趙令敏，張艷芳，邢麗南，葛明然，劉小燕，霍秀文*

(1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝與植物保護(hù)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)野生特有蔬菜種質(zhì)資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010019；2 鄂爾多斯市農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究院，內(nèi)蒙古鄂爾多斯 017000)

山藥(DioscoreaoppositaThunb.)為薯蕷科(Dioscoreaceae)薯蕷屬(DioscoreaL.)具有雙子葉特性的單子葉植物[1]。山藥是世界上十大根莖類作物之一，為全球超過3億人提供糧食和經(jīng)濟(jì)來源[2]。山藥以塊莖為主要的產(chǎn)品器官[3-4]，其中淀粉作為山藥塊莖的主要成分，也是主要的熱量來源，約占干物質(zhì)含量的80%[5]。淀粉不僅可以提供山藥生長(zhǎng)發(fā)育所需要的物質(zhì)和能量，在生物工業(yè)中也有廣泛的應(yīng)用[6]。

山藥塊莖內(nèi)淀粉積累、直鏈淀粉和支鏈淀粉比例調(diào)控對(duì)山藥品質(zhì)改良有積極意義[7]。支鏈淀粉主要由可溶性淀粉合成酶(starch synthases，SSS)、淀粉分支酶(starch-branching enzymes，SBE)和淀粉去分支酶(starch debranching enzyme，DBE)催化[8]。DBEs根據(jù)催化底物的不同可分為普魯藍(lán)酶(pullulanase，PUL)(EC3.2.1.41)和異淀粉酶(isoamylase，ISA)(EC3.2.1.68)。異淀粉酶是植物器官中淀粉結(jié)構(gòu)和數(shù)量的關(guān)鍵決定因素，在一定程度上決定淀粉支鏈和直鏈的比例[9]。異淀粉酶最早是在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的，催化水解支鏈淀粉分支點(diǎn)上的(1，6)-α-葡萄糖基鍵。此外，對(duì)異淀粉酶基因的功能已經(jīng)在多種植物中研究。例如，在水稻[10]、擬南芥[11]、馬鈴薯[12]、大麥[13]、甜玉米[14]作物中均被證明ISA基因的缺失會(huì)導(dǎo)致淀粉顆粒的形成。異淀粉酶有3種同工型酶，ISA1、ISA2、ISA3，形成3種同工酶聚合物行使其功能，ISA基因引起支鏈淀粉的積累異常，從而參與淀粉的生物合成。

迄今，已經(jīng)有大量的ISA基因在植物中被克隆和研究，而山藥中的ISA基因還沒有被充分發(fā)掘。本研究通過測(cè)定山藥塊莖淀粉及其組分含量、ISA活性，并基于本課題組前期的山藥轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，克隆得到ISA3基因并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，分析其在山藥塊莖膨大不同時(shí)期及其不同組織的表達(dá)情況，進(jìn)一步探討了不同淀粉含量的山藥塊莖淀粉積累規(guī)律與淀粉代謝相關(guān)酶ISA活性及ISA3基因表達(dá)量之間的相關(guān)性，挖掘影響塊莖淀粉積累的關(guān)鍵因子，為進(jìn)一步研究ISA3基因在山藥塊莖淀粉代謝中的功能和發(fā)掘調(diào)控淀粉代謝相關(guān)基因提供重要參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以內(nèi)蒙古‘畢克齊’(B1)和‘大和長(zhǎng)芋’(DHCY)山藥為試驗(yàn)材料，于2021年5月初種植于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)山藥種質(zhì)資源圃。取樣時(shí)期為種植后的第90天、105天、120天、135天和150天。取樣時(shí)選擇長(zhǎng)勢(shì)均勻一致的植株，每個(gè)品種各選取3株混樣作為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共3次重復(fù)。分別取山藥的塊莖、莖及幼嫩葉片各1 g，用錫箔紙包裹，液氮中速凍，置于-80 ℃冰箱，用于RNA的提取及酶活性測(cè)定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 淀粉含量及異淀粉酶活性測(cè)定參考何潔等[15]雙波長(zhǎng)法對(duì)山藥塊莖不同膨大時(shí)期的淀粉、直鏈淀粉和支鏈淀粉含量進(jìn)行測(cè)定。參考Liang等[16]的方法對(duì)異淀粉酶活性進(jìn)行測(cè)定，以支鏈淀粉為底物，用DNS法測(cè)定山藥塊莖中異淀粉酶活性。每個(gè)樣品3次重復(fù)。

1.2.2 總RNA的提取及cDNA合成采用RNA提取試劑盒(MiniBest Plant RNA Extraction Kit)分別提取B1、DHCY不同發(fā)育時(shí)期塊莖、莖及幼嫩葉片的總RNA，通過試劑盒(PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit)反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。

1.2.3ISA3的ORF克隆根據(jù)本課題組前期高通量測(cè)序獲得的山藥轉(zhuǎn)錄組結(jié)果篩選異淀粉酶基因-ISA3(Unigene0001496)。通過Primer Premier 5.0軟件在ISA3的開放閱讀框(ORF)兩端設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(表1)。反應(yīng)體系為：Extaq 25 μL,ISA3-ORF-F/R(10 μmol·L-1)各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 22 μL。反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性10 min;94 ℃變性30 s;56 ℃退火30 s;72 ℃延伸2 min;30 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收、連接轉(zhuǎn)化后，將陽性克隆送至華大基因測(cè)序。

表1 ISA3基因的引物序列

1.2.4 生物信息學(xué)分析在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查找和翻譯ISA3基因cDNA序列的CDS；利用在線分析軟件Prot Scale(http://www.expasy.org/tools/protscale/)進(jìn)行疏水性、親水性預(yù)測(cè)；利用Prot Param(http://www.expasy.org/tools/protparam/)在線分析軟件對(duì)ISA3編碼的蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析；利用NCBI的CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ cdd/wrpsb.cgi)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析；運(yùn)用SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/ npsa_automat. pl? page= npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)ISA3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；將NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST氨基酸序列進(jìn)行同源搜索和比對(duì)；利用MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5ISA3基因表達(dá)分析采用TB GreenTMPremix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)，Bulk試劑盒。以山藥的18S為內(nèi)參基因，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)。反應(yīng)體系為：cDNA 2 μL(200 ng·L-1)，ISA3-qF/R各1 μL(10 μmol·L-1)，TB Green Premix Ex TaqⅡ 25 μL，ddH2O 1 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)；溶解曲線：95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s；每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次。利用2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 相關(guān)性分析將淀粉及其組分含量、異淀粉酶活性及其ISA3基因的表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析。采用Excel 2010應(yīng)用軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖，采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 山藥塊莖淀粉含量及異淀粉酶活性

對(duì)2個(gè)品種山藥塊莖不同膨大時(shí)期的直鏈淀粉、支鏈淀粉和總淀粉含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，2個(gè)品種山藥的總淀粉含量在塊莖膨大過程中總體呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，但其淀粉含量差異較大：‘畢克齊’(B1)的淀粉含量范圍為28%～82%，最高可達(dá)81.31%，且在120 d時(shí)期淀粉含量顯著高于其他時(shí)期；‘大和長(zhǎng)芋’(DHCY)的淀粉含量范圍為55%～95%，最高可達(dá)94.06%，同樣在120 d時(shí)期淀粉含量顯著高于其他時(shí)期。

同時(shí)期品種間比較發(fā)現(xiàn)(圖1，Ⅰ)，除135 d外，其余時(shí)期DHCY的淀粉含量均顯著高于B1。在塊莖膨大過程中，B1和DHCY的直鏈和支鏈淀粉含量也呈先上升后降低的變化趨勢(shì)。支鏈淀粉含量變化較大，在T1已經(jīng)進(jìn)入快速積累期，在T3時(shí)B1和DHCY的支鏈淀粉含量均顯著高于其他時(shí)期，T1～T5期間DHCY的支鏈淀粉含量均顯著高于B1(圖1，Ⅱ)。但2個(gè)品種山藥塊莖直鏈淀粉含量均一直維持較低水平，且在2品種之間變化趨勢(shì)不明顯，DHCY的直鏈淀粉含量高于B1，但未達(dá)到顯著水平(圖1，Ⅲ)。

2個(gè)品種山藥塊莖不同膨大時(shí)期的異淀粉酶(ISA)活性測(cè)定結(jié)果(圖1，Ⅳ)顯示，在整個(gè)膨大期，B1的酶活性均高于DHCY，酶活性從T1開始增加，至T3開始下降，且僅在T3時(shí)期2個(gè)品種山藥的ISA活性呈顯著性差異。

取樣時(shí)期為種植后的天數(shù)；不同大寫字母表示同一品種不同取樣時(shí)間之間的顯著差異(P<0.05)；不同小寫字母表示不同品種同一取樣時(shí)間的顯著差異(P<0.05)；圖5同圖1 山藥塊莖膨大期淀粉組分含量及異淀粉酶活性的變化Different capital letters indicate significant differences among different sampling times of the same variety (P<0.05); Different normal letters indicate significant differences among different varieties at the same sampling time (P<0.05); The same as Fig.5Fig.1 Changes of starch and component contents and starch debranching enzyme activity during the expansion stage of yam tubers

2.2 ISA3基因的克隆

以山藥塊莖總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，使用ISA3-ORF-F和ISA3-ORF-R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小約為1 500 bp的條帶(圖2)。經(jīng)測(cè)序后表明ISA3基因的ORF片段長(zhǎng)1 584 bp，共編碼527個(gè)氨基酸(圖3)。

M. DL5000；1. PCR產(chǎn)物圖2 ISA3的ORF擴(kuò)增M. DL5000; 1.PCR productFig.2 ISA3 open reading frame amplification

圖3 ISA3的CDS序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.3 CDS and its deduced amino acid sequences of ISA3

2.3 ISA3蛋白序列和進(jìn)化分析

對(duì)山藥ISA3蛋白理化性質(zhì)分析，預(yù)測(cè)ISA3基因編碼蛋白的理論分子量為60.21 kD，分子式為C2703H4054N740O783S24，總原子數(shù)8 304，等電點(diǎn)為6.15。ISA3蛋白的總平均疏水性為-0.484，預(yù)測(cè)為親水性蛋白。CDD分析顯示，ISA3蛋白含有AmyAc_Glg_debranch(alpha amylase catalytic domain found in glycogen debranching enzymes)結(jié)構(gòu)域。SOPMA分析預(yù)測(cè)ISA3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，該蛋白主要由α螺旋(h)、β轉(zhuǎn)角(t)、無規(guī)則卷曲(c)和延伸鏈構(gòu)成，其中無規(guī)則卷曲最多，占氨基酸序列的51.04%，其次為α螺旋(24.10%)和延伸鏈(18.60%)，β轉(zhuǎn)角最少(6.20%)。

選取NCBI中Blastp 搜索與其序列一致性較高的單子葉和雙子葉植物ISA3，以及廣泛研究的水稻、玉米等物種的ISA3蛋白，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)。結(jié)果表明，山藥ISA3蛋白與同為薯蕷科的幾內(nèi)亞山藥和參薯的ISA3蛋白聚在一個(gè)分支。從系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)可以看出，山藥ISA3蛋白與小果野蕉、椰子和海棗等單子葉植物遺傳距離較近，與辣椒、蓮和野大豆等雙子葉植物遺傳距離較遠(yuǎn)，而野生稻、小麥和玉米等禾本科單子葉植物則形成另一個(gè)分支。

圖4 山藥ISA3氨基酸序列與其他物種同源序列的進(jìn)化樹分析Fig.4 Evolutionary tree analysis of the amino acid sequence of yam ISA3 and homologous sequences of other species

表2 山藥塊莖膨大期淀粉合成關(guān)鍵酶活性及其基因表達(dá)量與淀粉含量的相關(guān)性

2.4 ISA3基因的表達(dá)分析

對(duì)2個(gè)品種山藥ISA3基因在不同膨大時(shí)期以及不同組織中的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果(圖5)表明，在B1中，ISA3基因的表達(dá)量呈先上升后降低的趨勢(shì)，T1～T2時(shí)期的表達(dá)量顯著升高隨后下降，在T2時(shí)期的表達(dá)量顯著高于其余各時(shí)期。而DHCY山藥中ISA3基因的表達(dá)呈下降的趨勢(shì)，在T1之后的表達(dá)量顯著降低，且其余時(shí)期無顯著變化(圖5)。2個(gè)品種山藥ISA3基因不同組織的表達(dá)情況(圖6)表明，在B1中ISA3基因的表達(dá)量為塊莖>葉片>莖，在DHCY中ISA3基因的表達(dá)量為莖>葉>塊莖。結(jié)果說明，不同品種山藥ISA3在不同組織存在特異性表達(dá)。

圖5 山藥塊莖膨大期ISA3的表達(dá)變化Fig.5 Changes of ISA3 expression during the tuber expansion of yam

不同小寫字母表示不同組織間差異顯著圖6 山藥不同組織中ISA3的表達(dá)The normal letters mean significance difference among different tissuesFig.6 Expression of ISA3 in different tissues of yam

2.5 相關(guān)性分析

在山藥塊莖膨大過程中，分別分析了2個(gè)品種山藥直鏈淀粉含量、支鏈淀粉含量、淀粉含量、ISA酶活性及ISA3基因表達(dá)之間的相關(guān)性。結(jié)果(表2)發(fā)現(xiàn)，在B1和DHCY山藥塊莖內(nèi)，淀粉含量與支鏈淀粉含量、直鏈淀粉含量之間呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。在2個(gè)品種山藥塊莖中，ISA活性與淀粉含量、直鏈淀粉含量和支鏈淀粉含量之間均為正相關(guān)關(guān)系。在B1中，ISA活性與淀粉和支鏈淀粉含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.560、0.565，P<0.05)。在DHCY中，ISA活性與淀粉和支鏈淀粉含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.775、0.781，P<0.01)。在B1中，ISA基因表達(dá)量與ISA活性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，且在DHCY中達(dá)到極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。

3 討 論

淀粉的合成降解代謝與植物器官的發(fā)育密切相關(guān)[17]，是影響塊莖產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素[18]。淀粉在食品以及工業(yè)生產(chǎn)上都有著極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，因此，對(duì)于淀粉的生物合成和降解機(jī)理也越來越受到研究者的關(guān)注[19-20]。異淀粉酶是淀粉代謝過程中的關(guān)鍵酶，直接參與支鏈淀粉的合成[21]。本研究中2個(gè)品種山藥ISA與支鏈淀粉和淀粉含量呈顯著和極顯著正相關(guān)關(guān)系，且在淀粉含量高的品種DHCY中的相關(guān)性系數(shù)高于淀粉含量低的品種B1。在水稻灌漿過程中非糯品種與糯稻品種異淀粉酶活性變化特性不同，非糯品種呈單峰曲線變化，并且直鏈淀粉含量低的品種灌漿各時(shí)期的酶活性顯著高于含量高的品種，胚乳中較高的異淀粉酶活性有利于支鏈淀粉的合成，而支鏈淀粉的合成積累卻降低了直鏈淀粉的積累[22]。野生型擬南芥異淀粉酶的缺失可導(dǎo)致突變系中淀粉的積累減少90%，并且糖原的積累也減少90%[23]。說明異淀粉酶活性有利于支鏈淀粉的合成，而支鏈淀粉的合成積累對(duì)直鏈淀粉的積累起到相對(duì)抑制的作用。

ISA編碼的3種亞型基因已經(jīng)在很多作物及藻類中分離出來[24-25]，其中包含將淀粉儲(chǔ)存在籽粒中的水稻[26]、玉米[27]、大麥等[28]，以及淀粉集中在塊根(莖)中的木薯、甘薯和山藥等作物[29-30]。本研究采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和RT-PCR方法，從山藥中分離鑒定了ISA3基因，蛋白序列分析表明，山藥ISA3蛋白在結(jié)構(gòu)上含有糖原脫支酶中的α淀粉酶催化的結(jié)構(gòu)域，表明ISA3蛋白有淀粉酶催化、降解支鏈淀粉為糖原等功能。Pawinee等[31]克隆了木薯異淀粉酶異構(gòu)體3(MeISA3)的全長(zhǎng)基因，并在大腸桿菌SoluBL21(DE3)中進(jìn)行了克隆和表達(dá)。在馬鈴薯中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了3個(gè)參與淀粉合成的ISA同工酶，分別是Stisa1、Stisa2、Stisa3，他們分別由ISA1、ISA2、ISA3基因編碼，Stisa1和Stisa2通過形成復(fù)合體的形式催化水解淀粉，而Stisa3能夠單獨(dú)參與淀粉的分解過程[32]，因此，由ISA3基因編碼的Stisa3在淀粉代謝過程中起著至關(guān)重要的作用。這些結(jié)果表明，ISA3基因參與調(diào)控多種不同植物的淀粉代謝。研究發(fā)現(xiàn)，不同淀粉含量作物品種的異淀粉酶同工型具有不同的基因表達(dá)模式。ISA3的表達(dá)量在山藥塊莖膨大時(shí)期呈雙峰趨勢(shì)，與ISA酶活性、支鏈淀粉和淀粉含量變化趨勢(shì)相反，呈負(fù)相關(guān)和極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，推測(cè)ISA3基因?qū)SA活性起著負(fù)調(diào)控作用，從而影響支鏈淀粉結(jié)構(gòu)及淀粉的合成。ISA3表達(dá)模式具有很強(qiáng)的組織特異性，在葉、莖與塊莖組織中均有表達(dá)，且在不同品種不同組織之間存在特異表達(dá)。侯夫云等[33]為研究甘薯塊根淀粉合成酶基因的表達(dá)特征，以淀粉含量不同的2個(gè)品種為試驗(yàn)材料，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)克隆了甘薯異淀粉酶IbISA的cDNA片段，并對(duì)塊根不同生長(zhǎng)期淀粉合成相關(guān)酶基因IbISA的表達(dá)進(jìn)行研究，表明IbISA基因表達(dá)量呈雙峰曲線變化，在栽插后100 d時(shí)表達(dá)量達(dá)到高峰，低淀粉品種的IbISA表達(dá)量顯著高于高淀粉品種。這與本研究結(jié)果一致。在玉米的淀粉合成通路中分離ISA基因在30 d時(shí)上調(diào)表達(dá)，同時(shí)也檢測(cè)到該基因所對(duì)應(yīng)的蛋白也在30 d時(shí)上調(diào)表達(dá)，促進(jìn)支鏈淀粉的合成[34]。這與本研究結(jié)果不一致，可能是物種不同或ISA家族不同基因行使的功能不同所致。Zhu等[35]對(duì)NnISAs基因的在蓮不同部位的表達(dá)模式進(jìn)行分析表明，NnISAs轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平在葉、葉柄、地下莖、種子和根組織中均可檢測(cè)到，且NnISA3的表達(dá)模式與NnISA1和NnISA2的表達(dá)趨勢(shì)有明顯的不同，在葉柄中轉(zhuǎn)錄水平較高。不同植物中的ISAs表達(dá)模式也不一定相同，ISAs基因正在從不同的植物中被克隆鑒定，ISA雖不決定植物器官形成，但可能參與調(diào)控支鏈淀粉和淀粉的合成，從而調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的過程。而ISA在山藥中怎樣與下游蛋白互作、與哪些通路相關(guān)聯(lián)從而影響山藥塊莖內(nèi)淀粉的合成及其在淀粉結(jié)構(gòu)中的功能還需進(jìn)一步研究。