李嫣斐 張新春

中山大學(xué)附屬口腔醫(yī)院·光華口腔醫(yī)學(xué)院修復(fù)科 廣東省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣州 510055

牙周疾病、腫瘤、感染及外傷等均可造成口腔骨組織缺損，不僅會(huì)引起口腔頜面部形態(tài)異常與功能障礙，也會(huì)為缺失牙的種植修復(fù)帶來困難。骨缺損治療的熱點(diǎn)之一是利用組織工程學(xué)，以生物材料為支架，搭載患者自身干細(xì)胞，聯(lián)合生長(zhǎng)因子實(shí)現(xiàn)骨組織再生，而其瓶頸在于缺乏理想的成骨材料。目前常用的骨修復(fù)和移植的材料主要包括自體骨、同種異體骨、異種骨及人工合成骨。各種材料特性不一，但均有其各自的缺點(diǎn)與不足：自體骨成骨效果最佳，但來源非常有限，易引起供區(qū)并發(fā)癥，對(duì)患者造成額外的創(chuàng)傷與疼痛；同種異體骨與異種骨來源較豐富，但存在免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)，并可能導(dǎo)致交叉感染；人工合成材料不會(huì)造成疾病的傳播，但其誘導(dǎo)骨生成的能力較弱，且生物相容性較差。因此，尋找同時(shí)具有骨傳導(dǎo)性、骨誘導(dǎo)性、生物相容性和可吸收性等優(yōu)良特性的新型成骨材料逐漸成為研究的熱點(diǎn)[1]。牙本質(zhì)與牙槽骨有相同的組織學(xué)來源，成分構(gòu)成與骨組織相似。Yeomans與Urist[2]于1967年發(fā)現(xiàn)了兔牙本質(zhì)具有骨誘導(dǎo)性，并提出其誘導(dǎo)骨再生的方式主要為軟骨內(nèi)成骨[3]。近年來國(guó)內(nèi)外許多研究表明，牙本質(zhì)作為生物支架材料，可提供三維生長(zhǎng)空間并模擬細(xì)胞外基質(zhì)，對(duì)成骨相關(guān)細(xì)胞如成骨細(xì)胞（osteoblasts，OB）[4]、破骨細(xì)胞[5]、牙囊細(xì)胞[6]、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）[7-8]的生長(zhǎng)、增殖與分化有明顯的促進(jìn)作用，具備良好的骨傳導(dǎo)、骨誘導(dǎo)作用及生物相容性。因此，牙本質(zhì)作為一種新型骨修復(fù)材料備受關(guān)注。本文對(duì)牙本質(zhì)材料的成骨機(jī)制、處理方法及其臨床應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 概述

人牙本質(zhì)來源廣泛，可取自臨床治療中拔除的廢用牙或阻生齒，且富含多種骨活性分子。牙本質(zhì)與牙槽骨有相同的組織學(xué)來源，均起源于胚胎時(shí)期的神經(jīng)嵴細(xì)胞[9]，鈣磷含量及成分構(gòu)成均與骨組織相似[10]，用作骨修復(fù)材料時(shí)具有其他材料無法比擬的天然優(yōu)勢(shì)。人牙本質(zhì)主要由質(zhì)量分?jǐn)?shù)65%無機(jī)成分與35%有機(jī)成分構(gòu)成，其中無機(jī)成分以羥磷灰石（hydroxyapatite，HA）為主，還有β磷酸三鈣、無定形磷酸鈣與磷酸八鈣等。牙本質(zhì)有機(jī)成分中，Ⅰ型膠原約占90%[11]，其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)由3股超螺旋結(jié)構(gòu)的膠原相互凝聚交聯(lián)而成，可將礦化結(jié)晶及其他有機(jī)組分，如非膠原蛋白（noncollagenous proteins，NCPs）、蛋白多糖、脂質(zhì)等容納沉淀于其中。此外，牙本質(zhì)中還貯藏有豐富的生物活性分子與生長(zhǎng)因子，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin-like growth factor，IGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGF）、血小板衍生生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等。Avery等[12]利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)對(duì)脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)（demineralised dentine matrix，DDM）中的生長(zhǎng)因子進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示TGF-β1含量最高，達(dá)到15.6 ng·mg-1，余依次為BMP-2、FGF、VEGF及PDGF，其含量分別為6.2、5.5、5.0、4.7 ng·mg-1。牙本質(zhì)這種獨(dú)特的組成結(jié)構(gòu)（無機(jī)成分、NCPs、生長(zhǎng)因子與活性分子），賦予了其在骨組織工程學(xué)中作為生物支架搭載種子細(xì)胞，持續(xù)釋放生長(zhǎng)因子，發(fā)揮骨誘導(dǎo)性以促進(jìn)新骨生成的潛能[13]。

2 牙本質(zhì)作為骨修復(fù)材料的成骨機(jī)制

牙本質(zhì)誘導(dǎo)骨再生的過程是一個(gè)多種細(xì)胞參與、多種通路作用并受多種細(xì)胞因子調(diào)控的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，其具體機(jī)制尚不明確，研究表明[14-26]可能與其無機(jī)成分及獨(dú)特的有機(jī)構(gòu)成有關(guān)。

牙本質(zhì)的無機(jī)成分主要為HA。Maeda等[14]證實(shí)HA可促進(jìn)OB的遷移從而調(diào)節(jié)骨誘導(dǎo)能力的表達(dá)。牙本質(zhì)中的有機(jī)物約90%為Ⅰ型膠原，不僅可為骨再生提供原料，而且還是各種生長(zhǎng)因子的優(yōu)良載體[2]。Wang等[15]發(fā)現(xiàn)：Ⅰ膠原可通過細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases，MAPK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)BMSCs分化為OB，并調(diào)節(jié)成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)以增強(qiáng)成骨功能。在第三磨牙拔牙窩中使用Ⅰ型膠原蛋白，術(shù)后拔牙窩部位的礦化率顯著增加[16]。BMP也是牙本質(zhì)中含量豐富的有機(jī)物質(zhì)，是一種能促進(jìn)異位成骨的分泌型多功能蛋白，參與調(diào)控OB生命周期的各個(gè)方面，包括骨原細(xì)胞擴(kuò)增、OB礦化及其與破骨細(xì)胞的偶聯(lián)等，并可通過印度豪豬蛋白（indian hedgehog，IHH）來誘導(dǎo)BMSCs分化為軟骨細(xì)胞和骨組織，進(jìn)而參與成骨和破骨的過程[17-18]。Choi等[19]在比格犬骨缺損處分別植入10、50、200 μg·mL-1的BMP，16周后通過CT檢查觀察到實(shí)驗(yàn)組平均再生骨厚度與面積顯著大于對(duì)照組，且50 μg·mL-1是最佳質(zhì)量濃度。BMP單獨(dú)使用時(shí)易被各種蛋白酶水解，需要與適當(dāng)載體形成復(fù)合生物支架來發(fā)揮其功效。牙本質(zhì)中的無機(jī)成分作為載體與BMP形成復(fù)合生物支架可有效抵抗酶的降解，并可與BMP形成緩釋系統(tǒng)，在骨缺損區(qū)持續(xù)釋放BMP，與其他生長(zhǎng)因子相互作用，協(xié)同促進(jìn)骨再生的同時(shí)提供礦化所需基質(zhì)[20]。NCPs廣泛存在于牙本質(zhì)、牙骨質(zhì)及骨等礦化組織中，包括牙本質(zhì)磷蛋白（dentin phosphoprotein，DPP）、牙本質(zhì)涎蛋白（dentin sialoprotein，DSP）、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白（dentin matrix protein，DMP）、骨涎蛋白（bone sialoproteins，BSP）、骨鈣蛋白（osteocalcin，OC）和骨橋蛋白（osteopontin，OPN）等。NCPs在骨組織礦化過程中起重要作用。Yu等[21]從健康的人類牙齒中分離出DMP，通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DMP可增強(qiáng)BMSCs的堿性磷酸酶活性和礦化作用，并上調(diào)成骨分化相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)DMP可改變成骨基因的表達(dá)[22]，對(duì)骨骼重塑和礦化的速度、OB與破骨細(xì)胞的形態(tài)和活性有重要調(diào)節(jié)作用[23]。OC與OPN也分別被報(bào)道在磷灰石晶體成核、頜骨的生長(zhǎng)和發(fā)育[24]及牙槽骨的礦化[25]中發(fā)揮作用。VEGF是血管形成最重要的生長(zhǎng)因子，在OB和血管內(nèi)皮細(xì)胞之間起重要連接作用，可增加OB的遷移率，從而促進(jìn)新骨形成。Reis-Filho等[26]用牙本質(zhì)充填大鼠上頜第二磨牙拔牙創(chuàng)，結(jié)果顯示在7、14 d后VEGF表達(dá)明顯增加，并伴有新生血管與新骨生成，拔牙創(chuàng)愈合也早于僅填有血凝塊的對(duì)照組，表明牙本質(zhì)可激活VEGF表達(dá)從而具有骨誘導(dǎo)作用。

牙本質(zhì)的無機(jī)成分及Ⅰ型膠原、BMP、NCPs、VEGF等有機(jī)成分在成骨過程中發(fā)揮重要作用，但每種成分的具體作用機(jī)制及誘導(dǎo)骨再生的上下游信號(hào)通路尚需進(jìn)一步明確。

3 牙本質(zhì)骨修復(fù)材料的處理方法

牙本質(zhì)中含有大量的潛在性抗原物質(zhì)，如脂類、膠原蛋白、蛋白多糖等，且成牙本質(zhì)細(xì)胞突起也可引起免疫排斥反應(yīng)，因此在植入之前，為提高成骨活性，降低感染和免疫排斥反應(yīng)等風(fēng)險(xiǎn)，需經(jīng)過一定的處理，以消減牙本質(zhì)的抗原性。

3.1 脫礦處理

牙本質(zhì)含有大量高礦化、高結(jié)晶、低孔性的HA成分，這會(huì)產(chǎn)生物質(zhì)屏障作用，阻止液體的浸潤(rùn)，使生長(zhǎng)因子不易釋放，干擾OB與MSCs的遷移、附著和分化，因此需去除部分礦物質(zhì)以提高孔隙率從而促進(jìn)成骨效果。Um[27]發(fā)現(xiàn)：脫礦后的牙本質(zhì)由于孔隙增加，可作為骨組織工程學(xué)所需的生物支架，也可作為rhBMP-2的載體，促進(jìn)rh-BMP-2等生長(zhǎng)因子的釋放，從而具有骨誘導(dǎo)性。除此之外，脫礦可提高牙本質(zhì)骨傳導(dǎo)性，對(duì)成骨相關(guān)細(xì)胞的增殖起促進(jìn)作用。Bono等[28]將成骨細(xì)胞樣細(xì)胞接種至脫礦牙本質(zhì)材料表面，觀察到明顯的細(xì)胞黏附、增殖與分化。Koga等[4]還發(fā)現(xiàn)，相較于未脫礦質(zhì)牙本質(zhì)及完全脫礦牙本質(zhì)，部分脫礦的牙本質(zhì)基質(zhì)促進(jìn)OB黏附與誘導(dǎo)新骨形成的能力最強(qiáng)。因此，適當(dāng)?shù)拿摰V不會(huì)破壞牙本質(zhì)中天然蛋白質(zhì)的構(gòu)象及生長(zhǎng)因子的活性，也不會(huì)抑制BMP骨誘導(dǎo)作用。相反，脫礦牙本質(zhì)由于去除了無機(jī)物，HA結(jié)晶度變低，牙本質(zhì)小管增寬，孔隙增加，可使BMP等生長(zhǎng)因子的生物利用度增加，堿性磷酸酶活性增強(qiáng)，成骨相關(guān)細(xì)胞增殖及分化能力提升[29]，從而為新骨形成提供更好的空間支撐。這些特性使得脫礦作為處理牙本質(zhì)的首選方法，被廣泛應(yīng)用于牙本質(zhì)骨修復(fù)材料的加工中。

3.2 煅燒處理

牙本質(zhì)在煅燒后具有良好的生物相容性，可作為支架為骨組織生長(zhǎng)提供結(jié)構(gòu)支持，還可提供鈣和磷等必要的成分。郭津源等[30]將鍛燒處理的牙本質(zhì)與富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）聯(lián)合使用修復(fù)兔顱骨缺損，發(fā)現(xiàn)其能與自體骨形成良好骨結(jié)合，且隨著自體骨的再生逐漸被吸收，具有良好的生物相容性和成骨作用。Kim[31]將拔除的牙齒置于1 200 ℃熔爐中煅燒，然后研磨成直徑小于149 μm的牙本質(zhì)顆粒，與氫氧化鈣以2∶1的質(zhì)量比混合植入骨缺損處，發(fā)現(xiàn)成骨效果良好，表明煅燒處理后的牙本質(zhì)具有良好的生物相容性，能與骨組織形成較強(qiáng)的化學(xué)結(jié)合，具有骨傳導(dǎo)作用。

3.3 冷凍處理

Atiya等[32]拔除新西蘭大白兔上下頜中切牙提取牙本質(zhì)，于液態(tài)氮中冷凍20 min后再放置室溫下15 min，然后將其浸泡在0.2 mL慶大霉素和5 mL 70%乙醇混合液中30～60 min，隨后將其研磨成直徑2～4 mm的小顆粒植入骨缺損處，結(jié)果顯示：新生骨小梁與牙本質(zhì)融合，且骨密度與空白對(duì)照組相比更高，表明液氮冷凍處理的牙本質(zhì)具有骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)雙重特性。

3.4 脫蛋白處理

牙本質(zhì)是致密的礦化組織，脫蛋白加工可提高其孔隙率及增大孔徑，有利于新血管形成和細(xì)胞浸潤(rùn)，發(fā)揮HA等磷酸鈣的支架作用，可有效促進(jìn)骨再生。Fichant等[33]對(duì)牙本質(zhì)進(jìn)行脫蛋白處理，掃描電子顯微鏡下觀察到材料表面出現(xiàn)由膠原纖維消失所形成的新孔隙，使牙本質(zhì)表面的孔隙率增大到約20%。Tabatabaei等[34]在模擬人體液中觀察到：脫蛋白牙本質(zhì)比脫礦及天然牙本質(zhì)具有更高的HA晶體形成速率，且對(duì)培養(yǎng)的人牙髓干細(xì)胞表現(xiàn)出更好的細(xì)胞黏附和促分化能力。除此之外，脫蛋白可降低牙本質(zhì)的彈性模量與硬度，使其與現(xiàn)有的支架材料性能更加接近。但有學(xué)者認(rèn)為牙本質(zhì)脫蛋白后會(huì)失去生長(zhǎng)因子、NCPs等骨活性物質(zhì)，降低骨再生作用，因此該處理方法還有待進(jìn)一步研究[11]。

3.5 煮沸處理

煮沸法是基于高溫使酶失活的原理，使蛋白質(zhì)變性以降低牙本質(zhì)的免疫原性。Moharamzadeh等[35]將拔除的小牛牙齒制備成直徑5～10 mm的顆粒狀牙本質(zhì)，放置蒸餾水中煮沸2 h，再用異丙醇脫脂2 h去除殘留物質(zhì)，沖洗、烘干、消毒后植入牛的牙槽窩內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：煮沸處理的牙本質(zhì)能促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和活性，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸被新骨替代，具有良好的骨誘導(dǎo)能力，并且由于去除了抗原性物質(zhì)，所以生物相容性良好。

3.6 提取NCPs

牙本質(zhì)中NCPs含量豐富，可將其單獨(dú)提取后加工，得到生物活性物質(zhì)，用于與其他材料的交聯(lián)、改性等。NCPs作用多樣，不僅可調(diào)控和促進(jìn)OB的黏附、增殖與分化[36-37]，參與生物礦化HA成核階段[38]，引導(dǎo)未分化間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[39]，還可誘導(dǎo)人牙周膜干細(xì)胞的成骨向分化[40]。有學(xué)者[41]用溶解的DDM蛋白提取物培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)DDM可刺激細(xì)胞擴(kuò)張，抑制凋亡標(biāo)志物caspase 3的表達(dá)，上調(diào)細(xì)胞存活標(biāo)志物絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（serine/threonine-protein kinases，Akt1），并促進(jìn)細(xì)胞的礦化基質(zhì)沉積。綜合這些研究結(jié)果可見，NCPs被提取后可作為生物活性因子搭載至支架材料，在骨組織工程學(xué)中具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前對(duì)牙本質(zhì)處理采用最多的仍為脫礦處理，而對(duì)其他處理方式如煅燒、脫蛋白及煮沸處理等探討較少。未來應(yīng)繼續(xù)對(duì)牙本質(zhì)的加工工藝進(jìn)行探索，尋找新的處理方式，以最大程度地發(fā)揮其成骨潛力[11]。

4 牙本質(zhì)作為骨修復(fù)材料的臨床應(yīng)用

牙本質(zhì)促進(jìn)骨再生能力在許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已得到證實(shí)[42-44]，近年來多項(xiàng)臨床研究[45-50]表明：牙本質(zhì)作為骨替代材料在種植治療、引導(dǎo)骨再生、上頜竇提升、牙槽嵴提升等多項(xiàng)臨床治療中也取得了良好效果。Schwarz等[45]將自體牙本質(zhì)片用于牙槽嵴骨增量，術(shù)后24周發(fā)現(xiàn)牙槽嵴寬度增加了4.5 mm，且種植體穩(wěn)定性良好。Melek等[46]將患者自身拔除的前牙與前磨牙制成牙本質(zhì)顆粒即刻回植，術(shù)后3個(gè)月影像學(xué)觀察可見平均骨量增加23.47%，6個(gè)月后平均骨密度增加30%。一項(xiàng)包含38例患者的前瞻性研究[47]將牙本質(zhì)用于恢復(fù)水平或垂直牙槽骨高度，結(jié)果顯示傷口愈合良好，組織學(xué)檢查可見新骨形成。Kim等[48]對(duì)DDM植入種植體周圍的5個(gè)病例隨訪5年，發(fā)現(xiàn)在種植體周圍有皮質(zhì)骨及松質(zhì)骨形成且維持良好；將患者自體根部牙本質(zhì)制備成牙本質(zhì)塊，放置于種植體周圍骨缺損部位，術(shù)后觀察44個(gè)月，22例患者中18例均未出現(xiàn)種植體周圍邊緣骨喪失[49]。Minamizato等[50]采用DDM分別進(jìn)行牙槽窩保存術(shù)（7例）、牙槽嵴提升術(shù)（6例）和上頜竇底提升術(shù)（3例），隨訪結(jié)果顯示所有患者的植骨部位均愈合良好，無并發(fā)癥出現(xiàn)，表明牙本質(zhì)具有良好的成骨能力與生物相容性。

與現(xiàn)有骨修復(fù)材料相比，牙本質(zhì)也展現(xiàn)出相近甚至更優(yōu)的臨床療效。Kim等[51]為2組行上頜竇提升術(shù)的患者，分別同時(shí)植入牙本質(zhì)顆粒與人工骨粉，1年后發(fā)現(xiàn)2組上頜竇底到牙槽嵴頂之間的骨吸收量無明顯差異。Pang等[52]將Bio-Oss骨粉和DDM分別用于拔牙位點(diǎn)保存并植入種植體，結(jié)果顯示：2組垂直骨增量、術(shù)后種植體穩(wěn)定性均無明顯差異。吳崢嶸等[53]對(duì)下頜第一磨牙根分叉病變患者分別使用牙本質(zhì)顆粒聯(lián)合PRF及Bio-Oss骨粉作為骨修復(fù)材料，經(jīng)過1、6、12個(gè)月觀察，發(fā)現(xiàn)牙本質(zhì)顆粒組根分叉區(qū)骨密度優(yōu)于Bio-Oss骨粉組。還有研究[54-55]比較了自體牙本質(zhì)與骨移植“金標(biāo)準(zhǔn)”自體皮質(zhì)骨在骨增量中的效果，結(jié)果顯示2種材料的水平骨增量無明顯差異。

5 總結(jié)和展望

綜上，牙本質(zhì)作為骨修復(fù)材料具有良好的骨誘導(dǎo)性、骨傳導(dǎo)性與生物相容性，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與臨床應(yīng)用中均表現(xiàn)出良好的成骨效果。牙本質(zhì)的來源廣泛，加工簡(jiǎn)單，成本低廉，免疫原性較低，且與臨床常用的骨修復(fù)材料成骨效果相當(dāng)甚至更佳，應(yīng)用前景廣闊。但目前對(duì)牙本質(zhì)誘導(dǎo)成骨的具體機(jī)制尚不明確，且現(xiàn)有的牙本質(zhì)骨修復(fù)材料需經(jīng)過脫礦、消毒、研磨等一系列流程處理方可用于臨床，加工過程繁復(fù)，耗時(shí)較長(zhǎng)，在一定程度上限制了其應(yīng)用[56]。未來需進(jìn)一步深入研究牙本質(zhì)作為骨修復(fù)材料的成骨機(jī)制，并拓展其他處理方式，同時(shí)評(píng)估其成骨的長(zhǎng)期效果，以期早日廣泛應(yīng)用于臨床。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。