金孝華 安莉莎 閆有圣 張 璐 曹小芳 馬 旭 于晗澍

1.國(guó)家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所(北京，100081)；2. 國(guó)家人類(lèi)遺傳資源中心；3. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院；4. 菏澤市立醫(yī)院

X連鎖智力低下綜合征(XLMR)是一組高度異質(zhì)性的先天性缺陷和智力發(fā)育異常，在男性患者中的發(fā)生率約為1/600，僅次于唐氏綜合征的發(fā)生率[1]。目前已經(jīng)報(bào)道的XLMR致病基因有90余個(gè)[2]。α地中海貧血X連鎖智力障礙(ATR-X)綜合征是一種罕見(jiàn)的XLMR，主要特征為智力低下、特殊面容、發(fā)育遲緩、身材矮小、小頭畸形、伴或者不伴有輕型α地中海貧血，ATRX基因突變是導(dǎo)致ATR-X綜合征的遺傳學(xué)因素[3]。筆者對(duì)于一個(gè)X連鎖智力低下家系進(jìn)行了臨床表型分析，經(jīng)全外顯子組(WES)測(cè)序及家系突變分析，明確ATRX基因突變導(dǎo)致了該家系A(chǔ)TR-X綜合征。

1 資料和方法

1.1 家系資料

核心家系父母正常，生育二男一女，兩男孩子患病，女孩正常(圖1，492頁(yè))。先證者(Ⅱ3)男，3歲，因孕36+2周胎心監(jiān)護(hù)異常剖宮產(chǎn)，出生體重2.77kg，出生后診斷為“早產(chǎn)兒腦病”。頭顱MRI顯示：雙側(cè)大腦多發(fā)皮層下腦白質(zhì)異常信號(hào)，給于康復(fù)治療。身高89.7cm，體重13.5kg，頭圍49.0cm，經(jīng)《0～6歲小兒神經(jīng)心理發(fā)育量表》評(píng)估，發(fā)育商數(shù)(DQ)81.1，中度發(fā)育遲緩。血常規(guī)檢查結(jié)果顯示，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)4.38×1012，血紅蛋白(HGB)116g/L，紅細(xì)胞比容(HCT)34.80%，平均紅細(xì)胞體積(MCV) 79.50fl，平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(MCH)26.50pg，診斷為小細(xì)胞低色素貧血?；純河刑厥饷嫒荩貉劬鄬?、內(nèi)眥贅皮、鼻梁低平、人中長(zhǎng)、鯉魚(yú)樣嘴、厚嘴唇、V型上唇；生長(zhǎng)發(fā)育遲緩；語(yǔ)言發(fā)障礙。先證者同胞哥哥(Ⅱ1)15歲，智力低下(IQ=43)，血常規(guī)檢查正常，RBC 5.16×1012，HGB 149g/L，HCT 43.70%，MCV 84.70fL，MCH 28.90pg。特殊面容，6歲時(shí)頻發(fā)性癲癇。腦電圖提示雙側(cè)枕區(qū)不同步棘慢波，多棘慢波接近連續(xù)發(fā)放，右側(cè)顯著，給予抗癲癇藥物控制。先證者姐姐(Ⅱ2)、父(Ⅰ1)母(Ⅰ1)均無(wú)相關(guān)表型。遵循知情同意的原則，簽署知情同意書(shū)后，采集先證者同胞兄姐及父母外周血用于基因檢測(cè)。

1.2 研究方法

1.2.1DNA提取采用基因組DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit，QIAGEN，German)提取先證者及家系成員全血基因組DNA，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用核酸定量?jī)x(Qubit2.0，Invitrogen)進(jìn)行基因DNA定量和純度測(cè)定。

1.2.2全外顯子組測(cè)序分析證者基因組DNA經(jīng)定量后采用全外顯子組捕獲試劑盒(SureSelect Human All Exon V5，Agilent)捕獲全外顯子組，并進(jìn)行高通量測(cè)序試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，在高通量測(cè)序儀(HiseqX10，Illumina)上進(jìn)行全外顯子組測(cè)序。測(cè)序片段通過(guò)BWA軟件(版本：0.7.9a)與UCSC hg19參考基因組進(jìn)行比對(duì)，采用GATK(版本：v3.2)進(jìn)行變異識(shí)別和分型，采用VEP軟件(Variant Effect Predictor, Ensembl 73)進(jìn)行注釋。參考變異數(shù)據(jù)庫(kù)ClinVar、OMIM 和HGMD篩選已知的致病變異，同時(shí)采用多種工具預(yù)測(cè)錯(cuò)義變異的功能以及非編碼調(diào)控序列的注釋。依據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(ACMG)發(fā)布的《序列變異解讀標(biāo)準(zhǔn)和指南》對(duì)每個(gè)變異進(jìn)行分類(lèi)[4-5]。序列變異使用人類(lèi)基因變異國(guó)際命名系統(tǒng)(HGVS)進(jìn)行變異命名和注釋[6]。

1.2.3家系成員Sanger測(cè)序驗(yàn)證生物信息學(xué)分析獲得的候選致病基因突變位點(diǎn)，在其周?chē)O(shè)計(jì)上下游擴(kuò)增引物，PCR反應(yīng)后獲得目標(biāo)區(qū)域產(chǎn)物，采用BigDye3.1(ABI)測(cè)序試劑盒進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀法純化后在ABI3500DX測(cè)序儀上進(jìn)行序列分析。

2 結(jié)果

2.1 先證者全外顯子組測(cè)序結(jié)果

先證者全外顯子組測(cè)序產(chǎn)出原始數(shù)據(jù)為12.5G，目標(biāo)捕獲區(qū)平均測(cè)序深度為101.98×，≥1×測(cè)序深度下的覆蓋度為98.05%，≥4×為97.92%，≥10×為97.15%，≥20×為95.43%，數(shù)據(jù)量符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求。測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)生物信息學(xué)分析，先證者在ATRX基因外顯子3檢測(cè)到NM_000489.3:c.161_162del(NP_000480.2:p.Ser54Ter)半合子變異。該變異在正常人數(shù)據(jù)庫(kù)1000 Genomes、ExAC、gnomAD均未見(jiàn)記錄，屬于罕見(jiàn)的變異；ClinVar、OMIM和HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)未見(jiàn)致病性報(bào)道。

2.2 家系成員驗(yàn)證

采用Sanger測(cè)序驗(yàn)證家系成員中ATRX基因c.161_162del變異，結(jié)果顯示先證者父親為野生型，母親為雜合突變攜帶者，患病的哥哥與先證者相同，屬于半合子變異，姐姐和母親相同屬于雜合突變攜帶者(圖2，492頁(yè))，該遺傳方式符合X連鎖遺傳方式。

2.3 變異致病性分析

ATRX基因c.161_162del變異屬于缺失變異，ATRX基因的密碼子發(fā)生框移，導(dǎo)致編碼蛋白的第54位絲氨酸(Ser)變?yōu)榻K止密碼子(Ter)，產(chǎn)生了沒(méi)有功能的截?cái)嗟鞍?PVS1)；該變異在正常人數(shù)據(jù)庫(kù)均未見(jiàn)頻率報(bào)道(PM2)；家系分析復(fù)合共分離的模式(PP1)；患者表型與ATR-X綜合征高度符合(PP4)。根據(jù)ACMG變異分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)與指南，ATRX基因c.161_162del變異屬于致病性變異(PVS1+PM2+PP1+PP4)。

3 討論

ATRX基因定位于Xq21.1，包含有36個(gè)外顯子，基因全長(zhǎng)跨越300kb，編碼2492個(gè)氨基酸的ATRX蛋白，參與DNA重組、修復(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的等，是DNA解旋酶家族SWI/SNF的成員。ATRX蛋白包含多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，N端有一個(gè)富含半胱氨酸的區(qū)域，該區(qū)域包括一個(gè)C2-C2和PHD樣鋅指結(jié)構(gòu)域，還有一個(gè)ATP酶/解旋酶結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域主要控制轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控和有絲分裂染色體分離。ATRX的中心部分包括一個(gè)預(yù)測(cè)的卷曲-卷曲結(jié)構(gòu)域，一個(gè)預(yù)測(cè)的核定位信號(hào)和21個(gè)谷氨酸殘基。ATRX蛋白的C末端是一個(gè)不同于SNF2蛋白的保守區(qū)和一個(gè)谷氨酸富集區(qū)[7]。ATRX蛋白在個(gè)體發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮廣泛的生物學(xué)功能，在大腦、心臟及骨骼肌高表達(dá)，ATRX基因突變導(dǎo)致蛋白功能異常，從而導(dǎo)致了患者出現(xiàn)復(fù)雜表型的X連鎖的智力低下綜合征。

ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)已經(jīng)收錄的ATRX基因變異達(dá)到200余種，其中主要是錯(cuò)義突變，其中50%的突變C端的富含半胱氨酸的區(qū)域，30%位于SNF2樣解旋酶結(jié)構(gòu)域[7]。但是與ATP酶/解旋酶結(jié)構(gòu)域突變患者相比，具有PHD樣鋅指結(jié)構(gòu)域突變的患者表現(xiàn)出更嚴(yán)重的表型[8]。本研究對(duì)一個(gè)X連鎖智力低下家系進(jìn)行了全外顯子測(cè)序，發(fā)現(xiàn)先證者和患病的同胞哥哥存在ATRX基因NM_000489.3:c.161_162del，該變異位于PHD樣鋅指結(jié)構(gòu)域，產(chǎn)生了ATRX蛋白的截?cái)?，先證者和其哥哥表現(xiàn)典型的ATR-X綜合征表型，智力低下、特殊面容。Basehore等[9]報(bào)道了5個(gè)家系中存在無(wú)義突變c.109C>T(p.R37X)，患者產(chǎn)生ATR-X綜合征的表型，但是總體表型比較溫和，盡管突變位點(diǎn)位于ATRX基因外顯子2，但是蛋白的功能似乎可以通過(guò)替代轉(zhuǎn)錄本的產(chǎn)生或者通過(guò)其他的分子機(jī)制部分挽救。

ATR-X綜合征血液系統(tǒng)的表現(xiàn)存在可變表型，約75%的患兒表現(xiàn)出α-地中海貧血的特征[10]。先證者有輕度的小細(xì)胞低色素貧血，考慮伴有α-地中海貧血的表型，但其哥哥血常規(guī)檢查正常。有文獻(xiàn)報(bào)道Smith-Fineman-Myers綜合征的大多數(shù)兒童期表現(xiàn)會(huì)更加典型，成年后部分表型有可能消失[11]，所以其哥哥并沒(méi)有表現(xiàn)出地貧的特征。

由于ATR-X綜合征的表型特征在不同家系中存在不一致性，WES技術(shù)大大提高了診斷效率，明確基因突變。ATR-X綜合征屬于X連鎖遺傳方式，患者主要是男性，女性攜帶者由于X失活一般無(wú)表型。先證者母親是ATRX基因雜合變異攜帶者，再次生育有50%的概率將突變遺傳給男性后代。如家族中發(fā)現(xiàn)ATRX基因致病變異，對(duì)高危女性進(jìn)行攜帶者檢測(cè)，并進(jìn)行產(chǎn)前診斷或者植入前基因?qū)W檢測(cè)(PGT)[12]，可以阻斷ATR-X綜合征患者的出生。