楊光梅,黃 燕,楊麗英,陳 健,李浩成,范銀英,郭利群,2△
(1.云南現(xiàn)代民族藥工程技術(shù)研究中心,云南 昆明 650217;2.云南省科學(xué)技術(shù)院,云南 昆明 650228)
草果屬于多年生姜科豆蔻屬常綠草本植物,主產(chǎn)于我國云南、廣西、貴州等省,其中云南是國內(nèi)最大的主產(chǎn)區(qū)。草果是一種重要的香料和藥材。又稱草果仁、草果子、老蔻,其香辛成粉主要為揮發(fā)油中的反-S-烯醛(Trans-s-undecenal)。此外尚含有香葉醇(Geraniol)和草果酮(Tsao kone)等成分。草果的功效和作用為燥濕化痰、避解瘟疫、截瘧祛痰、祛寒止痛、調(diào)氣消食、溫中止嘔……是中藥方劑(散劑、丸劑、酒劑)、片劑、草果配方顆粒等制劑主要原材料,同時也香料、食品添加劑的重要成分。種植期間會受到病蟲害的影響,主要病蟲害有立枯病、鉆心蟲、草果疫霉菌、草果炭疽病、草果葉斑病。雖然草果在投料使用前經(jīng)過了適當(dāng)?shù)牧罆?、干燥等處理,但作為藥材或香料直接投入使用,非常有必要對其所含的農(nóng)藥殘留成分,尤其是國家農(nóng)業(yè)部及相關(guān)部門已明令禁止使用的高毒、劇毒、高殘留、致癌、致畸、致突變的農(nóng)藥組分及《中國藥典》2020版四部農(nóng)藥殘留的規(guī)定進(jìn)行控制和考察,保證患者用藥安全,建立適用于藥食同源草果的農(nóng)藥殘留測定方法[1]。近年來,QuEChERs(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)發(fā)展較快已成為國際上廣泛并得認(rèn)可的一種用于中藥材、農(nóng)副產(chǎn)品等殘留檢測的快速樣品前處理技術(shù),本法有高效、快速、簡單、科學(xué)、高回收率等特點,在農(nóng)藥殘留檢測中得到普遍應(yīng)用[2-3]。本實驗采用 QuEChERs-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定草果24種禁用農(nóng)藥殘留[4]。
1.1 儀器 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilengt 7890B+7000C 15 GC/MS美國安捷倫公司)、電子天平(BSA-224S-CW賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)、純水機(jī)(Milli-Q Integral 15密理博中國有限公司)分液漏斗震蕩器(MMW-1000W 東京理化器械株式會社)、多功能冷凍離心機(jī)(Rotina 380R上海凌儀生物科技有限公司)、震蕩器(VORTEX 海門市其林貝爾儀器制遠(yuǎn)有限公司)。
1.2 試劑 乙腈﹝GR,fisher賽默飛世爾科技(中國)﹞、冰醋酸(AR國藥集團(tuán)試劑有限公司)、鹽包(批號:5928-0755)QuEChERs SPE凈化管(批號:6559539-01北京迪馬科技公司)
1.3 對照品 禁用農(nóng)藥混合對照溶液(批號:610020-202001中國食品藥品檢定研究院)
1.4 樣品 所用批號的17批草果藥材經(jīng)鑒定均為正品:草果CG1云南省瀘水雙米地村;草果CG2云南省上帕鎮(zhèn)同心社區(qū);草果CG3云南省知子羅村;草果CG4云南省石月亮村;草果CG5云南省上帕鎮(zhèn)上帕村;草果CG6云南省瀘水苗干山村;草果CG7云南省上帕鎮(zhèn)木古甲村;草果CG8云南省瀘水段家寨村;草果CG9云南省上帕鎮(zhèn)達(dá)友村;草果CG10云南省瀘水大密扣村;草果CG11云南省上帕鎮(zhèn)古泉村;草果CG12云南省老姆登村;草果CG13云南省瀘水新田村;草果CG14云南省福貢縣鹿馬登鄉(xiāng)亞坪村;草果CG15云南省瀘水白水河村;草果CG16云南省瀘水老六庫村;草果CG17云南省上帕鎮(zhèn)施底村。
2.1 色譜條件
2.1.1 載氣類型 氮氣、氦氣(純度:99.99%以上);
2.1.2 色譜柱毛細(xì)管柱 固定液名稱:50%(苯基)-甲基聚硅氧烷,固定液膜厚度:0.25 um,固定液涂抹濃度:100%;
2.1.3 程序升溫 初始溫度60 ℃,保持1 min,以30 ℃/min升至120 ℃,再以每分鐘10 ℃的速率升溫至160 ℃,再以每分鐘2 ℃的速率升溫至230 ℃;最后以每分鐘15 ℃的速率升溫至300 ℃,保持6 min;
2.1.4 進(jìn)樣方式 進(jìn)樣體積:1.0 μL,進(jìn)樣口溫度:250 ℃,不分流;
2.1.5 質(zhì)譜檢測器參數(shù) EI離子源 離子源溫度:250 ℃,質(zhì)譜傳輸接口溫度:250 ℃。
2.1.6 檢測模式 MRM模式[5-6]。
2.2 對照品溶液的配制 精密量取對照品0.5 mL,置于10 mL容量瓶中,加色譜乙腈稀釋至刻度,混勻,制成對照品儲備液。
2.3 空白基質(zhì)溶液制備 取草果空白基質(zhì)樣品,同2.6供試品溶液制備方法處理制成空白基質(zhì)溶液[7]。
2.4 內(nèi)標(biāo)溶液配制 稱取磷酸三苯酯對照品適量,精密稱定,加色譜乙腈溶解并稀釋成每1 mL含1.0 mg的溶液,即得。精密量取適量,加乙腈稀釋制成每1 mL含0.1 mg的內(nèi)標(biāo)溶液。
2.5 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備 精密量取對照品儲備溶液10 μL,并精密加入空白基質(zhì)600 μL,混勻,即得濃度約為5 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL,精密加入空白基質(zhì)600 μL,混勻,即得濃度約為10 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用相同的方式依次稀釋分別得到濃度約為5 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、75 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。
2.6 供試品溶液的制備 取不同批次來源的供試品,分別粉碎成粉末(并過三號篩),精密稱定3 g,放置于聚苯乙烯具塞離心管中,加入15 mL 1%冰醋酸溶液,在渦旋儀上混勻讓藥粉充分浸潤,放置30 min以上,精密加入15 mL色譜乙腈與內(nèi)標(biāo)溶液 100 μL,混勻,置振蕩器上劇烈震蕩(500 次/min)10 min以上,加入質(zhì)量比例為(1∶4)無水乙酸鈉與無水硫酸鎂的混合粉末7.5 g,及時搖散,再置振蕩器上劇烈振蕩(500 次/min)10 min左右,于冰浴中冷卻 10 min,離心(3500 轉(zhuǎn)/min)5 min。取上清液9 mL,置已預(yù)先裝有凈化材料的分散固相萃取凈化管[N-丙基乙二胺(PSA)300 mg,無水硫酸鎂900 mg,十八烷基硅烷鍵合硅膠300 mg,石墨化炭黑90 mg,硅膠300 mg]中,渦旋使充分混勻,再置振蕩器上劇烈震蕩(600 次/min)10 min使凈化完全,離心(4500 轉(zhuǎn)/min)10 min,吸取上清液 用微孔濾膜(0.22 μm)濾過,取續(xù)濾液,即得。
分別取對照品溶液、供試液溶液、空白基質(zhì)溶液進(jìn)樣,圖譜見圖1~圖3:
圖1 對照品圖譜
圖2 樣品圖譜
2.7 檢出限、定量限、線性關(guān)系與線性范圍考察 精密吸取禁用農(nóng)殘對照品溶液濃度約10 ng/mL、20 ng/mL、40ng/mL、60 ng/mL、80 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL溶液 2 μL注入液相色譜儀按上述色譜條件測得分析物峰面積,以峰面積積分值進(jìn)行回歸處理。結(jié)果見表1。
表1 各分析物的檢出測定結(jié)果
2.8 系統(tǒng)精密度、準(zhǔn)確度(加標(biāo)回收率)
2.8.1 參照對照品溶液配制與供試品溶液配制方法 配制約50 ng/mL對照品溶液1份,對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6針,分別記錄24項禁用農(nóng)藥的保留時間與峰面積。可接受標(biāo)準(zhǔn):各峰的保留時間RSD≤2%(n=6),各峰的峰面積RSD≤15%(n=6)。
2.8.2 采用全程加標(biāo)法 即取約3.0 g草果粉末,精密稱定,加入農(nóng)藥殘留對照品儲備液0.75 mL、1.5 mL、2.25 mL各3份,對照品的加入量為與所取供試品中待測定成分量之比控制在1∶0.5、1∶1、1∶1.5左右,之后按照供試品溶液制備方法配制。按50%、100%、150%濃度分別配制9份供試品加標(biāo)溶液。對照品、供試品溶液各進(jìn)樣1次,進(jìn)樣體積為1.0 μL。
2.8.3 將上述配制好供試品液進(jìn)樣2 μL 結(jié)果見表2。
表2 系統(tǒng)精密度、回收率結(jié)果
2.9 樣品測定 分別精密吸取上述制備好的基質(zhì)混合對照品溶液和供試品溶液各1 μL,精密加入磷酸三苯酯內(nèi)標(biāo)溶液0.3 mL,混勻,濾過,取續(xù)濾液。分別精密吸取上述兩種溶液各1 μL注入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,按內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算各分析物含量。結(jié)果:17批草果藥材中均未檢查出24種分析物。
草果是藥食同源的品種,無論是作為藥材提取加工成制劑服用,還是作為食品香料、調(diào)料直接供大眾食用,對人體都存在一定的安全隱患。需要對農(nóng)藥殘留及安全性進(jìn)行控制,保障人們食用安全。
藥材草果經(jīng)加工處理后為干燥藥材,含水量不多。3 g的樣品量比較方便合適,且具有一定的代表性。不會因取樣量過大,而導(dǎo)致試劑、樣品的浪費及環(huán)境的污染。 最后處理得到供試品溶液中藥材含量為0.5 g·mL-1,滿足藥材痕量分析要求。
提取后的草果溶液含有酚類、糖、多糖、皂苷、黃酮、蒽醌、香豆素、內(nèi)酯、揮發(fā)油、萜類、油脂等多種物質(zhì),有的成分對分析會造成干擾。快速樣品處理法(QuEChERS)相對直接提取法能更好地去除雜質(zhì)、防止被測組分和回收率的流失、保證試驗的準(zhǔn)確性。
離子對的優(yōu)化與判斷標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)全掃描質(zhì)譜得到標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥的各保留時間劃分時間段,盡可能減少在每一時間段所檢測目標(biāo)化合物的數(shù)量。在質(zhì)譜圖中,選擇3對特征離子,豐度較高的一對作為定量離子對,其余兩對為定性離子對。采用保留時間和離子豐度比定性,再用定量離子對的峰面積定量。
參照氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對17批草果進(jìn)行農(nóng)藥殘留量的測定,其標(biāo)準(zhǔn)限度按 《中國藥典》2020年版四部通則0212藥材和飲片檢定通則項下33種禁用農(nóng)藥不得檢出(不得過定量限)的表執(zhí)行,其中氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法收載31種農(nóng)藥測定,但高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法也有部分項目重復(fù)檢測,考慮分析物內(nèi)吸磷、久效磷、水胺硫磷、蠅毒磷、磷酸三苯酯、苯線磷、治螟磷等已在高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測效果較佳,所以不再復(fù)進(jìn)行測定只測定上述24項結(jié)果均為未檢出。根據(jù)上述探索性研究結(jié)果表明,該方法基本可適用于草果禁用農(nóng)藥殘留的質(zhì)量控制。
本研究建立了草果藥材中禁用農(nóng)藥殘留量測定法。對不同來源、方法適用性、分析物含量等方面進(jìn)行了考察研究,發(fā)現(xiàn)能按此超氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對草果藥材進(jìn)行24種禁用農(nóng)藥殘留測定,此方法能準(zhǔn)確、快速、科學(xué)、有效地控制產(chǎn)品質(zhì)量。確定取樣量為3 g,采用快速樣品處理法(QuEChERS)處理,按此氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法為草果24種禁用農(nóng)藥殘留測定法。