內(nèi)動(dòng)物模型維持了染色體的結(jié)構(gòu)，相比于細(xì)胞系能更好地維持腫瘤的異質(zhì)性。但是由于體內(nèi)動(dòng)物模型是將祖細(xì)胞注射入免疫缺陷小鼠的體內(nèi)，因此腫瘤微環(huán)境的免疫作用并不能得到充分體現(xiàn)[25]，這導(dǎo)致一些免疫藥物實(shí)驗(yàn)沒辦法在動(dòng)物模型體內(nèi)進(jìn)行，因此也存在一定的局限性。而類器官細(xì)胞外基質(zhì)很好地模擬了腫瘤的微環(huán)境，為腫瘤的發(fā)生提供了生長所必需的條件。

4 類器官在腫瘤藥敏檢測(cè)應(yīng)用中的缺點(diǎn)

迄今為止，類器官培養(yǎng)技術(shù)尚未完全成熟，腫瘤類器官培養(yǎng)技術(shù)存在以下缺點(diǎn)：①正常上皮細(xì)胞的過度生長；②缺乏免疫細(xì)胞、血管細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，無法模擬腫瘤免疫環(huán)境及血管形成等；③器官限制性，無法培養(yǎng)所有的腫瘤及所有的非腫瘤成分等。

為解決類器官缺乏免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞的問題，3D 共培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)逐漸進(jìn)入人們的視野，有學(xué)者將類器官與免疫細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，模擬腫瘤發(fā)展過程中免疫細(xì)胞的作用并獲得了成功[26]。改良之后的類器官還可進(jìn)行免疫治療的臨床前試驗(yàn)，已經(jīng)有學(xué)者成功地將類器官與免疫細(xì)胞共同培養(yǎng)來預(yù)測(cè)免疫治療的效果[26]，但目前還無法將卵巢癌類器官與免疫細(xì)胞進(jìn)行共同培養(yǎng)。3D 共培養(yǎng)技術(shù)也成功解決了基質(zhì)細(xì)胞與類器官之間缺乏相互作用的問題[27]。有學(xué)者利用大網(wǎng)膜的原代間皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的早期傳代在體外重建了卵巢癌的腫瘤微環(huán)境，雖然該系統(tǒng)比較復(fù)雜，但若將其與卵巢癌類器官結(jié)合可能會(huì)成為藥物篩選的下一代模型[28]。微流體技術(shù)是利用微小通道模仿人體血管，研究血管因素在腫瘤發(fā)生與發(fā)展過程中的作用[29]，隨著微流體技術(shù)的發(fā)展，3D培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)能更好地與微流體技術(shù)相結(jié)合[30]。相信在不久的將來，類器官的這些局限性將會(huì)被新的技術(shù)一一攻克。

5 結(jié)語

類器官培養(yǎng)技術(shù)作為一種新型的細(xì)胞培養(yǎng)方式，由于其腫瘤復(fù)制程度高、較好地保留腫瘤異質(zhì)性、生長周期短及可穩(wěn)定傳代等優(yōu)勢(shì)，彌補(bǔ)了細(xì)胞系和動(dòng)物模型等臨床前模型的缺陷，在腫瘤藥物篩選和個(gè)性化治療方面具有巨大的潛能。卵巢癌類器官的成功培養(yǎng)和制備使其在卵巢癌方面的應(yīng)用也逐漸進(jìn)入人們的視野。一方面，卵巢癌類器官可以模擬卵巢癌的發(fā)展進(jìn)程，通過對(duì)卵巢癌的癌前狀態(tài)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)卵巢癌生長過程中的基因突變位點(diǎn)，為疾病診斷和新藥研發(fā)提供依據(jù)，實(shí)現(xiàn)疾病的早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療；另一方面，目前類器官已經(jīng)應(yīng)用于卵巢癌的藥敏試驗(yàn)，結(jié)合高通量藥物篩選，為將來患者的個(gè)性化治療提供臨床前試驗(yàn)依據(jù)。另外，通過對(duì)患者來源的類器官進(jìn)行培養(yǎng)，可以評(píng)估患者預(yù)后，為及時(shí)調(diào)整治療方案做出前瞻性判斷。但是類器官和功能齊全的器官還有較大的差距，而且類器官技術(shù)也存在局限性，其不能完全模擬腫瘤免疫環(huán)境并且具有一定的器官限制性。目前，高速發(fā)展的共培養(yǎng)技術(shù)、微流體技術(shù)已經(jīng)在逐步克服類器官的缺陷，相信在不久的將來，類器官技術(shù)將會(huì)更加完善，從而實(shí)現(xiàn)卵巢癌的個(gè)性化治療。