廖紫娟,鄭 寓,楊光參,王艷偉

溫州大學(xué) 數(shù)理學(xué)院,浙江 溫州 325035

蛋白質(zhì)在溶液中的復(fù)雜相互作用導(dǎo)致了不同的相行為,這對(duì)于理解蛋白質(zhì)結(jié)晶的物理機(jī)制、蛋白質(zhì)凝聚相關(guān)的疾病、細(xì)胞中的相變都是必不可少的。然而蛋白質(zhì)在水溶液中的相互作用通常是復(fù)雜的,并取決于許多環(huán)境參數(shù),包括濃度、鹽離子價(jià)態(tài)、pH和溫度。這些復(fù)雜的相互作用導(dǎo)致了非常豐富的相圖,這對(duì)于我們理解蛋白質(zhì)結(jié)晶[1-3]、蛋白質(zhì)凝結(jié)相關(guān)疾病[4-6]以及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)的蛋白質(zhì)液-液相分離(Liquid-liquid separation of proteins,LLPS)行為[7-9]至關(guān)重要。近年來(lái),LLPS已被公認(rèn)為是活細(xì)胞的基本組織原理,因此這一現(xiàn)象的作用機(jī)制和調(diào)控手段被廣泛研究[10]。病理上,對(duì)于蛋白質(zhì)而言,其溶液中的LLPS為白內(nèi)障、鐮狀細(xì)胞性貧血和阿爾茨海默病的纖維形成提供了一種機(jī)制[6]。蛋白質(zhì)凝聚性疾病中,發(fā)病的最初階段是蛋白質(zhì)的溶解性喪失,導(dǎo)致凝聚相的形成,例如:白內(nèi)障中形成的致密液相、無(wú)定形聚集體或晶體,在這些現(xiàn)象中,蛋白質(zhì)之間的吸引力是這些病理發(fā)生的驅(qū)動(dòng)力。因此,表征蛋白質(zhì)之間的相互作用是建立旨在抑制此類(lèi)疾病策略的第一步[11]。在過(guò)去的幾十年里,人們對(duì)這一領(lǐng)域的興趣與日俱增,部分原因是在不同的軟物質(zhì)系統(tǒng)中觀察到了同種電荷的吸引力[12-14]。理論研究和計(jì)算機(jī)模擬表明,多價(jià)離子的靜電關(guān)聯(lián)可以導(dǎo)致大離子聚集[15-19],預(yù)測(cè)了一個(gè)具有相分離區(qū)域的相圖,即分子聚集在大離子的等電點(diǎn)周?chē)?隨后進(jìn)行再穩(wěn)定,并在進(jìn)一步增加鹽濃度時(shí)重新溶解,稱為折入冷凝[18]。多組分液體混合物中的重入相變已被深入研究[20],蛋白質(zhì)和DNA在多價(jià)反離子存在下的折入縮合現(xiàn)象是典型的例子。BSA作為模型蛋白已經(jīng)成為了人血清白蛋白(HSA)的替代品并且被廣泛運(yùn)用,因此本研究將以BSA為研究對(duì)象,BSA是一種特殊類(lèi)型的聚電解質(zhì),與DNA或傳統(tǒng)的膠體體系不同,其正電荷和負(fù)電荷同時(shí)存在于表面,復(fù)雜的表面電荷模式與各種其他相互作用,如疏水相互作用和水合作用,使蛋白質(zhì)溶液的相行為更加復(fù)雜,因此還沒(méi)有找到對(duì)BSA的LLPS相行為的普遍描述。這一研究領(lǐng)域是物理學(xué)和生物學(xué)的交匯領(lǐng)域,盡管BSA的LLPS很重要,但我們對(duì)這一過(guò)程背后的物理機(jī)制的了解仍然有限。了解這些與蛋白質(zhì)凝聚相關(guān)的現(xiàn)象(結(jié)晶、疾病和細(xì)胞中的相變)的機(jī)制很大程度上依賴于在不同條件下蛋白質(zhì)相互作用的定量表征的進(jìn)展。雖然生物化學(xué)的發(fā)展提供了有關(guān)蛋白質(zhì)退化縮合效應(yīng)的結(jié)構(gòu)信息,但從了解結(jié)構(gòu)到充分了解自組織過(guò)程的性質(zhì)和機(jī)制仍有很長(zhǎng)的路要走,全面了解調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)在溶液中的相互作用并改變其相行為的能力是取得進(jìn)展的關(guān)鍵。

本課題致力于研究球狀蛋白BSA的LLPS相行為,首先加入不同濃度YCl3會(huì)導(dǎo)致BSA溶液經(jīng)歷三個(gè)過(guò)程,我們關(guān)注中間階段溶液變渾濁并分層的LLPS過(guò)程。接著改變BSA濃度通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)觀察記錄并在光學(xué)倒置顯微鏡下對(duì)比驗(yàn)證了不同濃度BSA發(fā)生LLPS對(duì)應(yīng)的臨界YCl3濃度,且總結(jié)繪制了一個(gè)LLPS相圖。最后通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)得出了BSA在LLPS過(guò)程中電泳遷移率隨YCl3濃度的變化,通過(guò)對(duì)BSA表面電荷變化進(jìn)行LLPS機(jī)制分析。

1 材 料

BSA純度≥98%(產(chǎn)品編號(hào):A1933),氯化釔(YCl3),純度為99.99%(產(chǎn)品編號(hào):A1933)。從Milliq系統(tǒng)中獲得純化水,沒(méi)有使用緩沖液來(lái)避免其他離子的影響。BSA分子質(zhì)量為66.5 kDa,等電點(diǎn)pI=4.6。

2 實(shí)驗(yàn)原理與方法

2.1 動(dòng)態(tài)光散射裝置

圖1為動(dòng)態(tài)光散射(Dynamic Light Scattering, DLS)原理圖。其用途主要是檢測(cè)散射光強(qiáng)度、頻率(f) 以及時(shí)間(T)的變化。在檢測(cè)過(guò)程中,當(dāng)待測(cè)樣品的測(cè)面受到光的直射時(shí),會(huì)有散射光的產(chǎn)生。如果隨著時(shí)間(T)的改變,散射光也會(huì)隨之發(fā)生變化,那么我們就可以檢測(cè)樣品散射光的頻率(f)和強(qiáng)度的變化,通過(guò)這兩個(gè)參數(shù)測(cè)量出待測(cè)溶液中粒子的尺寸大小以及其表面的電荷量,因此,動(dòng)態(tài)光散射(DLS)實(shí)驗(yàn)是一種用于測(cè)量粒子大小(即粒徑),以及物質(zhì)的Zeta電位(即電泳遷移率)的較好測(cè)量方法。利用動(dòng)態(tài)光散射(DLS)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)在于它的效率高、準(zhǔn)確率高以及可重復(fù)利用性好。

圖1 動(dòng)態(tài)光散射原理圖

其中Zeta電位又叫電動(dòng)電位或電動(dòng)電勢(shì),是指剪切面的電位,是表征膠體分散系穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。由于分散粒子表面帶有電荷而吸引周?chē)姆刺?hào)離子,這些反號(hào)離子在兩相界面呈擴(kuò)散狀態(tài)分布而形成擴(kuò)散雙電層。當(dāng)分散粒子在外電場(chǎng)的作用下,穩(wěn)定層與擴(kuò)散層發(fā)生相對(duì)移動(dòng)時(shí)的滑動(dòng)面即是剪切面,該處對(duì)遠(yuǎn)離界面的流體中的某點(diǎn)的電位稱為Zeta電位,即Zeta電位是連續(xù)相與附著在分散粒子上的流體穩(wěn)定層之間的電勢(shì)差。而電泳是指帶電顆粒在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。許多重要的生物分子,如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可電離基團(tuán),它們?cè)谀硞€(gè)特定的pH下可以帶正電或負(fù)電,在電場(chǎng)的作用下,這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷極性相反的電極方向移動(dòng),因此電泳遷移率是指在單位電場(chǎng)強(qiáng)度中帶電分子的遷移速度。Zeta電位(ζ)與電泳遷移率(μ)滿足關(guān)系式:

式(1)中ε為介質(zhì)的介電常數(shù),ζ為電勢(shì),η表示黏度系數(shù)。

2.2 光學(xué)倒置顯微鏡裝置

光學(xué)倒置顯微鏡主要由機(jī)械、照明、光學(xué)三個(gè)部分組成,在結(jié)構(gòu)方面與普通的顯微鏡類(lèi)似,其原理如圖2所示。光學(xué)倒置顯微鏡的幾個(gè)主要部件及其功能:(1)光源的視場(chǎng)光闌(luminuos field diaphragm) 是一個(gè)重要的部件,能夠根據(jù)使用的物鏡倍數(shù)來(lái)調(diào)節(jié)大小。視場(chǎng)光闌的主要功能是:a.在成像光路系統(tǒng)中,控制雜色光的影響,尤其是雜散光對(duì)照相系統(tǒng)的干擾可以得到避免,這樣可以防止顯微照相底片蒙上一層灰霧。b.控制光束的大小,使光束能夠均勻照到觀察的視野。(2)機(jī)械移動(dòng)式載物臺(tái)(specimen stage)可以承載待測(cè)樣品,裝著能夠在水平方向前后左右移動(dòng)的調(diào)節(jié)裝置,這樣能夠使待測(cè)樣品更好的匹配顯微照相的取景框。(3) 物鏡(objectives)作為顯微鏡的核心光學(xué)部件,其分辨本領(lǐng)、像差和色差的校正狀態(tài)和工作距離、放大倍數(shù),這些參數(shù)都是通過(guò)調(diào)節(jié)物鏡來(lái)決定的。(4) 目鏡(eyepicecs)的作用是將所成像再放大一次,顯微鏡的放大倍數(shù)通常就是物鏡放大倍數(shù)乘上目鏡的放大倍數(shù)。(5) 粗、細(xì)準(zhǔn)調(diào)焦旋鈕(coaxial coarse/fine focusing controls)調(diào)焦時(shí)會(huì)導(dǎo)致燕尾導(dǎo)板上下移動(dòng)從而達(dá)到移動(dòng)舞臺(tái)托架調(diào)焦的效果。

圖2 光學(xué)倒置顯微鏡原理圖

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 YCl3誘導(dǎo)BSA發(fā)生LLPS的過(guò)程

如圖3所示,展示了依賴YCl3濃度變化,BSA進(jìn)入LLPS與結(jié)束LLPS過(guò)程中的溶液直觀現(xiàn)象。首先固定BSA質(zhì)量濃度為100 mg/mL,隨著YCl3濃度的增加,溶液體系會(huì)經(jīng)歷三個(gè)過(guò)程:第一個(gè)過(guò)程對(duì)應(yīng)YCl3濃度小于8 mmol/L(圖1(a)),樣品溶液呈透明狀,說(shuō)明這個(gè)濃度范圍的YCl3不足以引起B(yǎng)SA的LLPS。第二個(gè)過(guò)程對(duì)應(yīng)YCl3濃度為8～20 mmol/L(圖3(b)),樣品溶液最初是渾濁的(左),靜置15 min會(huì)出現(xiàn)分層的現(xiàn)象(中),取下層淡黃色溶液在光學(xué)倒置顯微鏡下觀察,可以看到懸浮的小液滴(右),這些小液滴直徑大小約為1～7 μm,通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)這些小液滴可以合并增長(zhǎng),這一系列現(xiàn)象表明BSA處于LLPS狀態(tài)。第三個(gè)過(guò)程對(duì)應(yīng)YCl3濃度大于20 mmol/L(圖3(c)),樣品溶液恢復(fù)透明狀態(tài),標(biāo)志著B(niǎo)SA的LLPS相行為結(jié)束。

(a)YCl3濃度小于8 mmol/L；(b)YCl3濃度在8～20 mmol/L；(c)YCl3濃度大于20 mmol/L。圖3 YCl3誘導(dǎo)100 mg/mL BSA發(fā)生LLPS的過(guò)程

在實(shí)驗(yàn)中我們用純水溶解BSA蛋白,而沒(méi)有用緩沖液,是為了避免引入其他離子對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。而且我們也測(cè)量了在水溶液中不同濃度的BSA溶液的pH,如表1所示,發(fā)現(xiàn)BSA溶液的pH隨著濃度變化不大,其pH均大于等電點(diǎn),BSA分子一直帶負(fù)電,不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表1 30～100 mg/mL BSA溶液pH測(cè)量

3.2 BSA的LLPS相圖

上述實(shí)驗(yàn)中將BSA處于LLPS對(duì)應(yīng)的較小YCl3濃度(c*=8 mmol/L)與較大YCl3濃度(c**=20 mmol/L)之間的范圍稱為臨界鹽濃度。接下來(lái)通過(guò)相同手段研究更大濃度范圍BSA的LLPS臨界鹽濃度,如圖4所示,根據(jù)30～100 mg/mL BSA分別對(duì)應(yīng)的臨界鹽濃度繪制了BSA的LLPS相圖。可見(jiàn)隨著B(niǎo)SA濃度的增加,c*與c**都在逐漸上移,LLPS范圍實(shí)現(xiàn)由窄到寬的過(guò)程。

圖4 BSA的LLPS相圖

3.3 BSA電泳遷移率數(shù)據(jù)分析

為了進(jìn)一步分析YCl3誘導(dǎo)BSA發(fā)生LLPS的作用機(jī)制,我們采用動(dòng)態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定了BSA的電泳遷移率隨YCl3濃度的變化。如圖5所示,黑色曲線描述在恒定的40 mg/mL BSA質(zhì)量濃度下,隨著YCl3溶液濃度的增加,BSA球蛋白的電泳遷移率的變化趨勢(shì)。隨著YCl3溶液濃度的增加,BSA電泳遷移率實(shí)現(xiàn)由負(fù)到正的逐漸升高的轉(zhuǎn)變,其中在YCl3溶液濃度對(duì)應(yīng)約6 mmol/L時(shí),BSA電泳遷移率實(shí)現(xiàn)由負(fù)到正的逆轉(zhuǎn),值得注意的是,電荷逆轉(zhuǎn)節(jié)點(diǎn)與圖4所展示40 mg/ml BSA發(fā)生LLPS的c**對(duì)應(yīng)一致,這說(shuō)明LLPS相行為本質(zhì)上伴隨著B(niǎo)SA表面電荷逆轉(zhuǎn)。

圖5 BSA電泳遷移率隨YCl3濃度的變化

3.4 機(jī)制討論

首先根據(jù)電泳遷移率數(shù)據(jù)探討YCl3誘導(dǎo)BSA發(fā)生LLPS的靜電相互作用理論機(jī)制:在水溶液中BSA是帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)[21],第一階段對(duì)應(yīng)較低的YCl3溶液濃度(<3 mmol/L)存在時(shí),靜電吸引作用驅(qū)使Y3+與BSA分子結(jié)合,這個(gè)過(guò)程中Y3+較好地與BSA暴露的帶負(fù)電荷的側(cè)鏈相互作用,從而調(diào)節(jié)表面電荷分布。由于Y3+濃度未達(dá)到補(bǔ)償BSA表面凈負(fù)電荷的數(shù)量,BSA分子因帶同種電荷而相互排斥。第二階段隨著YCl3溶液濃度的增加(3～7 mmol/L),BSA表面吸引更多Y3+,達(dá)到一定濃度的Y3+可以適當(dāng)補(bǔ)償BSA表面的凈負(fù)電荷,BSA分子之間的排斥相互作用被Y3+吸引相互作用所補(bǔ)償,Y3+通過(guò)橋連不同的BSA導(dǎo)致原本相互排斥的BSA聚集在一起形成富含蛋白質(zhì)的樣品下層濃相。第三階段中Y3+濃度過(guò)大而過(guò)度補(bǔ)償導(dǎo)致BSA表面實(shí)現(xiàn)由負(fù)到正的電荷逆轉(zhuǎn),短程吸引和長(zhǎng)程排斥的平衡導(dǎo)致了聚集物的重新溶解標(biāo)志著LLPS的結(jié)束。如圖6(左)所示,描述了YCl3誘導(dǎo)BSA發(fā)生LLPS的系統(tǒng)機(jī)制,隨著YCl3濃度的增加會(huì)經(jīng)歷三個(gè)過(guò)程:首先當(dāng)YCl3濃度小于c*時(shí),少量Y3+與BSA結(jié)合,此時(shí)BSA復(fù)合物整體帶負(fù)電,溶液呈透明狀態(tài);當(dāng)YCl3濃度處于c*～c**時(shí),Y3+橋接不同BSA分子,導(dǎo)致BSA分子凝聚,實(shí)現(xiàn)LLPS;最后YCl3濃度大于c**時(shí),BSA復(fù)合物整體帶正電而相排斥,溶液恢復(fù)透明。結(jié)合圖6(右),從電荷逆轉(zhuǎn)的角度描述了LLPS過(guò)程,可見(jiàn)LLPS狀態(tài)的BSA基本處于表面電荷中和的狀態(tài),兩端狀態(tài)都因具有相同電荷而相互排斥。

圖6 YCl3誘導(dǎo)BSA發(fā)生LLPS機(jī)制圖(左)以及BSA表面電荷逆轉(zhuǎn)(右)

4 結(jié) 論

本文通過(guò)樣品現(xiàn)象記錄、光學(xué)倒置顯微鏡觀察直觀的展現(xiàn)了BSA溶液的經(jīng)歷的一系列變化。結(jié)果表明:處于臨界濃度的YCl3能夠誘導(dǎo)BSA發(fā)生LLPS相行為。最后通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)得到BSA電泳遷移率數(shù)據(jù)對(duì)LLPS機(jī)制進(jìn)行分析得出結(jié)論:一定濃度范圍的Y3+與BSA表面的凈負(fù)電荷相結(jié)合,BSA分子之間的排斥相互作用被Y3+吸引相互作用所補(bǔ)償,Y3+通過(guò)橋連不同的BSA導(dǎo)致原本相互排斥的BSA聚集在一起形成富含蛋白質(zhì)濃相。本課題對(duì)蛋白質(zhì)LLPS研究具有一定的重要意義,尤其在LLPS病理方面或者LLPS機(jī)制方向的研究提供更有價(jià)值的參考。