劉澤宇，羅袁登，李 勛，謝傳明，張雷達(dá)

400038 重慶，陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))第一附屬醫(yī)院全軍肝膽外科研究所

肝癌是一種高度侵襲性的原發(fā)性惡性腫瘤，是世界范圍內(nèi)第三大癌癥死亡原因，患病率居第六位[1-4]。70%～85%的原發(fā)性肝癌為肝細(xì)胞癌。雖然檢測(cè)和檢驗(yàn)的技術(shù)手段不斷發(fā)展，但如今肝癌的早期診斷仍具有挑戰(zhàn)性，患者診斷出肝癌時(shí)往往已是晚期[5-8]，而術(shù)后5年腫瘤復(fù)發(fā)的發(fā)生率可高達(dá)70%[9-14]。因此，為了改善肝癌患者的預(yù)后，亟待需要新的生物標(biāo)志物出現(xiàn)[15]，以幫助早期診斷，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和靶向治療[14, 16]。N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸鹽硫酸酯酶(N-acetylgalacto-samine-6-sulfatase, GALNS)是一種溶酶體酶，能夠水解糖胺聚糖，如軟骨素-4-硫酸酯和硫酸角蛋白[17-19]。有研究報(bào)道稱，GALNS基因突變可促進(jìn)了細(xì)胞外基質(zhì)中硫酸角蛋白的積累[20-21]，進(jìn)而引起腫瘤發(fā)生[22]。另外以往的研究中也已發(fā)現(xiàn)在幾種惡性腫瘤患者的血清中存在高水平的GALNS，并且證明其可作為診斷肺癌的潛在生物標(biāo)志物[23]。但目前對(duì)GALNS與肝細(xì)胞癌的臨床關(guān)系尚不清楚，本研究收集西南醫(yī)院肝癌術(shù)后隨訪患者的臨床病理數(shù)據(jù)，首次探究GALNS在肝細(xì)胞癌的臨床意義及體外生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 一般資料

采用回顧性隊(duì)列研究，收集陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院2008年至2014年間的72例肝細(xì)胞癌患者，其中男性49例，女性23例；中位年齡為47歲，年齡范圍為19～73歲?；颊咝g(shù)中取新鮮冰凍肝癌組織及癌旁組織標(biāo)本。本研究通過(guò)中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，批件號(hào)：KY2020127。

1.2 納排標(biāo)準(zhǔn)及病例篩選流程圖

納入標(biāo)準(zhǔn)：①肝癌患者行肝癌切除術(shù)；②術(shù)后組織病理學(xué)檢查為肝細(xì)胞癌；③臨床病理資料完整。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①非肝癌因素死亡；②圍手術(shù)期死亡的患者；③合并其他惡性腫瘤；④術(shù)前行介入栓塞或其他治療。

病例篩選流程圖見(jiàn)圖1，入組72例患者基本資料見(jiàn)表1。

表1 入組病例基本資料表 (n=72)

圖1 病例篩選流程圖

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色 將收集的標(biāo)本以福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片。采用DAB染色方法，操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色。GALNS抗體濃度為1∶150。由兩位獨(dú)立的病理科醫(yī)師進(jìn)行雙盲閱片，評(píng)估染色結(jié)果。

1.3.2 RT-qPCR 通過(guò)TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，采用TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以GAPDH為內(nèi)參對(duì)照，檢測(cè)GALNS mRNA的表達(dá)水平，采用2-ΔΔCt法分析定量PCR結(jié)果。

1.3.3 細(xì)胞體外遷移實(shí)驗(yàn) Huh7細(xì)胞和LM3細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染siGALNS與siCtrl，48 h后將細(xì)胞消化接種于24孔板的Transwell小室內(nèi)。24孔板內(nèi)加入600 μL完全培養(yǎng)基，小室內(nèi)加入200 μL無(wú)血清培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞懸液，常規(guī)培養(yǎng)24 h。采用4%多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色30 min，擦拭去室內(nèi)未穿過(guò)的肝癌細(xì)胞。在100倍視野下拍照計(jì)數(shù)。

1.3.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) Huh7細(xì)胞和LM3細(xì)胞接種于96孔板中，轉(zhuǎn)染siGALNS與siCtrl。培養(yǎng)72 h后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm下吸光度(OD值)。

1.4 觀察指標(biāo)和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1 觀察指標(biāo) ①肝癌組織和癌旁組織GALNS表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系，包括性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤長(zhǎng)徑、美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(American Jiont Committee on Cancer, AJCC)TNM分期、血管侵犯、病理分期和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移。②肝癌患者預(yù)后及影響因素分析：GALNS表達(dá)、性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤長(zhǎng)徑、血管侵犯、病理分期和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移。③體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證GALNS對(duì)肝癌細(xì)胞遷移與細(xì)胞增殖的影響。

1.4.2 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果以染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分，0分為陰性表達(dá)，1～4分為弱表達(dá)，5～8分為中表達(dá)，9～12分為高表達(dá)，將陰性表達(dá)、弱表達(dá)和中表達(dá)統(tǒng)一為低表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用IBM SPSS Statistics 26 for Windows和R4.2.1統(tǒng)計(jì)分析及畫(huà)圖軟件。分類(lèi)計(jì)數(shù)資料，采用χ2檢驗(yàn)來(lái)分析GALNS表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析連續(xù)性變量的差異。Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析用于單因素和多因素分析肝細(xì)胞癌危險(xiǎn)因素，并評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)比(HR)和95%置信區(qū)間(CI)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織和癌旁組織GALNS表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

肝癌組織芯片免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：如表2，GALNS在72例肝癌組織中低表達(dá)40例(陰性表達(dá)、弱表達(dá)、中表達(dá)分別為2、12、26例)，高表達(dá)32例；GALNS在72例癌旁組織中低表達(dá)68例(陰性表達(dá)、弱表達(dá)、中表達(dá)分別為44、13、11例)，高表達(dá)4例。通過(guò)卡方檢驗(yàn)，較癌旁組織，GALNS于肝癌組織中高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.250，P<0.05)。免疫組化染色結(jié)果顯示GALNS主要位于細(xì)胞質(zhì)，見(jiàn)圖2。

表2 肝癌患者癌與癌旁組織GALNS蛋白表達(dá)的

肝癌組織中GALNS蛋白高表達(dá)和低表達(dá)分別為32、40例，腫瘤長(zhǎng)徑為≤5 cm和>5 cm分別為19、53例，TNM分期為Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期分別為34、38例，無(wú)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移與有肝內(nèi)轉(zhuǎn)移的分別為61、11例。GALNS蛋白高表達(dá)與腫瘤長(zhǎng)徑、TNM分期和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.649，14.849，5.667，P<0.05)，性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、血管侵犯和病理分期與GALNS蛋白高表達(dá)無(wú)關(guān)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

圖2 GALNS蛋白在HCC癌旁組織和肝癌組織中的表達(dá)

表3 GALNS低表達(dá)與高表達(dá)肝癌患者臨床病理特征比較

2.2 肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后及危險(xiǎn)因素分析

72例患者均獲得門(mén)診或電話隨訪，術(shù)后中位隨訪時(shí)間為16.9個(gè)月。GALNS蛋白低表達(dá)和高表達(dá)肝癌患者，術(shù)后1、3、5年生存率分別為87.50%、42.50%、40.00%和37.50%、12.50%、3.13%。GALNS低表達(dá)組的生存率優(yōu)于高表達(dá)組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.268，P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 肝癌患者中GALNS低表達(dá)與高表達(dá)患者術(shù)后生存曲線

單因素Cox風(fēng)險(xiǎn)分析結(jié)果顯示：GALNS、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤長(zhǎng)徑、TNM分期、血管侵犯和病理分期是影響肝癌患者術(shù)后總體生存率的相關(guān)因素(P<0.05)，性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移不是影響肝癌患者術(shù)后總體生存率的相關(guān)因素(P>0.05)，見(jiàn)表4。多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，采用逐步回歸法篩選變量，結(jié)果提示：GALNS、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、血管侵犯和病理分期均為肝細(xì)胞癌患者的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表5。

表4 影響72例肝癌患者術(shù)后總體生存率的單因素分析

2.3 抑制GALNS表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖與遷移的影響

2.3.1 qRT-PCR檢測(cè)siGALNS敲低GALNS mRNA效果 轉(zhuǎn)染siGALNS和siCtrl的Huh7細(xì)胞中，GALNS mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為(31.35±3.6)%和(100±13.86)%。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較，siGALNS可顯著敲低GALNS mRNA表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.66，P<0.05)。轉(zhuǎn)染siGALNS和siCtrl的LM3細(xì)胞中，GALNS mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為(27.4±3.53)%和(100±8.25)%，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較siGALNS可顯著敲低GALNS mRNA表達(dá)水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.26，P<0.05)。

表5 影響72例肝癌患者術(shù)后總體生存率的多因素分析

2.3.2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 Huh7細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染siGALNS和siCtrl后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，CCK-8吸光度值分別為(0.67±0.08)和(1.18±0.12)，敲低GALNS可顯著抑制Huh7細(xì)胞增殖能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.05，P<0.05)。LM3細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染siGALNS和siCtrl后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，CCK-8吸光度值分別為(0.86±0.07)和(1.25±0.18)，敲低GALNS可顯著抑制LM3細(xì)胞增殖能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.51，P<0.05)，見(jiàn)圖4。

A：Transwell檢測(cè)敲低GALNS后對(duì)Huh7和LM3細(xì)胞遷移能力的影響(結(jié)晶紫)；B： Huh7、LM3細(xì)胞遷移能力分析 a：P<0.05，與siCtrl組比較

2.3.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移情況 分別轉(zhuǎn)染siGALNS和siCtrl的Huh7細(xì)胞，穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(13.5±1.85)和(38.46±3.25)，敲低GALNS可顯著抑制Huh7細(xì)胞遷移能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.61，P<0.05)。分別轉(zhuǎn)染siGALNS和siCtrl的LM3細(xì)胞，穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(32.59±3.62)和(62.49±4.5)，敲低GALNS可顯著抑制LM3細(xì)胞遷移能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.72，P<0.05)。見(jiàn)圖5。

3 討論

肝癌是全球第三大癌癥死亡原因，患病率居第六位。肝細(xì)胞癌占肝癌總數(shù)的75%～85%。其起病隱匿，早期癥狀不典型，患者確診時(shí)腫瘤常已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，失去根治性手術(shù)機(jī)會(huì)導(dǎo)致預(yù)后較差。因此研究肝細(xì)胞癌預(yù)后標(biāo)志物具有重要意義。

腫瘤微環(huán)境是腫瘤發(fā)展的細(xì)胞環(huán)境，除腫瘤細(xì)胞本身以外，腫瘤微環(huán)境還包括了細(xì)胞類(lèi)型、細(xì)胞外基質(zhì)、生長(zhǎng)因子、蛋白水解酶及其他信號(hào)分子[24-25]。其中細(xì)胞外基質(zhì)與腫瘤細(xì)胞之間的相互作用常常與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展和患者預(yù)后有著顯著關(guān)聯(lián)[26]。異常的胞外基質(zhì)表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移[22, 27]。軟骨素-4-硫酸鹽是一類(lèi)糖胺聚糖，可共價(jià)連接在蛋白質(zhì)上形成蛋白聚糖，也是細(xì)胞外基質(zhì)的成分之一。不少研究報(bào)道其與膠質(zhì)瘤[22]、前列腺癌[28]和乳腺癌[29]等惡性腫瘤均有關(guān)。既往有報(bào)道稱致癌性HRAS信號(hào)通路活化可導(dǎo)致C4S減少，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)和患者惡性腫瘤的易感性提高[30]。而GALNS是一類(lèi)硫酸酯酶可去除C4S的硫酸鹽基團(tuán)，引起C4S水解[31-32]，這提示GALNS可能與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)。 “癌化”的微環(huán)境可給腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供“溫床”，癌細(xì)胞分泌的各種酶類(lèi)可誘導(dǎo)細(xì)胞周?chē)|(zhì)的變化[33-34]。相對(duì)穩(wěn)定的細(xì)胞外基質(zhì)是一個(gè)成分豐富的大分子網(wǎng)絡(luò)，為細(xì)胞提供機(jī)械支架，介導(dǎo)信號(hào)分子的傳遞以維持細(xì)胞功能。周?chē)|(zhì)的降解導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的重塑有利于腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[35-36]。而GALNS作為消化糖胺聚糖的酶，其表達(dá)水平增高導(dǎo)致C4S等糖胺聚糖過(guò)度水解，引起細(xì)胞外基質(zhì)成分的變化，有助于腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

因此，本研究通過(guò)臨床病理資料分析及體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證GALNS在肝細(xì)胞癌中的臨床意義及生物學(xué)功能：GALNS在大部分肝癌患者的腫瘤組織中表達(dá)水平升高；進(jìn)一步分析了肝細(xì)胞癌患者臨床病理因素與GALNS蛋白的關(guān)系發(fā)現(xiàn)：GALNS與腫瘤長(zhǎng)徑、TNM分期和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示GALNS的異常高表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者的不良臨床病理特征及預(yù)后密切相關(guān)；多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析結(jié)果表明：GALNS表達(dá)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[37]、血管侵犯[38]和病理分期[39]是影響肝癌患者總體生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。由于GALNS與腫瘤長(zhǎng)徑、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移有關(guān)，通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)GALNS具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和遷移的能力，敲低GALNS可有效抑制肝癌細(xì)胞增殖與遷移。今后深入研究GALNS在肝癌中的分子作用機(jī)制，未來(lái)有望作為診斷肝癌及靶向治療的潛在生物標(biāo)志物。

利益沖突所有作者聲明不存在利益沖突