管旭輝，林曉程，楊衿記

510006 廣州，華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院1；510080 廣州，廣東省人民醫(yī)院腫瘤醫(yī)院肺內(nèi)一科，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院2；510080 廣州，廣東省心血管病研究所3

肺癌是世界上病死率最高、發(fā)病率位居第二位的惡性腫瘤[1]，按照病理類型可分為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC，85%)和小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC，15%)[2]。隨著EGFR、ALK等驅(qū)動(dòng)基因的發(fā)現(xiàn)，靶向治療成為了晚期非小細(xì)胞肺癌的治療策略之一。EGFR19號(hào)外顯子的非移碼缺失和21號(hào)外顯子L858R點(diǎn)突變作為最常見(jiàn)的靶向治療靶點(diǎn)，占比為85%～90%[3-4]。除EGFR常見(jiàn)突變外，3%～25%的EGFR突變患者攜帶罕見(jiàn)突變，并多以復(fù)合突變的形式存在[5-7]。既往有研究提示部分具有EGFR罕見(jiàn)突變類型患者可以從表皮生長(zhǎng)因子酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)中獲益[6]，對(duì)于EGFR復(fù)合突變非小細(xì)胞肺癌患者，阿法替尼似乎有更好的療效[8-9]，但EGFR復(fù)合突變的研究多集中于臨床個(gè)案報(bào)道。此類患者群體的治療策略選擇仍需探索，且對(duì)于EGFR復(fù)合同一外顯子突變患者，一線EGFR-TKIs治療后的耐藥情況和機(jī)制也尚未被闡明。

對(duì)此，本研究回顧性分析了EGFR復(fù)合同一外顯子突變非小細(xì)胞肺癌患者一線使用EGFR-TKIs的臨床療效情況。并基于二代測(cè)序(next generation sequencing，NGS)技術(shù)，通過(guò)分析其基線和一線耐藥后基因突變譜特點(diǎn)對(duì)其耐藥機(jī)制進(jìn)行初步探索。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象與病例數(shù)據(jù)獲取

本研究選取2010年1月至2019年4月于廣東省肺癌研究所確診的EGFR復(fù)合同一外顯子突變非小細(xì)胞肺癌患者22例，分析其臨床和病理特征，包括年齡、性別、吸煙史、診斷時(shí)的分期和病理類型等。末次隨訪時(shí)間為2022年6月1日，所有病例的臨床信息來(lái)自廣東省肺癌研究所電子病歷系統(tǒng)。EGFR復(fù)合同一外顯子突變定義為在同一組織或血液標(biāo)本中檢測(cè)到2種或以上不同的同一外顯子EGFR突變位點(diǎn)共存。臨床分期是以美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)第八版的分期進(jìn)行定義。所有患者的病理診斷經(jīng)廣東省人民醫(yī)院病理科的組織病理學(xué)和免疫組化(immunohistochemistry, IHC)證實(shí)，結(jié)果由兩位專門病理學(xué)家獨(dú)立解釋。本研究經(jīng)廣東省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No.GDREC2019217H)。

1.2 NGS檢測(cè)

采用目標(biāo)區(qū)域探針捕獲技術(shù)和基于illumina測(cè)序平臺(tái)的二代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)，覆蓋目標(biāo)基因捕獲外顯子及+/-20bp范圍內(nèi)的單核苷酸變異(single nucleotide variants，SNP)、短片段插入(insertion mutation)或缺失變異(deletion mutation，del)、基因拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)及斷點(diǎn)發(fā)生在產(chǎn)品捕獲范圍內(nèi)的基因重排(rearrangement/fusion)。

1.3 靶向治療療效評(píng)價(jià)

具體根據(jù)實(shí)體腫瘤(RECIST)1.1版進(jìn)行療效評(píng)價(jià)。接受靶向藥物治療的患者最初每 4 周通過(guò)常規(guī)CT掃描進(jìn)行評(píng)估，根據(jù)RECIST1.1版本進(jìn)行療效評(píng)價(jià)，療效評(píng)價(jià)分為4個(gè)級(jí)別：疾病進(jìn)展(progression disease，PD)、疾病穩(wěn)定(stable disease，SD)、部分緩解(partial response，PR)和完全緩解(complete response，CR)。如果患者的病情沒(méi)有進(jìn)展，則將評(píng)估的持續(xù)時(shí)間調(diào)整為每2個(gè)月一次。無(wú)進(jìn)展生存期(progression-free survival，PFS)的定義是從靶向治療的開(kāi)始到腫瘤進(jìn)展的日期或最后一次隨訪。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本研究應(yīng)用SPSS 26.0軟件和GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Kaplan-Meier方法構(gòu)建每個(gè)亞組的PFS曲線，并應(yīng)用Log-rank檢驗(yàn)分析曲線之間的差異。本研究分別應(yīng)用極分析系統(tǒng)(Agile Genome Medicine Analysis System，AGILE)和GraphPad Prism 9軟件構(gòu)建基因突變圖譜和PFS療效圖，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 22例患者臨床和病理特征

2 結(jié)果

2.1 患者臨床特征

22例患者的中位年齡為56(40，82)歲，病理類型多為肺腺癌，臨床分期為ⅢB～ⅣB期。15例患者為EGFR21號(hào)外顯子復(fù)合突變，6例為EGFR 18號(hào)外顯子復(fù)合突變，而EGFR19號(hào)外顯子復(fù)合突變僅為1例。在一線治療中有1例患者接受第一代ALK-TKI治療，有3例患者接受化療，有2例患者接受第三代EGFR-TKI治療，其余患者均接受第一代/第二代EGFR-TKI治療(表1)。

2.2 一線應(yīng)用EGFR-TKIs生存獲益情況

全組患者接受一線EGFR-TKIs治療的中位無(wú)進(jìn)展生存期(median progression-free survival，mPFS)為9.9個(gè)月，但即使是同種同一外顯子復(fù)合突變的患者接受一線第一代/第二代TKIs的PFS也存在較大差異(圖1)。

棕色為EGFR 19號(hào)外顯子復(fù)合突變類型；藍(lán)色為EGFR 21號(hào)外顯子復(fù)合突變類型；粉色為EGFR 18號(hào)外顯子復(fù)合突變類型

A：EGFR exon21復(fù)合突變與EGFR exon18復(fù)合突變一線應(yīng)用EGFR-TKIs療效對(duì)比；B：一線應(yīng)用第一代與第二代EGFR-TKIs療效對(duì)比

A：8例患者基線基因突變譜 從左至右依次為患者P1至P8；B：8例患者突變基因堿基變換類型 Ti為堿基的轉(zhuǎn)換(同類核苷酸之間的變異)，包括C<->T，A<->G ；Tv為堿基的顛換(不同類核苷酸之間的變異)，包括C<->A，T<->G，C<->G，T<->A

其中，21號(hào)外顯子復(fù)合突變組的mPFS為9.5個(gè)月，18號(hào)外顯子的mPFS為5.4個(gè)月，Kaplan-Meier生存曲線顯示兩組間PFS有差異趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.272 3，圖2A)。一線應(yīng)用第一代EGFR-TKIs組與一線應(yīng)用第二代EGFR-TKIs組間PFS差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.479 2)，兩組的mPFS分別為13.8、9.7個(gè)月(圖2B)。

2.3 患者基線基因突變情況

NGS測(cè)序結(jié)果顯示EGFR復(fù)合突變患者基因突變譜存在較大個(gè)體間差異，88%的患者存在TP53伴隨突變，25%的患者存在NQO1和XRCC1突變，突變類型以錯(cuò)義突變最為常見(jiàn)，其次為無(wú)義突變。在6例接受第一代/第二代EGFR-TKIs的患者中，患者P6為EGFRexon18 p.G819R合并exon18 p.K714N，E709K突變，其接受一線阿法替尼治療的最佳療效為CR，NGS顯示該患者僅存在TP53及GNAS伴隨突變；患者P8為EGFRexon18 p.G719A合并exon18 p.V689M突變，該患者還存在PTEN、TP53、YES1、HIST1H1C伴隨突變，其接受一線阿法替尼治療期間的最佳療效評(píng)價(jià)僅為SD，其余4例患者的最佳療效評(píng)價(jià)為PR。此外，患者P7為存在突變基因種類最多的患者，同時(shí)伴隨TP53、NQO1、XRCC1、BLM、CDA、CEBPA、DPYD、GRM8、GSTP1、UGT1A1等多種突變基因，其應(yīng)用第三代EGFR-TKIs后首次療效評(píng)價(jià)為PD(圖3A)。8例患者堿基突變四分位圖顯示雖然變換類型以胸腺嘧啶(腺嘌呤)替換為胞嘧啶(鳥(niǎo)嘌呤)最多見(jiàn)，但突變類型主要以堿基的顛換為主，即不同類核苷酸之間的變異(圖3B)。

2.4 一線EGFR-TKIs耐藥后基因突變情況

EGFR復(fù)合突變患者接受一線EGFR-TKIs治療耐藥后基因突變譜仍呈現(xiàn)較大個(gè)體間差異(圖4A)。50%的患者出現(xiàn)T790M突變，25%的患者出現(xiàn)MET擴(kuò)增(圖4B)，堿基的變換類型則主要以堿基的轉(zhuǎn)換為主，即同類核苷酸之間的變異(圖4C)。此外，在一線EGFR-TKIs耐藥突變中APC基因與TP53基因突變存在互斥關(guān)系，而UGT1A1與CYP2D6基因突變則存在共存關(guān)系(圖4D)。共5例患者在出現(xiàn)EGFRexon20 p.T790M獲得性耐藥突變后應(yīng)用二線奧希替尼治療，其中，僅有一例患者為19號(hào)外顯子缺失突變合并p.K754E罕見(jiàn)突變，其二線奧希替尼的PFS為23.5個(gè)月，該患者在一線EGFR-TKIs耐藥時(shí)僅存在APC基因的伴隨突變，其余4例患者均為21號(hào)外顯子p.L858R突變合并罕見(jiàn)突變，其二線奧希替尼的mPFS僅為10(7.8，18.2)個(gè)月(圖4E)。其中，3例患者匹配有基線基因突變情況，但個(gè)體間差異性大并未發(fā)現(xiàn)有耐藥突變共同點(diǎn)。

A：11例患者一線EGFR-TKIs耐藥后基因突變譜；B：一線應(yīng)用EGFR-TKIs獲得性耐藥基因突變發(fā)生率；C：11例患者一線EGFR-TKIs耐藥后突變基因堿基變換類型 Ti為堿基的轉(zhuǎn)換(同類核苷酸之間的變異)，包括C<->T，A<->G ；Tv為堿基的顛換(不同類核苷酸之間的變異)，包括C<->A，T<->G，C<->G，T<->A；D：突變基因相互關(guān)系(共存、互斥)；E：一線應(yīng)用EGFR-TKIs出現(xiàn)T790M獲得性耐藥突變后應(yīng)用奧希替尼治療療效 棕色為EGFR 19號(hào)外顯子復(fù)合突變類型；藍(lán)色為EGFR 21號(hào)外顯子復(fù)合突變類型

3 討論

22例患者的基因突變類型以EGFR21號(hào)外顯子復(fù)合突變最為常見(jiàn)，而EGFR19號(hào)外顯子復(fù)合突變患者僅有1例，這表明EGFR復(fù)合同一外顯子突變較少發(fā)生在19號(hào)外顯子上，這與EGFR經(jīng)典敏感單突變情況有所不同[5-6]。我們發(fā)現(xiàn)即使是同一外顯子復(fù)合突變類型，患者一線接受第一代/第二代EGFR-TKIs的療效仍會(huì)有顯著不同，但結(jié)合患者基因突變圖譜，我們并未發(fā)現(xiàn)與療效相關(guān)的突變特點(diǎn)。

3.1 患者一線接受EGFR-TKIs治療的療效

本研究的結(jié)果顯示該類患者應(yīng)用第一代和第二代EGFR-TKIs在PFS方面并無(wú)明顯差異(13.8vs. 9.7個(gè)月)。之前的一項(xiàng)前瞻性研究結(jié)果顯示阿法替尼對(duì)于某些罕見(jiàn)EGFR突變類型的非小細(xì)胞肺癌具有活性，尤其是p.G719X、p.L861G和p.S768I，但其在其他突變類型中活性較低[8]。另一項(xiàng)中國(guó)的回顧性研究顯示,接受阿法替尼治療具有罕見(jiàn)突變的患者的mPFS為11.0 個(gè)月，而接受吉非替尼或厄洛替尼治療的患者僅為 3. 6個(gè)月[9]。本研究的結(jié)果與既往研究結(jié)果存在差異的原因可能在于本研究中所包含的突變類型的比重不同。此外，我們發(fā)現(xiàn)EGFR21號(hào)外顯子復(fù)合突變患者對(duì)一線應(yīng)用EGFR-TKIs的反應(yīng)可能好于EGFR18號(hào)外顯子復(fù)合突變患者，之前并未有研究報(bào)道此類情況，并且該類患者一線應(yīng)用奧希替尼治療的療效可能不佳，這與EGFR敏感單突變情況相反[10]，特別是對(duì)于存在多種伴隨突變的患者。

3.2 患者基線的基因突變情況

NGS測(cè)序結(jié)果顯示EGFR復(fù)合同一外顯子突變患者多伴隨有TP53、NQO1和XRCC1突變但基因突變譜存在較大個(gè)體間差異。TP53突變是EGFR敏感突變的晚期NSCLC患者最常見(jiàn)的伴隨突變，既往有回顧性研究發(fā)現(xiàn)，不僅治療前的TP53基因的改變會(huì)影響療效，任何時(shí)間的TP53基因改變都可能降低TKI治療的PFS以及奧希替尼治療的PFS和OS[11]。這可能解釋EGFR復(fù)合突變患者對(duì)于EGFR-TKIs的療效及預(yù)后較EGFR經(jīng)典突變患者更差的現(xiàn)象，既往研究也已表明EGFR復(fù)合突變患者預(yù)后明顯差于EGFR單突變患者[12]。此外，我們發(fā)現(xiàn)伴隨其他基因突變種類越多的患者對(duì)EGFR-TKIs的反應(yīng)可能更差，反之療效則更好。

3.3 一線應(yīng)用EGFR-TKIs耐藥后的基因突變情況

在一線應(yīng)用第一代/第二代EGFR-TKIs耐藥后，患者最常出現(xiàn)T790M突變及MET擴(kuò)增，這與既往EGFR敏感突變的研究結(jié)果一致[13-15]。本研究的結(jié)果顯示在一線耐藥基因突變譜中TP53突變與APC突變可能存在相互排斥關(guān)系，這對(duì)于TKI療效和生存預(yù)后是否有提示作用尚需要進(jìn)一步研究。既往對(duì)治療后進(jìn)展相關(guān)PFS分析的研究表明，TP53突變伴隨APC突變的EGFR突變晚期肺腺癌患者預(yù)后更差[11]。除此之外，我們發(fā)現(xiàn)EGFR19號(hào)外顯子復(fù)合突變患者出現(xiàn)T790M獲得性耐藥突變后應(yīng)用奧希替尼的療效可能好于EGFR21號(hào)外顯子復(fù)合突變患者，這與EGFR經(jīng)典敏感單突變耐藥情況相類似。此前，一項(xiàng)單臂、前瞻性研究顯示T790M陽(yáng)性的19號(hào)外顯子缺失和L858R突變患者的ORR有明顯差異，分別為61%和32%[16]。

本研究的不足之處在于作為小樣本量單中心回顧性的描述性分析，未能對(duì)全部患者的基線及一線EGFR-TKIs耐藥基因突變情況進(jìn)行匹配分析，這需要大規(guī)模前瞻性研究來(lái)驗(yàn)證研究結(jié)論并進(jìn)一步探索此類患者一線耐藥機(jī)制及應(yīng)對(duì)方案。

綜上所述，EGFR復(fù)合同一外顯子突變患者多伴隨TP53、NQO1和XRCC1突變，其應(yīng)用第一代和第二代EGFR-TKIs療效無(wú)明顯差異。EGFR21號(hào)外顯子復(fù)合突變患者對(duì)一線應(yīng)用EGFR-TKIs的反應(yīng)可能好于EGFR18號(hào)外顯子。此類患者一線EGFR-TKIs耐藥情況與應(yīng)對(duì)策略及其療效與EGFR經(jīng)典敏感單突變的情況相類似。